張?chǎng)┣纾飼?，馮振卿*

1南京醫(yī)科大學(xué)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)抗體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，江蘇 南京 211166

肺癌是死亡率最高的癌癥，每年約有160萬(wàn)人死于肺癌［1-2］。肺癌也是中國(guó)最常見且嚴(yán)重威脅人民健康的惡性腫瘤。最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)肺癌發(fā)病率為57.26/10萬(wàn)，病死率為45.87/10萬(wàn)［3］。肺癌按照病理類型可分為兩類：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC 是肺癌的主要病理類型，包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。

在過(guò)去10年中，免疫療法的成功極大改變了腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究和治療格局，以免疫檢查點(diǎn)阻斷為代表的免疫療法有著顯著的臨床反應(yīng)［4］。近年來(lái)針對(duì)程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death 1，PD1）/程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑（immune checkpoint blockade，ICB）在治療多種類型人類腫瘤方面取得了較好的臨床療效［5-6］，多種抗PD-1/PD-L1 抗體藥物已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于晚期NSCLC 患者的二線治療［7］。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）激酶反復(fù)突變以及間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合的發(fā)現(xiàn)，也給NSCLC患者的治療帶來(lái)了顯著變化［8-9］。雖然靶向治療改善了部分NSCLC患者的臨床預(yù)后，但其5 年生存率仍低于20%。對(duì)于無(wú)敏感基因突變的肺癌患者，靶向藥物療效不佳、預(yù)后不良，且耐藥性限制了這些藥物的臨床治療效果［10］。因此，尋找肺癌新的分子靶點(diǎn)、了解NSCLC的耐藥機(jī)制對(duì)于促進(jìn)腫瘤的免疫治療、改善患者的生存預(yù)后至關(guān)重要。

高通量單細(xì)胞RNA 測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析改變了以往人們對(duì)細(xì)胞研究的方式。細(xì)胞生活在一個(gè)動(dòng)態(tài)環(huán)境中，與周圍環(huán)境相互作用、相互影響。主成分分析（principal component analysis，PCA）可以識(shí)別已知和未知的細(xì)胞簇；在二維投影歸一化基因表達(dá)譜后，進(jìn)行細(xì)胞層次重建；以單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)推斷細(xì)胞特異性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合單細(xì)胞擬時(shí)序分析，從而可以在二維空間中聚類基因表達(dá)信息。scRNA-seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析有3個(gè)方向，分別為細(xì)胞類型鑒定、推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。近年來(lái)，scRNA-seq 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究，包括皮膚黑色素瘤［11］、NSCLC［12-13］、肝細(xì)胞癌［14-15］、基底細(xì)胞癌［16］、結(jié)直腸癌［17-18］和乳腺癌［19］等。這些研究全面描繪了腫瘤異質(zhì)性圖譜；發(fā)現(xiàn)了腫瘤免疫特征、不同的免疫抑制人群、較少定義的免疫細(xì)胞亞群以及腫瘤相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)；鑒定了驅(qū)動(dòng)耐藥性、預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和介導(dǎo)可塑性的細(xì)胞群等［20］。本文將scRNA-seq 在NSLCL中的應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 揭示NSCLC微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是腫瘤細(xì)胞與周圍組織、基質(zhì)細(xì)胞相互作用形成的一個(gè)復(fù)雜的綜合系統(tǒng)。腫瘤細(xì)胞與TME 內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞的相互作用不僅影響腫瘤的生長(zhǎng)，還影響腫瘤的侵襲和預(yù)后［21-22］。腫瘤細(xì)胞缺乏均一性，進(jìn)一步導(dǎo)致肺癌的靶向治療難度加大。scRNA-seg可以有效識(shí)別和描述TME 內(nèi)細(xì)胞的變化和特殊類型的細(xì)胞亞群，從而有助于改善腫瘤治療效果和評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)歸預(yù)后。

