杜妹玲，陳志紅，朱軒池，蘭紅宇，李 永, ，張秀玲,

（1.齊齊哈爾大學(xué)輕工與紡織學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.寒區(qū)麻及其制品教育部工程研究中心，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電氣與信息學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；5.黑龍江省農(nóng)科院齊齊哈爾分院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

赤芍（Paeoniae Radix Rubra）是一種多年生草本植物，生長(zhǎng)在海拔200～4000 米處。根據(jù)中國藥典2005 年版，赤芍被定義為芍藥的干燥根[1]，衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51 號(hào)文件中將赤芍列為可藥食同源中草藥。赤芍中含有豐富的皂苷和多糖等植物次級(jí)代謝產(chǎn)物、揮發(fā)性成分，是天然優(yōu)質(zhì)抗生素、抗氧化材料和食品添加劑的來源[2]，這些成分可以有效清除自由基，并具有一定的抑菌活性[3]。許多研究表明，富含皂苷的植物可以幫助對(duì)抗病原體和預(yù)防許多疾病[4?5]。赤芍中的芍藥苷是一種單萜苷，是赤芍中研究最廣泛的化合物[6]，在抵御植物病原體和避免食草動(dòng)物的攻擊等方面發(fā)揮著重要作用[7]，可溶于乙醇和其他極性溶劑[8]。已有的研究表明，芍藥苷具有抗炎活性[9]（如治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和哮喘）、抗帕金森[10]、改善骨質(zhì)疏松[11]、減輕大鼠非酒精性脂肪性肝炎[12]等效用，并能作為一種抗氧化和抗凋亡劑降低毛細(xì)胞的耳毒性[13]。

提取植物有效成分并對(duì)其進(jìn)行定量和定性分析都受到溶劑類型和提取方法的影響[14]，一般來說，不同材料中活性成分的萃取效率受到液固比、提取溫度、提取時(shí)間等多種因素的影響[15]。近年來對(duì)總苷類物質(zhì)常用的提取方法包括超聲輔助提取法、索氏提取法、浸漬法、微波輔助提取法、回流提取法和加速溶劑提取法等。其中，微波輔助提取可以高速地從植物材料中提取活性物質(zhì)，減小了設(shè)備的尺寸，有效地提高了提取率，并在一定程度上降低了熱梯度，減少熱分解。作為一種統(tǒng)計(jì)方法，響應(yīng)面法可以對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)、建立模型和二次方程來評(píng)估自變量的影響，迄今為止，響應(yīng)面法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和優(yōu)化[16?17]。與響應(yīng)面法不同的是，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種非線性計(jì)算建模的方法，通過模擬生物神經(jīng)結(jié)構(gòu)，允許系統(tǒng)自我學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，在不了解特定數(shù)學(xué)模型的情況下解決實(shí)際問題[18?19]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為一種優(yōu)于響應(yīng)面法的模型，已經(jīng)廣泛用于優(yōu)化生物活性成分提取工藝中。已有的研究表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相比響應(yīng)面法集成可減少70%[20]，并利用了響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化了重金屬的氣凝膠吸附和天然產(chǎn)物的提取[20?21]。

現(xiàn)有的研究中，將人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用于赤芍有效成分提取的研究較少。中草藥有效成分的提取一直是近年來研究的熱點(diǎn)[22]，赤芍自2002 年被列進(jìn)可藥食同源中藥名錄以來，對(duì)赤芍研究仍僅限于藥理藥性，在食品應(yīng)用方面鮮有研究。本研究將綜合利用響應(yīng)面法和粒子群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)微波輔助提取赤芍中赤芍總苷的提取量進(jìn)行建模優(yōu)化，基于試驗(yàn)結(jié)果和誤差分析，比較兩種模型的優(yōu)化能力；通過體外活性試驗(yàn)測(cè)定了提取物對(duì)自由基的清除能力及總還原能力，并以芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品和陽性對(duì)照對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。本文提出了新的模型優(yōu)化赤芍有效成分提取工藝，并對(duì)赤芍提取物的體外活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為赤芍提取物作為添加劑使用在食品工業(yè)及其他輕工業(yè)領(lǐng)域中提供了前期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤芍 產(chǎn)于黑龍江省大興安嶺地區(qū)呼瑪縣農(nóng)業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園區(qū)；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（B21148）上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（618Q034）、α-葡萄糖苷酶（0.5 Units/mL）、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、對(duì)硝基苯酚（PNP）美國Sigma 試劑公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚等哈爾濱理工科技有限公司。

