陳帥　任民　楊愛國

摘要：高品質(zhì)煙草品種培育是煙草育種的重要方面。隨著煙草基因組學(xué)的發(fā)展，煙草科研工作者在品質(zhì)等煙草復(fù)雜性狀基因挖掘和功能解析方面取得了一系列重要的原創(chuàng)性研究成果，為煙草生物育種和分子設(shè)計育種的開展儲備了大量基因資源。本文系統(tǒng)梳理了煙草多酚類物質(zhì)合成、腺毛分泌物、煙堿生物合成等3個方面的功能基因挖掘和調(diào)控機(jī)理解析方面的研究進(jìn)展，認(rèn)為利用多組學(xué)技術(shù)、基因編輯技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)等進(jìn)行基因挖掘和功能鑒定分析是今后研究的重要發(fā)展方向。針對目前煙草品質(zhì)育種存在的問題和不足，指出要深入開展種質(zhì)資源鑒定，加強(qiáng)功能基因的挖掘和研究，實(shí)現(xiàn)新型前沿技術(shù)突破，進(jìn)而為培育煙草香氣品質(zhì)突破性品種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草；品質(zhì)育種；基因挖掘；功能解析；研究進(jìn)展

中圖分類號： S572.03???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A???????? 文章編號：1007-5119（2023）03-0099-08

Advances in Discovery and Functional Analysis of Quality Related Genes in Tobacco

CHEN Shuai， REN Min， YANGAiguo

（Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： The cultivation of high quality tobacco varieties is an important aspect of tobacco breeding. With the development of tobacco genomics， tobacco researchers have made a series of important original research achievements in dissecting complex traits in tobacco， such as quality， providing numerous genetic resources for tobacco breeding. This review aims to summarize the progress of gene discovery and functional analysis of polyphenol metabolism， glandular trichome and nicotine biosynthesis in tobacco. It is considered that exploiting candidate genes by using multi-omics technology， conducting functional identification by gene editing technology and synthetic biology technology， are important development directions for future research. Moreover， it is pointed out that further and more depth research on germplasm resources， strengthening the exploration and research of functional genes， and making breakthroughs in new technologies， are necessary to resolve the problems and shortcomings in tobacco quality breeding.

Keywords： tobacco; quality breeding; gene discovery; function analysis; research progress

煙草是重要的模式植物和經(jīng)濟(jì)作物。煙草品質(zhì)是一個綜合概念，影響因素眾多，利用常規(guī)育種技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)突破。如何突破傳統(tǒng)遺傳育種技術(shù)的瓶頸，將煙草分子遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)的研究成果應(yīng)用于煙草品質(zhì)育種，實(shí)現(xiàn)更加高效和精準(zhǔn)的煙草生物育種，是煙草育種面臨的重要科學(xué)問題。煙草基因組計劃實(shí)施，在基因組水平上進(jìn)行了大規(guī)模的基因功能分析，為研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了空前的契機(jī)。

影響煙草品質(zhì)的致香物質(zhì)種類繁多，主要包括多酚類物質(zhì)、萜烯類物質(zhì)、生物堿類、糖脂類物質(zhì)等。結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的挖掘和功能分析，能夠?qū)煵菹銡庑誀钆c具體的功能基因聯(lián)系起來，實(shí)現(xiàn)從基因到香氣性狀的直接調(diào)控。依托豐富的煙草種質(zhì)資源和日新月異的現(xiàn)代生物技術(shù)手段，大量與煙草多酚類物質(zhì)合成、腺毛分泌物、煙堿生物合成相關(guān)的功能基因和調(diào)控基因被不斷地挖掘和解析，為利用基因手段改善煙草品質(zhì)提供重要的靶標(biāo)基因和理論基礎(chǔ)。本文系統(tǒng)總結(jié)了煙草多酚類物質(zhì)合成、腺毛分泌物、煙堿生物合成3個方面的功能基因及其調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展，為煙草品質(zhì)分子育種研究工作提供理論參考。