研究人員分別從拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）和基因表達(dá)譜（gene expression profile，GEP）兩個(gè)維度解析NSCLC 的異質(zhì)性，把肺腺癌（lung adencocarcinoma，LUAD）患者和肺鱗形細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinome，LUSC）患者分成LUADm（腺癌有突變）、LUADn（腺癌無(wú)突變）和LUSCn（鱗癌無(wú)突變）3組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LUSC患者的腫瘤細(xì)胞在降維分析后形成了多個(gè)特異性聚類，提示LUSC的癌細(xì)胞異質(zhì)性高于LUAD；此外免疫細(xì)胞在樣本中的差異也很大，LUAD 樣本顯示強(qiáng)烈的炎性微環(huán)境，T 細(xì)胞幾乎占50%。除此之外NSCLC的異質(zhì)性還體現(xiàn)在肺上皮細(xì)胞，肺上皮細(xì)胞聚類分析揭示了兩個(gè)不同的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（alveolar type 2 cell，AT2）簇，其中，相比AT2-2細(xì)胞，AT2-1細(xì)胞高表達(dá)CEACAM6、KITLG、FOXC1 等促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移的基因，意味著可向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化。研究還揭示了腫瘤異質(zhì)性與腫瘤中性粒細(xì)胞的相關(guān)性，細(xì)胞組成和腫瘤亞型的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在LUSC 中的浸潤(rùn)比例更高，且表現(xiàn)出一定的髓樣抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）特征，如表達(dá)人類多形核髓樣抑制細(xì)胞（polymorphonuclear MDSC，PMN-MDSC）的標(biāo)志物L(fēng)OX-1，體現(xiàn)了腫瘤浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞功能的多樣性和復(fù)雜性［23］。

腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophil，TAN）的增加與NSCLC的惡性進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)這一結(jié)論在其他肺癌研究中也得到證實(shí)，并提示中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)受腫瘤內(nèi)在驅(qū)動(dòng)機(jī)制調(diào)控。研究人員構(gòu)建了一種轉(zhuǎn)錄因子Sox2 過(guò)表達(dá)而腫瘤抑制因子Lkb1 丟失的NSCLC 小鼠模型（SL 小鼠），接著在SL 小鼠中敲除Nkx2-1 構(gòu)建SNL 小鼠，發(fā)現(xiàn)在SNL小鼠內(nèi)耗盡TAN可減少鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，這表明TAN與鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)［24-25］。既往研究顯示中性粒細(xì)胞多、瘤內(nèi)異質(zhì)性高這兩個(gè)因素是肺癌免疫治療效果不好的獨(dú)立指標(biāo)，中性粒細(xì)胞數(shù)量和腫瘤異質(zhì)性可能是肺癌免疫治療呈現(xiàn)差異的關(guān)鍵因素［26-27］。

Lambrechts等［28］利用scRNA-seq 驗(yàn)證了NSCLC基質(zhì)細(xì)胞之間存在很強(qiáng)的個(gè)體間差異，并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在內(nèi)的主要類型基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)的研究。通過(guò)對(duì)比癌和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的抗原呈遞和免疫細(xì)胞歸巢相關(guān)基因（如CCL2、CCL18、ICAM1）被下調(diào)，有助于形成腫瘤免疫耐受；癌組織中存在異于癌旁組織的成纖維細(xì)胞類型，表達(dá)獨(dú)特的膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)分子（如COL1A1 和COL4A1），進(jìn)一步對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)參與調(diào)控血管生成和肌生成的相關(guān)基因（如MEG2C、MYH11、ITGA7），揭示了TME內(nèi)成纖維細(xì)胞的功能特異性。