PH-140A 型恒溫?zé)犸L(fēng)干燥箱 上海一恒儀器有限公司；YP-20002 電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；G70D20CN1P-D2（S0）型微波爐 格蘭仕微波生活電器有限公司；INFINITE M200 PRO 酶標(biāo)儀 美國MoLecular Devices 公司；5430R 型高速離心機(jī) Edenff 中國有限公司；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒儀器有限公司；島津8400s 傅里葉紅外光譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 赤芍采摘后，清洗干凈，在恒溫干燥箱中50～55 ℃溫度條件下干燥48 h[23]。干燥后的樣品經(jīng)切片、粉碎、過80 目篩后，密封，在陰涼干燥處室溫保存。

1.2.2 微波輔助提取赤芍苷工藝的優(yōu)化

1.2.2.1 赤芍苷提取工藝流程 赤芍粉末→乙醇水溶液浸泡→微波處理→抽濾，得赤芍總苷提取液→冷凍干燥→赤芍總苷粉末

1.2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量赤芍粉末1.00 g，加入乙醇水溶液，室溫浸泡30 min 后進(jìn)行間歇性微波輔助提取，提取結(jié)束后測(cè)定提取液中赤芍總苷的含量。為了確定微波輔助提取的參數(shù)范圍，研究乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%，固定條件為：微波功率490 W、提取4 次、提取時(shí)間20 s、液固比：30 mL/g）、微波功率（350、420、490、560、630、700 W，固定條件為：乙醇濃度80%、提取4 次、提取時(shí)間20 s、液固比30 mL/g）、提取次數(shù)（2、3、4、5、6，固定條件為：乙醇濃度80%、微波功率420 W、提取時(shí)間20 s、液固比30 mL/g）、提取時(shí)間（10、15、20、25、30 s，固定條件為：乙醇濃度80%、微波功率420 W、提取5 次、液固比30 mL/g）、液固比（10、20、30、40、50 mL/g，固定條件為：乙醇濃度80%、微波功率420 W、提取5 次、提取20 s）對(duì)赤芍總苷提取量的影響，對(duì)以上五種因素進(jìn)行控制變量實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取工藝 通過單因素實(shí)驗(yàn)的最佳結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），以赤芍總苷提取量為響應(yīng)值，建立三因素三水平試驗(yàn)研究提取時(shí)間、乙醇濃度和液固比的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design Expert 8.0.6，并將響應(yīng)變量擬合為二次多項(xiàng)式模型。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及編碼水平Table 1 Box-Behnken design the test factors and the coding level

1.2.2.4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 本研究采用包含輸入層、隱藏層和輸出層的3 層人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型[24]。選取乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比3 個(gè)變量作為網(wǎng)絡(luò)的輸入層節(jié)點(diǎn)，并將其歸一化。歸一化公式如下：

式中：Di為訓(xùn)練樣本中的第i 個(gè)輸入；Dni是Di的歸一化結(jié)果；Dmax是訓(xùn)練樣本中輸入的最大值；Dmin是訓(xùn)練樣本中輸入的最小值。歸一化后，所有的數(shù)據(jù)被處理到?1～1 之間，這種分布的數(shù)據(jù)更適合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)處理。把赤芍總苷的提取量作為輸出層節(jié)點(diǎn)Y，各個(gè)神經(jīng)元節(jié)點(diǎn)處的激活函數(shù)為Relu。隱藏層的節(jié)點(diǎn)數(shù)由經(jīng)驗(yàn)公式[25]計(jì)算可得：

式中：p 為隱藏層的神經(jīng)元數(shù)量；n 為輸入層神經(jīng)元數(shù)量；q 為輸入層神經(jīng)元數(shù)量；m 一般取1～10 之間的數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中m 取7。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 微波提取赤芍總苷的粒子群-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型Fig.1 Particle swarm optimization-artificial neural network of microwave extract of paeoniflorin