1 煙草多酚類物質(zhì)合成相關(guān)基因研究進(jìn)展

煙草多酚類物質(zhì)與煙草品質(zhì)密切相關(guān)，煙草燃吸時，多酚類物質(zhì)燃燒產(chǎn)生各種含有芳香氣味的成分，賦予煙氣清甜香和烤香特征。綠原酸、蕓香苷、莨菪亭是煙葉中主要的多酚類物質(zhì)，經(jīng)由植物苯丙烷代謝通路合成[1]。近年來，多酚合成代謝相關(guān)的一些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控蛋白等重要基因被陸續(xù)分離克隆，對多酚合成代謝機(jī)理研究和煙草分子育種工作產(chǎn)生了重要推動作用。

1.1 多酚合成相關(guān)基因

目前已從煙草中分離或克隆獲得多個參與多酚類物質(zhì)合成的結(jié)構(gòu)酶基因。PAL、C4H、4CL、CHS、 CHI、DFR、FLS、F3H、ANS 等結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)在煙草成功克隆并被證實(shí)在煙草多酚類物質(zhì)合成中發(fā)揮重要功能。陳帥等[2-3]從普通煙草中克隆到了7個 CHS 基因，過量表達(dá) NtCHS1基因引起綠原酸和蕓香苷含量顯著增加，而基因沉默后引起綠原酸和蕓香苷含量顯著降低，明確了 NtCHS1基因在調(diào)控綠原酸、蕓香苷合成中的重要功能。 Nishihara 等[4] 利用 RNAi 干擾技術(shù)將煙草 CHI 基因沉默，引起花青素合成減少，查爾酮合成增加，說明煙草 CHI 蛋白在查爾酮環(huán)化形成黃烷酮的過程中發(fā)揮重要作用。 NtDFR1和 NtDFR2基因沉默，引起煙草花青素含量顯著降低，花色變?yōu)闇\粉或白色，而黃酮醇含量顯著增加，說明 DFR 基因在花青素合成中發(fā)揮重要作用，同時也作為分支部位的關(guān)鍵酶調(diào)控不同類黃酮的合成[5]。Mahajan 等[6]將 FLS 基因沉默后，沉默轉(zhuǎn)基因株系槲皮素、花青素含量顯著降低，而兒茶酚、表兒茶酚、表沒食子兒茶素含量升高，花粉發(fā)育和萌發(fā)受阻。過量表達(dá) NtFLS2基因引起轉(zhuǎn)基因煙草蕓香苷含量增加[7]。Wang 等[8]鑒定到2個NtFLS基因、2個NtANS基因和4個NtF3H 基因，分析了其進(jìn)化關(guān)系和在類黃酮合成中的重要功能。 Jiao 等[9]利用代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析云煙87白花突變體挖掘參與花青素合成的功能基因，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)酶基因 CHI、DFR 、F3H、UFGTs 等基因的表達(dá)量在白花突變體中顯著下調(diào)表達(dá)，推測其可能在花青素合成中發(fā)揮功能。對不同花色的花煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析[10]，發(fā)現(xiàn) F3H、F3'5'H 和 DFR 基因在紅花和紫花煙草中較白花煙草顯著上調(diào)表達(dá)，而 FLS 顯著下調(diào)表達(dá)，與 HY5、MYB12、AN1和AN4同源的轉(zhuǎn)錄因子在不同花色煙草中也呈現(xiàn)出差異表達(dá)。Taguchi 等[11]克隆到一個?；D(zhuǎn)移酶基因 NtMaT1，抑制其表達(dá)會增加黃酮類物質(zhì)的丙二酰化和糖苷化。賈宏防等[12]對廣東、安徽和河南3個不同生態(tài)區(qū)的烤煙品種的類黃酮合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)區(qū)不同品種間關(guān)鍵酶基因 PAL 、 CHS 和 CHI 的表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)趨勢差異較大， C4L 和4CL 的表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)趨勢差異較小，說明PAL、 CHS 和 CHI，尤其是 CHI 基因在3個生態(tài)區(qū)濃香型烤煙類黃酮物質(zhì)形成中起關(guān)鍵作用。

