李 崢，郭金昊，劉鑫鑫，張明海

（東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護地學(xué)院，哈爾濱，150040）

由于人類活動和自然環(huán)境變化，野生動物的生存面臨諸多威脅，如棲息地喪失、生境破碎化等嚴(yán)重威脅著野生動物的擴散和繁衍［1］，甚至導(dǎo)致種群近交風(fēng)險上升、遺傳多樣性喪失，從而使種群對環(huán)境變化的響應(yīng)及適應(yīng)能力下降［2］。遺傳多樣性水平往往與種群的穩(wěn)定和健康息息相關(guān)，遺傳變異水平較高的種群對環(huán)境變化的適應(yīng)能力更強，即使在種群數(shù)量下降后仍具備很強的恢復(fù)潛力［3］。遺傳多樣性水平的高低是衡量種群健康狀況的重要依據(jù)，是進行種群管理與保護決策的重要工具之一［4］。

東北馬鹿（Cervus elaphus xanthopygus）是我國北方森林生態(tài)系統(tǒng)中具有代表性的有蹄類動物，在維持森林和草原生態(tài)系統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，曾廣泛分布于黑龍江省大小興安嶺、完達(dá)山、老爺嶺及張廣才嶺，吉林省長白山地區(qū)，大興安嶺南麓內(nèi)蒙古和河北省森林—草原過渡帶地區(qū)［5-9］。然而由于非法盜獵、森林資源過度利用以及自然環(huán)境變化，許多生境逐漸不適合馬鹿的生存與活動，由此導(dǎo)致野生種群數(shù)量下降，分布區(qū)退縮，部分地區(qū)馬鹿種群甚至出現(xiàn)斑塊化分布，近親繁殖、遺傳多樣性喪失的風(fēng)險日益增大［10-11］。

大興安嶺南麓高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)（以下簡稱“高格斯臺保護區(qū)”）是我國重要的馬鹿分布區(qū)，馬鹿平均密度為1.11只/km2，是目前野生馬鹿種群密度最高的地區(qū)［12-13］，對野生馬鹿種群的恢復(fù)和歷史分布區(qū)的重建具有重要意義。因此，本研究通過分子糞便學(xué)技術(shù)對分布在高格斯臺保護區(qū)內(nèi)的馬鹿進行遺傳學(xué)研究，評估馬鹿種群遺傳多樣性現(xiàn)狀，為馬鹿種群保護及健康狀況監(jiān)測等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品均來自高格斯臺保護區(qū)，保護區(qū)隸屬于內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗。2021年12月—2022年1月，根據(jù)馬鹿在保護區(qū)的分布現(xiàn)狀，確定采樣區(qū)域（圖1）。選擇樣線調(diào)查法跟蹤馬鹿新鮮足跡鏈，并收集馬鹿新鮮糞便，同時GPS 定位。共采集新鮮糞便樣品 246 份，肌肉對照樣品1 份（來自野外發(fā)現(xiàn)的自然死亡雌性馬鹿個體）。所有樣品放置在超低溫冰箱-80 ℃保存。

圖1 馬鹿糞便采樣點示意圖（內(nèi)蒙古高格斯臺保護區(qū)）Fig.1 Fecal sample collection sites of red deer（Gaogesitai Reserve in Inner Mongolia）

1.2 DNA提取及物種鑒定

糞便DNA 提取使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Germany），按操作說明進行。選擇mtDNACyt b引物［14-15］，L14724：5′-CGAGATCTGAAAAACCATCGTTG-3′；H15149：5′-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3′用于糞便DNA 的PCR 擴增（400～500 bp）。擴增體系20 μL：2×RapidTaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L Forward Primer 0.8 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL，25～50 ng/μL DNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存，每次擴增均用肌肉DNA 作陽性對照。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增結(jié)果后，將含有目的條帶的擴增產(chǎn)物進行純化并雙向測序。所得序列使用DNAStar 軟件進行正反序列的拼接、比對和校正。最后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源比對，以確定糞便的物種來源。