一般地，使用平均絕對(duì)誤差（Mean Absolute Error，MAE），均方根誤差（Root Mean Square Error，RMSE）和決定系數(shù)（R2）作為模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。MAE、RMSE和R2的計(jì)算公式如下：

式中：n 是訓(xùn)練樣本的個(gè)數(shù)；Ytruth為第i 次訓(xùn)練中赤芍總苷提取量的真實(shí)值；Ypredict為第i 次訓(xùn)練中網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)赤芍總苷提取量的預(yù)測(cè)值；是訓(xùn)練樣本中所有赤芍總苷提取量真實(shí)值的平均值。采用留出法劃分訓(xùn)練集和測(cè)試集，即隨機(jī)地選擇數(shù)據(jù)把數(shù)據(jù)集劃分出兩個(gè)互斥的集合，訓(xùn)練集和測(cè)試集的比例為5:1。

1.2.2.5 粒子群算法優(yōu)化工藝參數(shù) 粒子群優(yōu)化算法（Particle Swarm Optimization，PSO）是一種有效的全局尋優(yōu)算法，通過粒子個(gè)體間的協(xié)作與競(jìng)爭(zhēng)，實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜空間內(nèi)搜索最優(yōu)解[26]。在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練完成后，用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模擬優(yōu)化仿真，將人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和粒子群優(yōu)化算法結(jié)合進(jìn)行仿真實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化提取赤芍總苷的工藝參數(shù)。使用Python 語言構(gòu)建粒子群算法的運(yùn)行環(huán)境，設(shè)初始粒子數(shù)pop 為500，最大迭代次數(shù)為500，慣性因子w 為0.9，個(gè)人學(xué)習(xí)因子C1 和社會(huì)學(xué)習(xí)因子C2 均為2，適應(yīng)度函數(shù)為1.2.2.4 中訓(xùn)練好的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。

1.2.3 赤芍總苷提取量測(cè)定 本研究采用香草醛-冰醋酸法[27]測(cè)定赤芍總苷的提取量。取2 μL 提取液于試管中，70 ℃蒸發(fā)乙醇溶劑，然后加入0.2 mL 5%（w/w）香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，混合均勻，在60 ℃水浴中處理15 min，加熱結(jié)束后再轉(zhuǎn)入冰浴處理5 min，冰浴結(jié)束后加入5 mL 冰醋酸，混合均勻后在波長(zhǎng)560 nm 處測(cè)定吸光值。制備不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)上述步驟，得芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線y=5.6659x?0.0005（R2=0.9992）。按公式（6）計(jì)算總赤芍總苷提取量，結(jié)果以芍藥苷當(dāng)量（PE）的干重（mg PE/g d.w.）表示。

式中：X 為樣品中赤芍總苷提取量（mg PE/g d.w.）；A 為顯色反應(yīng)后的吸光值；N 為稀釋倍數(shù)；V 為提取液體積（mL）；m 為原料樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 赤芍總苷紅外分析采用KBr 壓片法，準(zhǔn)確稱取樣品1.0 mg，干燥的KBr 150.0 mg，研磨混合均勻，在壓片機(jī)上用5～10×104kPa壓力壓成透明薄片，用KBr 片做空白。利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描，測(cè)定樣品的紅外透過率，掃描范圍：400～4000 cm?1，分辨率：4 cm?1，掃描次數(shù)：30。

1.2.5 赤芍苷體外活性分析

1.2.5.1 對(duì)DPPH 自由基的清除能力 檢測(cè)對(duì)DPPH自由基清除能力是評(píng)價(jià)抗氧化活性的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法[28]。將100 μL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液與100 μL不同濃度的赤芍苷溶液混合，在37 ℃黑暗中保存30 min[29]。DPPH 乙醇溶液在還原反應(yīng)中由紫色變?yōu)辄S色。反應(yīng)結(jié)束后在517 nm 處測(cè)定吸光度。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。清除DPPH 自由基的活性計(jì)算如下：