1.2 多酚合成調(diào)控基因

煙草多酚類物質(zhì)生物合成代謝的調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控研究較為廣泛和深入，大量的轉(zhuǎn)錄因子被陸續(xù)克隆并證實(shí)在多酚合成代謝中發(fā)揮重要功能。 MYB 類轉(zhuǎn)錄因子、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子、AP2類轉(zhuǎn)錄因子、WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子等主要參與類黃酮合成代謝的調(diào)控[13-14]。上述轉(zhuǎn)錄因子形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控類黃酮合成代謝。研究發(fā)現(xiàn)，MYB-R2R3類轉(zhuǎn)錄因子 NtAn2在調(diào)控?zé)煵莼ㄇ嗨睾铣芍邪l(fā)揮重要作用，過表達(dá)或 RNAi 抑制表達(dá) NtAn2能夠引起轉(zhuǎn)基因煙草花中花青素的含量變化[15]。NtAn1a 和 NtAn1b 兩個bHLH轉(zhuǎn)錄因子能夠共同參與煙草花朵中花青素途徑的調(diào)節(jié)[16]。Chen 等[3]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子 NtMYB4能夠抑制 NtCHS1基因的表達(dá)水平，負(fù)調(diào)控類黃酮合成。Wang 等[17]克隆到兩個 NtMYB12轉(zhuǎn)錄因子 NtMYB12a 和 NtMYB12b，這兩個轉(zhuǎn)錄因子均參與類黃酮合成，其中 NtMYB12a 還能夠響應(yīng)蔗糖信號來抑制脂肪酸的積累。 Li 等[18]發(fā)現(xiàn) TTG2和 ARF8能夠形成復(fù)合體調(diào)控 ANS 和 DFR 基因的表達(dá)，在花青素合成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。 Wang 等[17]在普通煙草中克隆到4個 WRKY11轉(zhuǎn)錄因子，將 WRKY11b 基因沉默后黃酮醇的含量大幅降低，過表達(dá)后黃酮醇含量顯著升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， WRKY11b 能夠與 NtMYB12、NtFLS、NtGT5、NtUFGT的啟動子結(jié)合激活上述基因的表達(dá)[19]。 NtWRKY41a 能夠誘導(dǎo)NtCCoAOMT和NtHST基因轉(zhuǎn)錄、同時抑制 NtF6'H1和 NtGT3基因表達(dá)。 NtWRKY41a 過表達(dá)煙株煙葉綠原酸含量升高，類黃酮和莨菪亭含量則分別降低，而 NtWRKY41a 基因敲除材料煙葉綠原酸含量降低，類黃酮和莨菪亭含量分別升高[20]。

類黃酮合成的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控研究和報道相對較少。 Wang 等[21]克隆到一個煙草 F-box 蛋白 NtCOI1，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控花青素的合成。分析發(fā)現(xiàn) NtCOI1位于類黃酮調(diào)控因子 NtMYB305上游，利用 RNAi 干擾技術(shù)將 NtCOI1 沉默表達(dá)， NtMYB305的表達(dá)顯著下調(diào)，引起雄性不育、花青素合成受阻、茉莉酸不敏感等，并影響淀粉合成。苯丙氨酸合成酶（PAL）和查爾酮合成酶（CHS）能夠經(jīng)26S 蛋白酶復(fù)合體降解，揭示了苯丙氨酸和類黃酮合成的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控方式。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中， KFBPAL 、 KFBCHS （ Kelch domain-containing F-box protein）分別與 PAL、CHS 蛋白直接結(jié)合，介導(dǎo) PAL 和 CHS 蛋白的泛素化降解。 KFBPAL、KFBCHS 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)調(diào)控與植物體內(nèi) PAL 和 CHS 蛋白積累濃度呈負(fù)相關(guān)，與苯丙烷物質(zhì)以及花青素的積累呈負(fù)相關(guān)[22-24]。