1.3 個體識別

根據(jù)東北馬鹿已有研究結(jié)果，選取9 對微衛(wèi)星引物（ETH225、T501、T156、BM848、T530、C143、DM45、N、T507［16］）用于東北馬鹿個體識別。所有引物合成時，上游引物5′端均進行熒光標(biāo)記（Fam、Hex、Tamra或Rox），下游引物不標(biāo)記（表1）。擴增體系20 μL：2×RapidTaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L Forward Primer 0.8 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL，25～50 ng/μL DNA 6 μL，ddH2O 2.4 μL。反應(yīng)條件同物種鑒定方法。采用多管PCR 擴增法，對每個位點進行3～7 次重復(fù)的陽性PCR，得到的產(chǎn)物使用ABI 3730XL 測序儀（Applied Biosystems Inc.，America）進行基因掃描和判讀等位基因大小。使用軟件Excel mircosatellite tool kit 尋找數(shù)據(jù)中相匹配的基因型［17］。判斷不同樣品屬于同一個體的依據(jù)是：所有位點上的基因型均相同，或只有1個位點的1個等位基因不同［18］。

表1 用于東北馬鹿個體識別的9對微衛(wèi)星引物信息Tab.1 Details of nine microsatellite loci used for red deer individual identification

1.4 性別鑒定

性別鑒定使用SRY12 和BMC1009 兩對引物對糞便DNA 進行復(fù)合擴增，其中引物SRY12 擴增Y 染色體中的SRY 區(qū)域片段，引物BMC1009 擴增常染色體微衛(wèi)星位點，作為反應(yīng)的陽性對照［19-20］。使用SRY 引物對所有樣本再次單獨擴增，以避免因引物間互相干擾造成的擴增失?。ū?）。根據(jù)PCR 結(jié)果中條帶的出現(xiàn)情況對東北馬鹿的性別進行判別。

表2 東北馬鹿性別鑒定引物信息Tab.2 Gender primer sequences of red deer

1.5 遺傳數(shù)據(jù)分析

對于mtDNA 序列，使用軟件DnaSP 6.12 分別計算變異位點數(shù)（variable sites，S）、單倍型數(shù)量（number of haplotypes，H）、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）和核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）［21］。

對于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)，使用GenAlEx 6.5將等位基因數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為分析軟件所需的各種格式，并計算等位基因數(shù)（number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective allele number，Ne）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）和期望雜合度（expected heterozygosity，He）［22］。應(yīng)用Cervus 3.0 計算微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量（polymorphism information contents，PIC）；使用GIMLET 1.3.3［23］計算9 個微衛(wèi)星位點的聯(lián)合PID值，即無親緣關(guān)系或同胞個體之間具有相同基因型的概率；使用Microchecker 2.2.0.3［24］檢測微衛(wèi)星位點是否存在無效等位基因（null allele）。使用GENEPOP 4.0［25］測算總體和每個位點是否偏離哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），同時檢驗各位點間連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），LD 和HWE 檢驗通過馬爾科夫鏈法（Markov chain method）生成p值，并使用Bonferroni法對顯著性進行校正［26］。

2 結(jié)果

2.1 物種鑒定及個體識別

共采集糞便樣品246 份，其中成功提取DNA 樣品222 份，樣品利用率為90.24%。222 份樣品成功擴增Cyt b基因，擴增產(chǎn)物為424 bp。序列經(jīng)過正反拼接、校正及Blast 比對后，最終鑒定出209 份馬鹿DNA樣本。