式中：At為樣品的吸光度值；A0為乙醇代替樣品的吸光度值；Ai為空白樣品的吸光度值。

1.2.5.2 對(duì)ABTS+自由基的清除能力 ABTS+自由基的清除能力采用Rafaila 等的方法進(jìn)行[30]。將7 mmol/L 的ABTS-乙醇溶液與等體積的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，將混合物置于30 °C 暗處中，靜置16 h 產(chǎn)生ABTS 自由基；靜置結(jié)束后用無水乙醇稀釋ABTS 母液，要求稀釋之后的溶液在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02。將稀釋后的ABTS 母液和樣品溶液以比例為10:3 加入48 孔板中，混合溶液在30 °C 暗處反應(yīng)30 min，記錄在734 nm 條件下的吸光值。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。清除ABTS+自由基的活性計(jì)算如下：

式中：Ai為樣品的吸光度值；A0為乙醇代替樣品的吸光度值。

1.2.5.3 總還原能力 采用鐵氰化鉀還原法對(duì)樣品的總還原能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將PBS（0.2 mol/L pH6.6）、樣品和1%的鐵氰化鉀溶液以體積比1:1:1 加入到試管中，充分混合后置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min；冷卻后，加入2 mL 10%三氯乙酸，混合均勻，取100 μL上清液于48 孔板中，加入400 μL 去離子水和50 μL 0.1%三氯化鐵溶液，在黑暗中保存30 min。反應(yīng)結(jié)束后在700 nm 處測(cè)定吸光值，吸光值越高，還原率越高。以抗壞血酸為陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行三次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行；用Python 語言構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；使用軟件SPSS 22 中單因素方差分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行95%置信區(qū)間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取赤芍總苷工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素條件對(duì)提取過程的影響

2.1.1.1 乙醇濃度對(duì)赤芍總苷提取量的影響 選擇適當(dāng)?shù)妮腿∪軇?duì)目標(biāo)化合物的萃取效率有非常顯著的影響。皂苷在甲醇和乙醇[31?32]中都有較好的溶解性，考慮到環(huán)境影響和甲醇的性質(zhì)，優(yōu)先選用乙醇作為提取溶劑。乙醇濃度對(duì)赤芍總苷的影響結(jié)果如圖2（a）所示，赤芍總苷在乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最大值（371.96 mg PE/g d.w.）。當(dāng)乙醇濃度從60%增加到80%時(shí)，赤芍總苷提取量隨之增加；乙醇濃度在高于80%后，提取量開始下降。出現(xiàn)這種情況可能因萜苷類物質(zhì)極性較大，屬于親水性物質(zhì)[33]，隨著乙醇濃度的增加，溶劑的極性下降，根據(jù)相似相容原理，溶劑極性降低，萜苷類物質(zhì)溶出量下降。

圖2 提取工藝各因素對(duì)赤芍總苷提取量的影響Fig.2 Influence of various factors of the extraction process on the extraction amount of paeoniflorin

2.1.1.2 微波功率對(duì)赤芍總苷提取量的影響 為了驗(yàn)證微波對(duì)提取過程的影響，通過試驗(yàn)研究了不同微波功率下的提取量，結(jié)果如圖2（b）所示，隨著功率從350 W 增加到700 W，提取量先升高后下降，在420 W時(shí)有最高點(diǎn)；功率超過420 W 后，隨著功率的增加，提取量降低，可能的原因是細(xì)胞破壞率和傳質(zhì)速率增加，導(dǎo)致有效成分被分解，產(chǎn)率下降[34]。

2.1.1.3 提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)赤芍總苷提取量的影響 由圖2（c、d）所示，隨著萃取時(shí)間從10 s 增加到20 s，萃取次數(shù)從2 次增加到5 次，赤芍總苷的提取量明顯增加。隨著提取時(shí)間和提取次數(shù)的進(jìn)一步增加，提取量下降，可能由于提取時(shí)間過長(zhǎng)，有效成分被分解，提取量降低[35]。提取時(shí)間與微波釋放量有關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)，微波釋放量越多，影響提取結(jié)果，微波間歇提取有益于緩解連續(xù)微波處理對(duì)目標(biāo)提取物分解的影響[35]。