目前，煙草多酚合成途徑涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，并不明晰。通過基因工程、突變體創(chuàng)制、基因編輯和合成生物學(xué)等手段調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可以創(chuàng)制不同多酚含量的梯度材料，準(zhǔn)確評估不同梯度多酚含量對煙草品質(zhì)的影響，從而明確多酚物質(zhì)在煙草品質(zhì)中的貢獻(xiàn)?；谀壳耙呀?jīng)挖掘鑒定的功能基因，鑒定與目標(biāo)基因同效等位基因，開發(fā)分子標(biāo)記，篩選優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料，為精準(zhǔn)鑒定種質(zhì)資源多酚性狀表型提供靶標(biāo)基因，同時為培育高含量多酚煙草提供遺傳材料。

2 煙草腺毛分泌代謝物相關(guān)基因研究進(jìn)展

煙草葉片的成熟度、煙葉的品質(zhì)、以及病蟲害抗性都和腺毛有著密切的關(guān)系[25]。調(diào)控?zé)熑~表面腺毛的密度及其主要代謝物的含量，有助于提高煙草抗逆性及煙葉品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，煙草表皮毛多數(shù)是有腺型腺毛，能產(chǎn)生多種次生代謝物質(zhì)，主要包括類西柏烷（單環(huán)）和類賴百當(dāng)二萜（雙環(huán)）、糖酯、表面蠟三大類[26]。其中二萜和糖酯是煙草腺毛分泌物中含量最豐富的兩大類物質(zhì)，對煙葉的香氣品質(zhì)具有重要影響。但目前對于煙草萜烯類、糖脂類合成途徑認(rèn)識、研究較少，合成途徑尚不明確，有待進(jìn)一步解析，嚴(yán)重影響了高萜烯類、高糖脂類煙草品質(zhì)育種的進(jìn)程。冷杉醇等二萜類物質(zhì)合成基因、糖脂合成基因的挖掘與克隆，為解析相應(yīng)合成途徑提供了重要的線索，同時為萜烯類、糖脂類煙草的分子育種和設(shè)計育種提供重要的靶標(biāo)基因和理論基礎(chǔ)。

2.1 腺毛發(fā)育相關(guān)基因

Liu 等[27]在本氏煙中克隆到一個 C2H2類轉(zhuǎn)錄因子NbGIS，研究發(fā)現(xiàn)NbGIS轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合 NbMYB123-like 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng) GA 信號正向調(diào)控腺毛分化，過量表達(dá)NbGIS會引起腺毛密度增加。將 NtabSPL6-1在煙草中過量表達(dá)引起轉(zhuǎn)基因材料腺毛密度增加[28]。Wu 等[29]在本氏煙中克隆到兩個轉(zhuǎn)錄因子Nbwo和 NbCycB2，Nbwo活性提高會增加煙草腺毛發(fā)育和腺毛密度，而 NbCycB2通過抑制Nbwo的表達(dá)活性負(fù)調(diào)控腺毛的發(fā)育。Choi 等[30]克隆到一個在長柄腺毛中特異表達(dá)的 NtLTP1基因，在腺頭的油脂分泌中發(fā)揮重要功能。 Wang 等[31]在煙草中克隆到一個 NtCycB2基因，敲除 NtCycB2能夠促進(jìn)長柄腺毛的發(fā)育，而過量表達(dá) NtCycB2則降低長柄腺毛的密度，但對其他類型腺毛沒有影響，說明 NtCycB2只影響長柄腺毛的發(fā)育。與野生型對照相比，NtCycB2過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草會分泌更多的二萜類化合物和糖脂，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的蚜蟲抗性。利用CRSPR/Cas9編輯技術(shù)敲除K326中的NtCycB2 基因，NtCycB2純合缺失突變體 HK326的長柄腺毛的腺毛密度和腺頭大小顯著增加，根系更加茂盛，細(xì)胞膜穩(wěn)定性增加，光合性能增加，鎘毒害耐受性顯著增強(qiáng)[32]。為研究腺毛特異表達(dá)基因的功能，煙草腺毛特異表達(dá)啟動子也被相繼克隆，如 CYP71D16[33]、pRbcS-T1和 pMALD1[34]。