一些研究表明，TME中免疫細(xì)胞的類型、密度和位置在疾病進(jìn)展中起著核心作用［29-30］。Sharma等［31］分析了LUAD、癌旁組織和循環(huán)血液中不同免疫細(xì)胞譜系的分布，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中含有更多數(shù)量的免疫細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞包含所有主要的免疫細(xì)胞譜系，最為豐富的是淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，而NK 細(xì)胞的占比顯著降低。除此之外，還觀察到與CX3CL1趨化因子相關(guān)的單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。對(duì)來(lái)自14 例未接受治療的NSCLC患者的12 346 個(gè)T 細(xì)胞進(jìn)行深度scRNA-seq，進(jìn)一步揭示了T 細(xì)胞在肺癌中的變化，發(fā)現(xiàn)除了腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T 細(xì)胞經(jīng)歷衰竭之外，還確定了兩個(gè)可能處在衰竭前狀態(tài)的CD8+T細(xì)胞簇群，且與肺癌預(yù)后相關(guān)，高度“耗竭”T細(xì)胞由于其表觀遺傳變化對(duì)ICB 表現(xiàn)出耐藥性，而“預(yù)耗竭”T 細(xì)胞則與較好的預(yù)后相關(guān)；研究還觀察到腫瘤調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）的異質(zhì)性，其特征在于TNFRSF9 的雙峰分布，IL1R2 表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤Treg 激活與NSCLC 的預(yù)后不良相關(guān)［13］。這些研究詳細(xì)描述了TME 內(nèi)細(xì)胞的變化，將有助于進(jìn)一步了解NSCLC中TME內(nèi)細(xì)胞的功能狀態(tài)和動(dòng)力學(xué)，更好地實(shí)現(xiàn)腫瘤分層和精準(zhǔn)治療。

2 發(fā)現(xiàn)新的NSCLC相關(guān)基因和信號(hào)通路

NSCLC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未明確，scRNA-seq可以鑒定出在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的異?；蚝托盘?hào)通路，為靶向治療藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。EGFR基因突變是NSCLC最常見的突變基因，檢出率高達(dá)51.33%［32］，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是EGFR 突變晚期NSCLC 的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，然而由于EGFR 突變的晚期NSCLC 具有高度異質(zhì)性，往往存在1 種基因以上的共突變，可通過(guò)多重分子機(jī)制促進(jìn)耐藥腫瘤細(xì)胞克隆增殖，導(dǎo)致臨床治療效果不佳。研究人員通過(guò)對(duì)最初存在和不存在EGFR突變的肺癌細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行基因組分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤患者晚期階段都產(chǎn)生了EGFR突變。然后進(jìn)一步定義了阻礙EGFR 抑制劑反應(yīng)的新途徑，包括Wnt/βcatenin 信號(hào)通路改變和細(xì)胞周期基因CDK4、CDK6的突變［33］。在NSCLC中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生和細(xì)胞損傷后的再生有關(guān)，因此，Wnt/βcatenin通路可能作為肺癌免疫治療的靶點(diǎn)［34-35］。除此之外，研究人員對(duì)分別帶有EGFR、KRAS 和多個(gè)致癌驅(qū)動(dòng)突變的3 例NSCLC 患者腫瘤樣本進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)帶有EGFR突變患者癌細(xì)胞簇的特征是NPC2 和表面活性劑基因（SFTPB、SFTPC、SFTPD）高表達(dá)；且成纖維細(xì)胞與其他2例患者的成纖維細(xì)胞相比，含有富含亮氨酸的小分子蛋白多糖（small leucine rich proteoglycan，SLRP）家族和絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin F1）的成員，表明這些成纖維細(xì)胞可能通過(guò)激活Wnt 信號(hào)通路等方式參與AT2 細(xì)胞衍生為癌細(xì)胞的過(guò)程，為NSCLC的治療提供了新的研究方向［36］。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）在NSCLC進(jìn)展中具有重要作用，scRNAseq發(fā)現(xiàn)在M2 樣TAM中，mincle 基因高表達(dá)；敲除mincle 基因之后可觀察到M1 樣TAM 占比顯著增加；過(guò)繼轉(zhuǎn)移mincle 基因沉默的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞可顯著抑制腫瘤進(jìn)展，以上研究結(jié)果表明TAM中mincle 基因可作為NSCLC 治療的潛在分子靶點(diǎn)［37］。Sinjab等［38］對(duì)早期LUAD scRNA-seq樣本進(jìn)行互作分析，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)蛋白CD24 與巨噬細(xì)胞的SIGLEC10以及樹突狀細(xì)胞的HAVCR2之間的相互作用增加，進(jìn)一步分析CD24基因，發(fā)現(xiàn)其在正常肺組織、肺部非典型腺瘤樣增生和肺腫瘤中表達(dá)逐漸增加，且與促腫瘤和免疫抑制相關(guān)基因（如TIGIT、CTLA4、FOXP3）的表達(dá)呈正相關(guān)，而與抗腫瘤免疫標(biāo)志物（如GZMB、GZMH、PRF1）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；CRISPR 技術(shù)敲除CD24或使用CD24中和抗體后，小鼠LUAD細(xì)胞的生長(zhǎng)被顯著抑制，因此CD24可能作為L(zhǎng)UAD免疫治療的一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。