2.1.1.4 液固比對(duì)赤芍總苷提取量的影響 液固比對(duì)赤芍總苷提取量的影響如圖2（e）所示。在液固比從10 mL/g 提高到20 mL/g 時(shí)，提取量達(dá)到最高點(diǎn)，液固比超過20 mL/g 時(shí)提取量并不會(huì)增加，反而有所降低，出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)樵谟行С煞痔崛∵^程中，較高的溶劑體積需要更多乙醇和水的含量，導(dǎo)致溶劑中吸收更多的微波能量，因?yàn)樗慕殡娞匦?，溶劑越多，吸收的微波熱量更多，也可能?dǎo)致目標(biāo)化合物受熱分解，從而降低產(chǎn)量[36]。

2.1.2 響應(yīng)面模型試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 響應(yīng)面模型建立與分析 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在微波功率為420 W 及提取次數(shù)5 次的條件下，對(duì)微波提取赤芍總苷工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過Box-Behnken 8.0.6 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及擬合性分析。

通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)，共得到17 組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 Box–Behnken 試驗(yàn)編碼變量及結(jié)果Table 2 Box–Behnken design coded variables and measured values

通過對(duì)表2 中的試驗(yàn)結(jié)果和表1 中的因素對(duì)應(yīng)水平進(jìn)行多元回歸擬合得到乙醇濃度（A）、液固比（B）、提取時(shí)間（C）的回歸方程：

Y=370.32+7.76A+2.69B+4.38C?4.86AB+2.21AC+3.48BC?13.85A2?6.28B2?2.80C2

回歸模型方差分析如表3 所示。從F值和圖3可以推斷，各因素對(duì)總赤芍總苷提取量的影響為A（乙醇濃度）>C（提取時(shí)間）>B（液固比）。相關(guān)系數(shù)（R2）值為0.9099，表明該模型具有顯著性（P<0.05）；CV 值（1.46%）說明實(shí)測(cè)值具有良好的可靠性和較高的精度；“失擬項(xiàng)P值”為0.0531>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明方程擬合充分，可以較好地表示各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

圖3 各因素對(duì)赤芍苷提取量的交互作用Fig.3 Interactions of various factors on the extraction amount of paeoniflorin

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.1.2.2 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件計(jì)算出赤芍總苷提取量的最佳條件為乙醇濃度（v/v）82.94%、液固比23.78 mL/g、提取時(shí)間25 s、微波功率420 W、提取5 次，在此條件下得到的赤芍總苷提取量預(yù)測(cè)值為374.535 mg PE/g d.w.。根據(jù)實(shí)際情況選擇工藝條件為：乙醇濃度（v/v）83%、液固比24 mL/g、提取時(shí)間25 s、微波功率420 W、提取5 次，在此條件下得到赤芍總苷提取量為370.231±2.725 mg PE/g d.w.，與預(yù)測(cè)值接近，表明建立響應(yīng)面模型可以很好地預(yù)測(cè)赤芍總苷提取工藝。

2.1.3 粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型試驗(yàn)

2.1.3.1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的結(jié)果與分析 本研究使用Python 語言和Scikit-learn 機(jī)器學(xué)習(xí)工具構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。Scikit-learn 中的MLPRegressor 方法建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)回歸算法，隱藏層節(jié)點(diǎn)設(shè)置為9 個(gè)，最大迭代次數(shù)為500，損失函數(shù)為平方誤差（Square Error，SE），正則化系數(shù)α為0.0002，優(yōu)化方法為L(zhǎng)-BFGS（Limited Memory BFGS）[25]。

由圖4 可以看出，在測(cè)試集中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值基本吻合，訓(xùn)練集中R2為0.9999，測(cè)試集中R2為0.8534，全體數(shù)據(jù)集中R2為0.9852。表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)性能良好，可以作為優(yōu)化赤芍總苷提取工藝參數(shù)的可靠依據(jù)。