2.2 二萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因

Sallaud等[35]從煙草中克隆NtCPS2和NtABS基因，發(fā)現(xiàn)這兩個基因都參與冷杉醇的合成。NtABS能夠?qū)tCPS2催化產(chǎn)生的8-羥基-柯巴基焦磷酸脂轉(zhuǎn)化為冷杉醇。分析 NtCPS2和NtABS在不同類型煙草中的序列多態(tài)性，NtABS的 cDNA 序列在157份含有和不含冷杉醇煙草中沒有差異，而 NtCPS2的cDNA 序列在含有和不含冷杉醇煙草中種質(zhì)中存在兩種類型的多態(tài)性，說明 NtCPS2在煙草冷杉醇合成中發(fā)揮主要功能。 NtCPS2敲除突變體冷杉純和賴百當(dāng)二醇的含量顯著減低。利用 NtCPS2基因的多態(tài)性，王國平等[36]設(shè)計開發(fā)了一套 SNP 功能標(biāo)記，能夠有效鑒定含冷杉醇的種質(zhì)資源。為進(jìn)一步挖掘冷杉醇合成基因，利用轉(zhuǎn)錄組測序分析 NtCPS2敲除突變體內(nèi)的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn) KSL4基因和編碼 ent-kaur-16-ene 合成酶的基因可能會參與冷杉醇的合成[37]。Wang 等[38]分離到一個腺毛特異表達(dá)的 P450羥化酶基因，抑制其表達(dá)的煙草腺毛中西柏三烯二醇（CBT-diol）含量降低41%，而前體物西柏三烯一醇（CBT-ol）的含量升高19%，蚜蟲抗性顯著增強(qiáng)。

2.3 糖脂合成相關(guān)基因

Chang 等[39]鑒定到一個參與煙草糖酯合成的新基因 NtALS1，NtALS1基因在煙草腺毛腺頭中特異表達(dá)，其蛋白主要在葉綠體中發(fā)揮功能，NtALS1 基因敲除后，突變體中糖酯含量顯著低于野生型對照，說明 NtALS1參與煙草腺毛中糖酯的合成。Feng 等[40]在本氏煙中克隆到兩個糖脂?；D(zhuǎn)移酶基因 ASAT1和 ASAT2，ASAT1敲除后本氏煙體內(nèi)糖脂含量顯著減低，而ASAT2敲除后完全檢測不到糖脂的存在，兩個敲除突變體葉片內(nèi)含水量降低，葉片溫度升高，蚜蟲和白粉虱在敲除突變體的存活率升高，推測 ASAT1和 ASAT2在糖脂合成、抗蚜蟲和抗白粉虱、以及抵御干旱脅迫中可能發(fā)揮重要作用。Chang 等[41]在普通煙草中克隆到兩個?；D(zhuǎn)移酶基因 NtASAT1/2，研究發(fā)現(xiàn) NtASAT1/2參與?；溑c糖環(huán)組裝，是糖脂合成的重要靶標(biāo)基因。

隨著相關(guān)重要靶標(biāo)基因的挖掘和克隆，煙草萜烯類和糖脂類合成代謝途徑逐漸被構(gòu)建，為利用基因工程、基因編輯等手段創(chuàng)制優(yōu)異品質(zhì)煙草遺傳材料以及利用合成生物學(xué)手段生產(chǎn)具有卷煙工業(yè)應(yīng)用和藥用價值的萜烯類物質(zhì)和糖脂提供了重要的靶基因。目前萜烯類和糖脂類代謝調(diào)控相關(guān)基因的研究相對較少，隨著合成代謝途徑的逐步解析，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析是未來研究的重點(diǎn)。

3 煙堿類物質(zhì)合成相關(guān)基因研究進(jìn)展煙草生物堿是煙草中重要的次生代謝物質(zhì)，主要包括煙堿、降煙堿、新煙堿和假木賊堿，具有獨(dú)特的毒性和藥理活性，可能在植物對草食動物和病原菌的化學(xué)防御中發(fā)揮作用[42]。煙堿是栽培煙草中含量最高的生物堿，約占總生物堿的90%以上[43]。煙堿在根部合成，經(jīng)木質(zhì)部運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)后在葉片細(xì)胞的液泡中大量積累。煙堿合成代謝途徑及其相關(guān)基因的研究比較明確，主要集中于煙堿合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化和代謝方面。