3 用于NSCLC代謝組學(xué)研究

機(jī)體細(xì)胞正常的新陳代謝包括合成與分解代謝，其中包含糖類、脂類、氨基酸等各種代謝通路，它們通過(guò)產(chǎn)生能量、完成生物合成分解來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。然而在腫瘤形成前期，這些細(xì)胞的代謝相關(guān)基因可被重新編程，導(dǎo)致其克隆性異常增生，逐步發(fā)展為腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)其增殖［39］。

早期發(fā)現(xiàn)NSCLC是提高患者生存率的關(guān)鍵，目前尚無(wú)可靠的血液檢測(cè)指標(biāo)用于早期NSCLC 的診斷，研究人員對(duì)5 例早期NSCLC 患者的組織樣本進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝在不同細(xì)胞類型中廣泛失調(diào)。通過(guò)分析腫瘤細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞間的差異基因，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞下調(diào)的基因主要富集在脂代謝相關(guān)途徑。對(duì)聚類得到的9種上皮細(xì)胞分別進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與正常上皮細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中甘油三酯代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸合成和不飽和脂肪酸合成等多條代謝通路均發(fā)生異常變化，其中甘油三酯和甘油磷脂代謝相關(guān)基因在早期肺癌患者的多種類型細(xì)胞中下調(diào)，并最終確定了9種脂質(zhì)，包含3 種溶血磷脂酰膽堿、5 種磷脂酰膽堿和1 種甘油三酯，作為早期肺癌檢測(cè)的指標(biāo)，這可能使NSCLC患者獲益于早期診斷，進(jìn)而提高NSCLC患者的生存率［40］。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）可用來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)、評(píng)估治療效果，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)個(gè)體治療。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）作為一個(gè)與腫瘤Warburg 效應(yīng)密切相關(guān)的酶，可用于檢測(cè)血液中高糖酵解活性的腫瘤細(xì)胞。這一標(biāo)志物與血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）聯(lián)合檢測(cè)可大幅提升Ⅲ/Ⅳ期NSCLC 患者外周血中CTC 的檢出率，其原因在于新標(biāo)志物能夠發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者血液中廣泛存在的之前被忽略的CK 陰性CTC。scRNA-seq表明CK 陰性CTC 與CK 陽(yáng)性CTC 有相同的全基因組拷貝數(shù)變異譜，揭示它們具有相同的起源［41］。

還有學(xué)者構(gòu)建了一個(gè)基于鐵死亡相關(guān)基因的肺癌預(yù)后模型，同時(shí)評(píng)估了預(yù)后模型的性能。通過(guò)癌組織和癌旁組織之間的差異分析，獲得6 497 個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），并將 這些DEG 與NCBI 和KEGG 數(shù)據(jù) 庫(kù)中1 164 個(gè)鐵死亡相關(guān)基因的共同基因確定為候選鐵死亡相關(guān)基因，然后通過(guò)單因素COX 分析篩選出283 個(gè)候選模型鐵死亡相關(guān)基因，最終確定了21個(gè)與患者預(yù)后顯著相關(guān)的鐵死亡相關(guān)基因，用于預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的建立。接著通過(guò)ROC曲線分析、PCA分析等驗(yàn)證了該模型具有良好的預(yù)測(cè)能力，可以準(zhǔn)確地區(qū)分高危和低危人群，且與預(yù)后相關(guān)的基因（如CAV1、CDC25C、CHEK2、DKK1、E2E7）可作為NSCLC 患者總生存時(shí)間獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)［42］。