GIMLET 分析結(jié)果顯示，9 個微衛(wèi)星位點的聯(lián)合Prod（unbias）為6.398×10-10，即使出現(xiàn)雙胞胎，誤判概率Prod（sibs）只有0.047 3%。當(dāng)2 個多態(tài)性最高的位點擴增失敗時，Prod（sibs）增加到0.460 0%，仍小于1.000 0%（圖2）。因此，9個微衛(wèi)星位點中至少有7 個位點擴增成功才可用于后續(xù)分析。209 份馬鹿樣品中獲得了203 個成功擴增的微衛(wèi)星樣本，基因分型利用率為97.13%。基于9 個微衛(wèi)星位點，同時結(jié)合線粒體和性別鑒定結(jié)果，個體識別結(jié)果顯示 203份馬鹿糞便樣本屬于182只不同的馬鹿個體。

圖2 9個微衛(wèi)星位點按照pID順序的個體基因型相似概率曲線Fig.2 Probability of identity（pID）curve generated by nine microsatellite loci

根據(jù)擴增結(jié)果，最終在182 只馬鹿個體中鑒定出雌性馬鹿125 只，雄性馬鹿57 只，雌雄性比為2.19∶1。

2.2 基于mtDNA的遺傳多樣性

182 條Cytb序列（424 bp）共檢出5 個變異位點，包括4個轉(zhuǎn)換位點和1個顛換位點（C/A，350 bp處），未發(fā)現(xiàn)插入或缺失位點。5個變異位點中，單一變異位點2 個（128、367 bp），簡約信息位點3 個（250、295、350 bp）。（G+C）整體含量較低，為37.8%，存在AT偏倚性，符合脊椎動物線粒體堿基的組成特點。

182 條序列共測定3 個單倍型，分布頻率分別為78.0%、21.4%和0.5%，研究地區(qū)整體單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為（0.347±0.035），核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）為（0.248±0.025）%。

2.3 基于微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性

根據(jù)多態(tài)信息含量（PIC）對9 個擴增位點進行篩選。當(dāng)PIC＜0.250 時，認(rèn)為多態(tài)性較低，故舍去C143位點。最終選擇8 個高度多態(tài)位點（PIC＞0.500）的擴增數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析（表3）。各位點檢測結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)無效等位基因及等位基因丟失等情況，說明基因分型結(jié)果可靠，可用于后續(xù)分析。

表3 8個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity indicators for the eight microsatellite loci

Hardy-Weinberg 平衡檢測結(jié)果顯示，研究地區(qū)整體水平顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，但固定系數(shù)為負(fù)值（Fis=-0.062），證明不存在無效等位基因或近交的影響。連鎖不平衡分析結(jié)果顯示8 個位點間不存在連鎖不平衡，可進行后續(xù)種群遺傳學(xué)分析。

研究區(qū)域整體種群平均等位基因數(shù)（Na）為（7.40±0.47）；平均有效等位基因數(shù)（Ne）為（4.40±0.30），有效等位基因與等位基因數(shù)二者差異顯著（p＜0.01）。等位基因豐富度（AR）為4.537；平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.691。平均期望雜合度（He）為（0.729±0.016）；平均觀測雜合度（No）為（0.768±0.029），觀測雜合度與期望雜合度之間存在差異（p＜0.05）。

3 討論

野生動物的性比既是估計物種生存力的重要指標(biāo)，又是描述種群結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，深入了解珍稀瀕危野生動物的性比對制定保護與管理策略具有重要指導(dǎo)意義［27］。本研究表明，大興安嶺南麓森林—草原過渡帶馬鹿種群雌雄性比為2.19∶1，與楊淼［28］和張沼等［29］對內(nèi)蒙古地區(qū)馬鹿的研究結(jié)果一致，均顯示雌性高于雄性，符合馬鹿一雄多雌的交配體制。