3.1 煙堿合成相關(guān)基因

腐胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）控制著代謝從初級代謝到次級代謝的轉(zhuǎn)變，是煙堿合成的關(guān)鍵酶。煙草中鑒定到5個NtPMT基因，NtPMT基因的表達(dá)水平與煙堿的積累顯著相關(guān)， RNAi 抑制NtPMT基因表達(dá)顯著降低了煙堿的含量，而新煙堿含量顯著積累[44-45]。煙草 N-甲基腐胺氧化酶 MPO 同時由兩個實(shí)驗室獨(dú)立克隆獲得，MPO 催化 N-甲基腐胺形成4-甲氨基丁醚，并通過自身環(huán)化形成 N-甲基-△-1-吡咯啉陽離子，隨后與提供吡啶環(huán)部分的煙酸衍生物發(fā)生縮合反應(yīng)形成煙堿[46-47]。Naconsie等[48]發(fā)現(xiàn) MPO 的同源基因 NtDAO1，比 MPO 有更高的 N-甲基腐胺催化效率。QPT 催化的酶促反應(yīng)是煙堿合成途徑中吡啶核苷酸循環(huán)途徑的限速步驟。煙草中有兩個 QPT 基因， QPT1和 QPT2，核苷酸同源性達(dá)94%。RNAi 抑制 QPT2基因的表達(dá)，導(dǎo)致煙堿水平下降10倍以上，說明 QPT2是煙堿合成途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，而 QPT1基因的表達(dá)不受茉莉酸、外源傷害等誘導(dǎo)，可能不參與煙堿的生物合成[49-50]。類異黃酮還原酶基因 A622、A662L 和 BBL 參與了吡咯烷環(huán)和吡啶環(huán)的結(jié)合產(chǎn)生煙堿。 RNAi 抑制 A622和NtBBL基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中煙堿含量均顯著降低[51-53]。

遺傳分析發(fā)現(xiàn)，煙堿合成的調(diào)控主要有兩個不連鎖的位點(diǎn)參與，分別是 NIC1和 NIC2位點(diǎn)[54]。通過對 nic1和 nic2低煙堿突變體研究發(fā)現(xiàn)，NIC1位點(diǎn)區(qū)域注釋到7個完整的轉(zhuǎn)錄因子（JRE5L2、ERF199、ERF91、ERF210、ERF29、ERF16和 ERF130）以及兩個缺失轉(zhuǎn)錄因子（ERF110和 ERF17L3△N）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， ERF199過量表達(dá)能夠顯著提高煙堿的積累，利用CRISPR/Cas9定點(diǎn)突變ERF199，獲得的純合突變體 WT-T1中幾乎檢測不到煙堿的合成，說明 ERF199是 NIC1位點(diǎn)唯一的煙堿合成主效基因[55]。NIC2位點(diǎn)有7個 ERF 轉(zhuǎn)錄因子（ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、 ERF17、ERF168、ERF199）存在，能夠激活幾乎全部參與煙堿合成的結(jié)構(gòu)基因，正向調(diào)控?zé)焿A的生物合成[56]。De Boer 等[57]鑒定到一個屬于 NIC2位點(diǎn)的 AP2/ERF 類轉(zhuǎn)錄因子 ORC1，受 JA 誘導(dǎo)調(diào)控?zé)焿A合成。 JA 誘導(dǎo)的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子能夠增加 ORC1的活性， ORC1和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄后水平受 MAPKK1介導(dǎo)的 JA 調(diào)控的磷酸化作用。 NtMYC2是參與煙堿合成的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。 NtMYC2可以通過結(jié)合煙堿合成關(guān)鍵基因PMT2和 QPT2基因的啟動子，激活 PMT2和 QPT2的表達(dá)，直接參與調(diào)控由茉莉酸誘導(dǎo)的煙堿合成。MYC2還通過與 NIC2位點(diǎn)的 ERF 轉(zhuǎn)錄因子啟動子區(qū)的 GCC-box 結(jié)合，間接激活煙堿的合成[58]。Todd 等[59] 通過構(gòu)建茉莉酸甲酯處理的本氏煙草cDNA 文庫結(jié)合 VIGS 技術(shù)，篩選到 NbbHLH3、NbARF1、 NbbHLH1、NbbHLH2、NbERF1、NbHB1可能參與調(diào)控茉莉酸介導(dǎo)的煙堿合成。 NtMYB305a 通過特異識別并結(jié)合 GAG 區(qū)段中的 AT-rich 元件，調(diào)控包括 PMT 基因在內(nèi)的多個尼古丁代謝通路基因的表達(dá)以及煙草植株中尼古丁的合成水平，并能夠與 G-box 結(jié)合蛋白 NtMYC2a 協(xié)同調(diào)控?zé)煵菽峁哦〉拇x[60]。此外，煙堿生物合成還可能受 MAPK 級聯(lián)的翻譯后水平調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，MAP 激酶 JAM1可能通過調(diào)節(jié) ERF221和 MYC2轉(zhuǎn)錄因子的茉莉酸依賴性轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)節(jié)煙堿生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[61]。