4 揭示NSCLC耐藥分子機(jī)制

ICB的出現(xiàn)使NSCLC的治療策略轉(zhuǎn)向以基因改變引導(dǎo)的靶向治療，如EGFR-TKI 阿法替尼和奧西美替尼以及ALK 抑制劑阿列替尼、克唑替尼的使用，使肺癌的臨床治療效果得到了顯著改善。同時(shí)腫瘤耐藥性的出現(xiàn)已成為臨床治療面臨的重大挑戰(zhàn)，新的治療策略或藥物在提高患者生存率方面的需求尚未得到滿足。

Aissa等［36］在研究NSCLC 患者對(duì)TKI 產(chǎn)生耐藥的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)靶向藥物治療之后，腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)亞型和細(xì)胞周期均發(fā)生了變化；不同用藥手段有利于抗性基因，如MAPK 級(jí)聯(lián)激活，CALD1、CCDC80、TPM1、TACSTD2 恢復(fù)表達(dá)等，意味著這種藥物誘導(dǎo)的耐藥其實(shí)是可逆的；同時(shí)在不同NSCLC細(xì)胞系中均觀察到抗凋亡基因、NF-κB 和MAPK 通路在早期耐藥細(xì)胞中激活，提示在不同肺癌細(xì)胞系中早期耐藥基因表達(dá)有一定的共性，選擇合適的以及合理使用靶向藥物可能通過(guò)下調(diào)特定的細(xì)胞存活機(jī)制來(lái)減緩腫瘤細(xì)胞群的耐藥性。除此之外，Kashima等［43］通過(guò)對(duì)肺癌組織樣本和EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞模型的scRNA-seq 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除AURKA、VIM 和AXL 等已知耐藥基因之外，CD74 在EGFRTKI 耐藥中也發(fā)揮了重要作用，其上調(diào)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的耐藥性并抑制細(xì)胞凋亡。研究者還發(fā)現(xiàn)TME 中的巨噬細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞表達(dá)的表皮調(diào)節(jié)素可誘發(fā)EGFR-TKI 耐藥，提示TME 的細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用也是誘發(fā)耐藥的重要因素之一［44］。

順鉑（CDDP）和培美曲塞（PEM）聯(lián)合化療是LUAD 的主要治療方案之一，然而藥物抗性的出現(xiàn)極大地限制了其治療效果。研究人員發(fā)現(xiàn)miR-6077 為L(zhǎng)UAD 中CDDP/PEM 抗性的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。對(duì)接受CDDP/PEM聯(lián)合治療的LUAD患者樣本進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)CDDP/PEM 可誘導(dǎo)cdkn1 和keap1上調(diào)，實(shí)驗(yàn)證明miR-6077 可以通過(guò)cdkn1a-cdk1 介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和keap1-nrf2-slc7a11/nqo1 介導(dǎo)鐵死亡，保護(hù)LUAD 細(xì)胞免受CDDP/PEM 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而在體外和體內(nèi)導(dǎo)致LUAD細(xì)胞的耐藥，這一發(fā)現(xiàn)為克服LUAD的耐藥性提供了一個(gè)新的治療策略［45］。

5 用于NSCLC預(yù)后分析與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

NSCLC 患者的生存預(yù)后問(wèn)題是患者和家屬關(guān)注的最主要問(wèn)題，由于腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致進(jìn)行精準(zhǔn)的預(yù)后評(píng)估有一定難度。研究人員選取18例LUAD患者的癌組織、癌旁組織和血液樣本進(jìn)行scRNAseq，研究發(fā)現(xiàn)I期腫瘤就可以使得T細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)生顯著改變，T 細(xì)胞在TME 中的比例更高，NK 細(xì)胞的比例則顯著降低，提示不良預(yù)后。此外還建立了早期未治療LUAD 的免疫細(xì)胞圖譜，揭示在早期病變中富含PPARγhiCD64hiCD14hiPPARγhiIL-6hi巨噬細(xì)胞、CD1C陽(yáng)性單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和顆粒酶B陽(yáng)性效應(yīng)細(xì)胞，這些細(xì)胞同時(shí)存在于免疫微環(huán)境中，與患者預(yù)后相關(guān)。PPARγhiCD64hiCD14hiPPARγhiIL-6hi巨噬細(xì)胞和細(xì)胞顆粒酶B陽(yáng)性效應(yīng)細(xì)胞顯著減少的患者有明顯的生存劣勢(shì)［12］。