本研究選擇線粒體與核微衛(wèi)星2 種分子標(biāo)記，從不同角度對種群遺傳多樣性狀況進行評價。單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（Pi）是衡量線粒體DNA 多樣性水平的重要參數(shù)［30］。已有學(xué)者利用線粒體Cytb基因?qū)︸R鹿部分亞種進行遺傳多樣性研究，如劉鑫鑫［31］研究表明東北地區(qū)的馬鹿野生群體單倍型多樣性較高（Hd=0.586），核苷酸多樣性相對較低（Pi=0.305%）；劉艷華等［32］研究表明西藏東南部分布的西藏馬鹿（Cervus elaphus wallichi）整體遺傳多樣性較高（Hd=0.897，Pi=2.781%）；塔依爾江·麥麥提等［33］發(fā)現(xiàn)塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）3 個地理種群的遺傳多樣性不平衡（Hd=0.845，Pi=1.500%）。本研究在182 只馬鹿個體中發(fā)現(xiàn)3 個單倍型，單倍型多樣性（0.347）和核苷酸多樣性（0.248%）均低于西藏馬鹿、塔里木馬鹿及分布在黑龍江和吉林地區(qū)的馬鹿。根據(jù)對比國內(nèi)其他馬鹿亞種基于線粒體Cyt b基因的研究結(jié)果（表4），結(jié)合種群遺傳多樣性水平的判定標(biāo)準(zhǔn)（Hd≥0.500，Pi≥0.500%）［34-35］，研究地區(qū)東北馬鹿線粒體DNA 多樣性水平處于中等偏低水平。

表4 中國馬鹿種群遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 Comparison of genetic diversity of red deer populations in China

微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量（PIC）是衡量遺傳標(biāo)記所提供信息含量的參數(shù)，根據(jù)Botstein等［43］提出的多態(tài)信息含量標(biāo)準(zhǔn)，本研究選擇的9 個微衛(wèi)星位點中僅有C143 位點PIC=0.180＜0.250，表明C143 位點提供的遺傳信息相對匱乏，故最終確定其他8 個高度多態(tài)位點用于遺傳多樣性分析。研究結(jié)果顯示整體種群平均等位基因數(shù)（Na）為7.40，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為4.40，二者差異顯著（p＜0.01），可能存在等位基因丟失的風(fēng)險。研究區(qū)域整體種群觀測雜合度（Ho）為0.768，期望雜合度（He）為0.729。雜合度作為有效量化遺傳多樣性水平的參數(shù)［44］，與其他地區(qū)馬鹿亞種研究結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)本研究地區(qū)馬鹿遺傳多樣性處于中等偏低水平。

線粒體表達(dá)的遺傳多樣性水平低于微衛(wèi)星標(biāo)記，這可能與標(biāo)記方法本身有關(guān)。微衛(wèi)星標(biāo)記的進化速度高于線粒體DNA。相比之下，線粒體DNA 的整體結(jié)構(gòu)、大小及基因排列相對保守，一般不發(fā)生重組。線粒體DNA 為單倍體母系遺傳，有效種群大小僅為核DNA 的1/4，因此，對瓶頸效應(yīng)等種群變化較為敏感［45］，本研究表明大興安嶺南麓馬鹿種群歷史上可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)?；贑yt b測序結(jié)果可知，本研究檢出的單倍型數(shù)量相對較少，Hap3 僅有1 只個體構(gòu)成，稀有單倍型比例達(dá)33.33%。20世紀(jì)50年代，由于林業(yè)資源采伐、放牧和狩獵，本地區(qū)野生馬鹿種群數(shù)量急劇下降。直到本世紀(jì)初期，經(jīng)過合理的管理措施，馬鹿種群數(shù)量才逐漸恢復(fù)。因此，為了馬鹿種群的可持續(xù)發(fā)展，有必要對稀有單倍型實施監(jiān)測，并且加強管理和保護該地區(qū)的馬鹿種群，防止遺傳多樣性進一步下降，甚至喪失。

致謝：感謝內(nèi)蒙古高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)錢宏遠(yuǎn)局長、石光磊副局長對本研究調(diào)查工作的大力支持，感謝保護區(qū)業(yè)務(wù)部、資源部及科研管理部以阮行舟、寶音達(dá)來等為主要代表的全體參與者的熱心幫助和大力配合。