3.2 煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因

目前鑒定到的煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因主要有 NUP1基因和 MATE 基因，分別定位于質(zhì)膜和液泡膜。煙草尼古丁吸收透性酶NUP1負(fù)責(zé)將胞質(zhì)外的煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)內(nèi)，RNAi 抑制 NUP1表達(dá)的毛狀根中煙堿含量降低，而培養(yǎng)液中煙堿含量顯著增加，NUP1過量表達(dá)則抑制煙堿從根部到地上部的長距離運(yùn)輸[62-63]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NUP1位于 ERF189的上游，激活 ERF189的表達(dá)增強(qiáng)煙堿的生物合成，除運(yùn)輸煙堿外， NtNUP1還具有運(yùn)輸維生素 B6、吡哆醇、新煙堿的功能[64]。MATE 是一類新型二級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族，茉莉酸誘導(dǎo)煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 JAT1和 JAT2，是 MATE 家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，定位于煙草葉片細(xì)胞的液泡膜上，可以轉(zhuǎn)運(yùn)煙堿及假木賊堿，對煙堿在葉片中的分布發(fā)揮重要功能[65-66]。另外兩個煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MATE1和MATE2也在煙草中得到分離，MATE1和 MATE2蛋白也定位于煙草葉片細(xì)胞的液泡膜上，在生物堿由胞質(zhì)到液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[67]。

3.3 煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因

栽培煙草中煙堿在煙堿-N-去甲基化酶（NND）催化[68]作用下脫去甲基，實(shí)現(xiàn)煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致煙堿含量顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化反應(yīng)主要發(fā)生在成熟葉片中，并在煙葉烘烤過程中具有較高活性。煙草 CYP82E 亞族成員在參與煙堿轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要功能。目前已有多個煙堿-N-去甲基化酶的基因得到分離和鑒定， CYP82E 亞組成員的突變體可以有效抑制煙堿的去甲基化，顯著降低降煙堿含量。利用 RNAi 技術(shù)抑制 CYP82E4v1的表達(dá)，可以有效抑制衰老葉片的煙堿去甲基化，顯著降低降煙堿含量[69]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)亞甲基四氫葉酸還原酶 MTHFR1能夠抑制 CYP82E4基因的表達(dá)，進(jìn)而影響煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化[70]。CYP82E5v2和 CYP82E1與 CYP82E4v1具有較高同源性，但在不同組織部位中表達(dá)模式不同，主要負(fù)責(zé)非轉(zhuǎn)化植株中低水平降煙堿的合成[68，71]。與普通栽培煙草不同，在林煙草和絨毛狀煙草兩個祖先種中，降煙堿是主要的生物堿。 Chakrabarti 等[72]從林煙草中克隆到一個 CYP82E2基因，但該基因在普通煙草中存在兩個位點(diǎn)的突變，使其喪失了去甲基化活性，在現(xiàn)代普通煙草生物堿進(jìn)化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在煙草花中特異表達(dá)的 CYP82E21基因則來源于絨毛狀煙草，在煙草子房中行使煙堿-N-去甲基化酶（NND）的功能，催化煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化[73]。