Maynard等［46］選取了靶向藥物治療前、治療過(guò)程中腫瘤控制期、進(jìn)展期3 種LUAD 樣本進(jìn)行scRNA-seq，首先分析了所有樣本突變率與總生存期之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)突變率低總是與總生存期長(zhǎng)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)3組樣本細(xì)胞存在的共同特征是腫瘤細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶信號(hào)保持著持續(xù)激活狀態(tài)，包括常見的EGFR家族，該生長(zhǎng)信號(hào)是維持細(xì)胞持續(xù)增殖的驅(qū)動(dòng)因素，貫穿著腫瘤治療的全過(guò)程。接著針對(duì)進(jìn)展期組細(xì)胞進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)該組存在3 種特殊的細(xì)胞亞群，分別是高表達(dá)犬尿氨酸通路的腫瘤細(xì)胞、IDO1+巨噬細(xì)胞和高表達(dá)細(xì)胞通訊基因（GJB2、GJB3、GJB5）的腫瘤細(xì)胞，這3種細(xì)胞群的特征均與較差的預(yù)后相關(guān)。腫瘤控制期組呈現(xiàn)較好的預(yù)后趨勢(shì)，與治療前組和進(jìn)展期組的差異顯著，其腫瘤細(xì)胞高表達(dá)肺泡信號(hào)相關(guān)基因，其中多個(gè)基因的高表達(dá)提示預(yù)后更好。通過(guò)組間對(duì)比，在腫瘤控制期組的AT2中發(fā)現(xiàn)NKX2-1特異性高表達(dá)，這或許可以作為肺癌預(yù)后較好的標(biāo)志物［46］。

腫瘤風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的工具。研究人員使用scRNA-seq 檢測(cè)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了腫瘤風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)較低免疫浸潤(rùn)、P53 信號(hào)通路和Treg 細(xì)胞的激活是預(yù)后差的原因。此外，此模型還具有預(yù)測(cè)免疫治療效果的功能［47］。還有一些研究人員通過(guò)scRNA-seq探究腫瘤細(xì)胞干性指數(shù)及干性相關(guān)基因與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)癌組織的干性指數(shù)高于癌旁組織，且干性指數(shù)與腫瘤分期呈正相關(guān)。另外，還發(fā)現(xiàn)并鑒定了CCNA2、CCNB1、FEN1、SPAG5 等15 個(gè)干性相關(guān)基因，其過(guò)表達(dá)與腫瘤組織中較少的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，這些基因具有成為預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的潛力［48-49］。

6 小結(jié)和展望

scRNA-seq 從生命活動(dòng)的基本功能單位——單細(xì)胞的維度幫助剖析復(fù)雜的TME，給實(shí)體瘤研究提供了新的思路。scRNA-seq可以精準(zhǔn)捕獲肺癌異質(zhì)性和TME內(nèi)豐富的生物信息，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因和信號(hào)通路，從而幫助研究人員更深入地了解肺癌的發(fā)生發(fā)展和治療耐藥的關(guān)鍵生物學(xué)機(jī)制，有助于指導(dǎo)臨床上對(duì)肺癌的早期診斷、靶向治療、療效監(jiān)測(cè)與預(yù)后評(píng)估。未來(lái)通過(guò)對(duì)NSCLC 單細(xì)胞數(shù)據(jù)的深入挖掘，可以探索更多新的治療靶點(diǎn)以及療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物等，更好地實(shí)現(xiàn)患者分層，同時(shí)也為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的過(guò)程管理和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供可能。相信隨著研究隊(duì)列的逐漸擴(kuò)大和循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的不斷積累，scRNA-seq 必將為肺癌的精準(zhǔn)治療打開新篇章。