圖4 訓(xùn)練模型適配Fig.4 Training model adaptation

2.1.3.2 使用粒子群算法計(jì)算最優(yōu)提取工藝 設(shè)響應(yīng)面中的數(shù)據(jù)作為原始數(shù)據(jù)，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為適應(yīng)度函數(shù)，以赤芍總苷的提取量作為算法的輸出，結(jié)合粒子群優(yōu)化算法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行全局尋優(yōu)，找到最優(yōu)的提取工藝參數(shù)。

由圖5 可知，迭代次數(shù)達(dá)到140 次后最大提取值開始平穩(wěn)。經(jīng)過粒子群算法得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為：赤芍總苷的預(yù)計(jì)提取量為380.067 mg PE/g d.w.，提取時(shí)間為22.35 s，液固比30 mL/g，乙醇濃度為80.76%，微波功率420 W，提取次數(shù)5 次?？紤]方便實(shí)際操作過程，選擇最佳工藝為提取時(shí)間22 s，液固比30 mL/g，乙醇濃度為81%，微波功率420 W，提取次數(shù)5 次。在最佳工藝下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值得到赤芍總苷提取量為378.977±1.982 mg PE/g d.w.，預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值相差0.287%，比響應(yīng)面方法高出24.957%，更加準(zhǔn)確。

圖5 粒子群算法尋優(yōu)過程Fig.5 Optimization process of particle swarm algorithm

2.1.3.3 對(duì)比粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)面方法的預(yù)測(cè)結(jié)果 對(duì)比響應(yīng)面方法和粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法的工藝參數(shù)結(jié)果。根據(jù)公式（3）～（5），計(jì)算兩種方法的MAE，RMSE 和R2，結(jié)果如表4 所示。

表4 預(yù)測(cè)結(jié)果的比較Table 4 Comparison of the predicted results

由表4 和圖6 可知，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法的MAE 和RMSE 均小于響應(yīng)面的MAE 和RMSE，并且人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的R2比響應(yīng)面法的R2更接近于1，表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)結(jié)果的預(yù)測(cè)比響應(yīng)面模型具有更高的精度。

圖6 赤芍總苷提取量的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值的對(duì)比Fig.6 Comparison of true value and predicted value of saponin extraction

2.1.3.4 對(duì)比粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)面方法的優(yōu)化結(jié)果 兩種模型優(yōu)化提取工藝的比較表5 所示，對(duì)比粒子群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法和響應(yīng)面的優(yōu)化工藝參數(shù)，粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法相比響應(yīng)面方法有著更小的相對(duì)誤差，證明粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法的結(jié)果更加準(zhǔn)確，結(jié)果更可信，該方法可以為提取赤芍總苷工藝參數(shù)的確定提供方法參考。

表5 優(yōu)化結(jié)果的比較Table 5 Comparison of the optimization results

2.2 傅里葉紅外光譜分析

為了鑒定提取的赤芍總苷，對(duì)芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品和赤芍總苷進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，結(jié)果如圖7 所示。提取赤芍總苷樣品與芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品比較，二者有相近的吸收峰。3300～3393 cm?1處的峰是典型O-H的伸縮振動(dòng)峰[37]，2858～2927 cm?1和1278 cm?1處的峰是典型的C-H 的伸縮振動(dòng)峰，1701～1737 cm?1處的峰是典型C=O 的振動(dòng)吸收峰[37]，1460～1467 cm?1處的峰是典型的COOH 或CH=O 的振動(dòng)吸收峰，1074～1172 cm?1的峰是典型的C-O 和C-O-C的伸縮振動(dòng)峰，712 cm?1處的峰是典型的芳香環(huán)上的C-H 平面振動(dòng)峰[37]。從圖中可以看出，提取樣品芳香環(huán)的特征峰不明顯，其原因可能是受到提取時(shí)的微波功率等條件影響被熱解[37]。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品傅里葉紅外光譜Fig.7 Standard and sample Fourier infrared spectrum

2.3 赤芍總苷體外抗氧化活性分析

2.3.1 對(duì)自由基的清除能力 通過常見的抗氧化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)赤芍總苷在20～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)的抗氧化能力，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品對(duì)DPPH 和ABTS+自由基的清除能力分別如圖8（a）和圖8（b）所示。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和陽性對(duì)照對(duì)DPPH 自由基的清除能力呈現(xiàn)濃度依賴性。標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和陽性對(duì)照在20～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)對(duì)ABTS+自由基的抑制能力也具有相同的趨勢(shì)。結(jié)果表明，赤芍中的赤芍總苷提取物對(duì)自由基有抑制作用。