4 展望

現(xiàn)代生物育種技術(shù)的不斷融合和創(chuàng)新發(fā)展，正在孕育和催生新一輪農(nóng)業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)革命[74]?；蚪M學(xué)的蓬勃發(fā)展為高效挖掘利用重要性狀相關(guān)優(yōu)良基因提供了有效途徑，在植物研究領(lǐng)域引發(fā)了一場世界性的“基因大戰(zhàn)”。與此同時，隨著新興前沿技術(shù)的不斷發(fā)展創(chuàng)新，以基因編輯、合成生物學(xué)等為代表的生物育種技術(shù)已成為國際育種的前沿和核心，正在蓬勃迅猛發(fā)展。新形勢下，要重視加強(qiáng)種質(zhì)資源的研究工作，實(shí)現(xiàn)新型前沿技術(shù)突破，培育煙草香氣品質(zhì)突破性品種。

（1）深入開展種質(zhì)資源鑒定和研究工作，挖掘重要性狀相關(guān)基因。

煙草種質(zhì)資源類型豐富，含有大量寶貴的基因資源。不同類型煙草材料間遺傳基礎(chǔ)差異大，代謝物差異廣泛，蘊(yùn)含大量的品質(zhì)形成關(guān)鍵基因，是挖掘鑒定特異代謝物及其調(diào)控基因的理想材料。特異煙草種質(zhì)，特別是野生煙、藥煙、香料煙、雪茄煙等與烤煙相比，往往具有獨(dú)特的品質(zhì)特性，蘊(yùn)含大量的品質(zhì)相關(guān)的代謝物和功能基因。今后應(yīng)加強(qiáng)對特異種質(zhì)的挖掘研究，整合表型組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，開發(fā)、完善種質(zhì)資源品質(zhì)相關(guān)性狀的精準(zhǔn)鑒定方法，利用分子標(biāo)記、基因芯片、高通量測序等技術(shù)深入開展種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，加強(qiáng)不同類型煙草品質(zhì)性狀深入研究，明確差異代謝物質(zhì)，挖掘解析煙草香氣品質(zhì)形成的關(guān)鍵基因或位點(diǎn)，解析基因功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為開展煙草生物育種儲備大量的基因資源。

（2）整合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和多組學(xué)技術(shù)，解析代謝物合成代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

煙草為異源四倍體，次生代謝途徑合成的結(jié)構(gòu)酶基因和調(diào)控基因普遍存在基因家族擴(kuò)張的情況，使煙草次生代謝物的合成代謝及調(diào)控非常復(fù)雜。目前研究較為系統(tǒng)的是煙堿和多酚類物質(zhì)合成代謝途徑，而對于萜烯類、糖脂類物質(zhì)的合成及代謝通路的解析仍處于合成酶鑒定階段，調(diào)控機(jī)制研究任重道遠(yuǎn)。整合基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)，開展分子生物學(xué)、計算生物學(xué)、分析化學(xué)等多領(lǐng)域合作是當(dāng)前品質(zhì)性狀重要基因挖掘研究利用的有效途徑。

（3）突破新興前沿技術(shù)，實(shí)現(xiàn)品質(zhì)性狀重要基因的精準(zhǔn)調(diào)控。

近年來，基因編輯、合成生物學(xué)等新興前沿技術(shù)的發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)煙草精準(zhǔn)高效的現(xiàn)代生物育種提供了新的技術(shù)保障。但基因編輯技術(shù)在栽培煙草和野生煙草中尚未實(shí)現(xiàn)突破。利用基因編輯技術(shù)和合成生物學(xué)，對品質(zhì)性狀關(guān)鍵基因進(jìn)行精準(zhǔn)高效編輯或合成，在微生物和煙草中重構(gòu)次生代謝物質(zhì)合成途徑，能夠突破傳統(tǒng)育種技術(shù)在復(fù)雜農(nóng)藝性狀方面的技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)煙草香氣品質(zhì)突破性品種的培育。

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