圖8 赤芍總苷體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Results of in vitro antioxidant activity of paeoniflorin

對(duì)DPPH 自由基清除試驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品相比，在100 μg/mL 濃度下，樣品抑制率較高（87.61%），接近于陽性對(duì)照（94.63%），標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為80.52%；標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和抗壞血酸的IC50分別為：38.03、11.16和4.01 μg/mL，對(duì)DPPH 自由基的清除能力排序?yàn)榭箟难?樣品>標(biāo)準(zhǔn)品。

對(duì)ABTS+自由基清除試驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和抗壞血酸的IC50分別為155.26、70.46 和10.77 μg/mL，對(duì)ABTS+自由基清除能力排序?yàn)榭箟难?樣品>標(biāo)準(zhǔn)品。在濃度為20 μg/mL 時(shí)，樣品對(duì)ABTS+自由基的清除能力明顯低于抗壞血酸；在最高濃度為100 μg/mL 時(shí)，樣品組對(duì)ABTS+自由基的清除能力接近抗壞血酸，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

現(xiàn)有的研究表明赤芍總苷對(duì)DPPH、ABTS+自由基的半抑制率分別為10.08 μg/mL、5.67 μg/mL[38]，較本研究結(jié)果高，這可能是由于研究赤芍品種和來源不同，植物有效成分會(huì)受到多種因素的影響，比如物種、生長(zhǎng)區(qū)域、種植模式和藥材制備等[39]。

2.3.2 總還原能力分析 采用鐵氰化鉀還原法對(duì)赤芍總苷總還原能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。反應(yīng)體系中的Fe3+被還原為Fe2+，在700 nm 處有吸收峰，因此反應(yīng)溶液在700 nm 波長(zhǎng)處吸收率可以代表Fe2+的濃度，間接代表還原能力。

總還原能力結(jié)果如圖8（c）所示。在試驗(yàn)濃度最大時(shí)，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品之間的差異不大，抗壞血酸在最大濃度（1000 μg/mL）下的總還原能力為樣品的1.8 倍，所有實(shí)驗(yàn)組的吸光值均呈現(xiàn)濃度依賴性，相同濃度下的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總還原能力排序?yàn)榭箟难?標(biāo)準(zhǔn)品>樣品。與陽性對(duì)照相比，樣品的總還原能力要弱得多。

體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品組的結(jié)果略高于標(biāo)準(zhǔn)品，可能是由于存在內(nèi)源性協(xié)同效應(yīng)，樣品中含有少量的多糖[1]和多酚物質(zhì)（15.224 mg/g）。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法和粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立了赤芍總苷的最佳微波提取條件，兩種模型在本試驗(yàn)中都展現(xiàn)了足夠的可靠性，相比之下，粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中對(duì)赤芍總苷提取量的預(yù)測(cè)相對(duì)誤差較小，決定系數(shù)更高，能更有效的優(yōu)化提取工藝參數(shù)，最佳工藝提取條件：乙醇濃度81%、液固比30 mL/g、提取時(shí)間22 s、提取5 次、微波功率420 W，在此條件下得到赤芍總苷提取量為378.977±1.982 mg PE/g d.w.。通過對(duì)DPPH、ABTS+自由基和總還原能力體外抗氧化活性測(cè)定，證實(shí)了赤芍總苷具有一定的抗氧化活性，但可能因本研究使用的原材料生長(zhǎng)地點(diǎn)或品種等因素，致使本研究的赤芍總苷抗氧化性能低于已有的研究結(jié)果，此部分還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

總的來說，粒子群-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種高效的優(yōu)化和預(yù)測(cè)提取工藝的數(shù)學(xué)模型。本研究提出的赤芍總苷的抗氧化性為下一步以赤芍總苷作為可食用包裝膜添加劑的研究提供了理論基礎(chǔ)。