陳堅翱，羅恒，胡艷艷，徐紅

健脾益腎方對痛風性腎損害患者尿液微RNA表達變化的研究

陳堅翱1，羅恒2，胡艷艷1，徐紅1

1.杭州市中醫(yī)院科教部，浙江杭州 310007；2.杭州市富陽區(qū)中醫(yī)院神經(jīng)內科，浙江杭州 311400

分析健脾益腎方干預前后痛風性腎損害患者尿液微RNA（microRNA，miRNA）的表達變化。通過高通量測序法檢測早期痛風性腎損害患者干預前后尿液外泌體源性miRNA的表達譜，并比較表達變化情況。早期痛風性腎損害患者與正常人群的尿液外泌體源性miRNA有明顯差異；早期痛風性腎損害患者健脾益腎方中藥干預后，19個可作為生物標記物的miRNA中有5個平均表達值上調，14個平均表達值下調。健脾益腎方對痛風性腎損害患者的miRNA表達有一定調節(jié)作用，差異表達的miRNA可能參與腎損害的發(fā)生發(fā)展。

痛風性腎損害；微RNA；健脾益腎方

痛風性腎病是由血尿酸產(chǎn)生過多和（或）排泄減少形成高尿酸血癥所致的腎損害。隨著我國居民生活水平的提高，痛風性腎病發(fā)病率呈上升趨勢，我國的痛風患病率為0.34%～2.84%，臨床上5%～15%的高尿酸血癥患者發(fā)展為痛風[1]。而沿海地區(qū)由于飲食等因素，痛風及高尿酸血癥的發(fā)病率相對更高一些。目前高尿酸血癥的干預率低，痛風缺乏規(guī)范性治療，約1/3的痛風患者可出現(xiàn)腎臟病變并最終進展為終末期腎病[2]。以腎臟功能為焦點的健康管理已逐漸進入大眾視野，引起社會廣泛關注，未病先防、已病防傳、既病防變、瘥后防復的中醫(yī)“治未病”思想儼然成為早期防治的重要組成部分。早期診斷痛風性腎病對保護腎功能、改善預后有重要意義。微RNA（microRNA，miRNA）是長度為18～25個核苷酸的非編碼RNA，通過轉錄后與信使RNA的特定位點結合來調控靶基因的表達。研究顯示，差異表達的miRNA可通過炎癥反應、腎臟血管內皮細胞功能障礙、腎臟血管再生及修復和氧化應激等途徑影響腎損傷的進展[3-6]。尿液外泌體中的miRNA比尿液細胞中的更加穩(wěn)定，包含來自腎小球、腎小管、膀胱等泌尿系統(tǒng)細胞的生物學信息，且提取方便[7-8]。通過前期實驗研究，課題組篩選出19個在早期痛風性腎損害患者中表達差異的miRNA?；诖?，本研究擬探討中藥干預前后痛風性腎損害患者上述miRNA的變化情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年7月至2018年3月就診于杭州市中醫(yī)院的早期痛風性腎損害患者5例。納入標準：①年齡18～65歲；②符合《內科學》[1]中痛風及痛風性腎病的診斷標準；③104μmol/L<血肌酐<200μmol/L；④中醫(yī)辨證符合脾腎兩虛證。排除標準：①有導致高尿酸血癥的繼發(fā)性疾?。虎诜媒抵?、布美他尼等藥物引起的血尿酸增高者；③患有嚴重心、腦、肺、血液系統(tǒng)疾病及其他可能導致腎功能不全等疾病者；④近3個月有生育計劃者，妊娠期或哺乳期女性；⑤患有精神疾病者；⑥既往對中藥過敏者，或不能耐受口服中藥者；⑦正在參與其他臨床研究者；⑧研究人員認為不適合參加的其他情況。另選取體檢中心的健康人群5名。所有研究對象均自愿參與并簽署知情同意書，本研究經(jīng)杭州市中醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：2016KY048）。

1.2 主要實驗試劑及儀器

乙酸、乙醇、異丙醇、氯仿購自生工生物工程（上海）股份有限公司，糖原、TRIzol LS試劑購自Invitrogent Corporation，DEPC水購自Sigma Corporation，苯甲基磺酰氟、亮抑酶肽、二硫基蘇糖醇購自Biosharp Corporation，磷酸鹽緩沖液購自吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司。生物分析儀、測序儀、快速SR富集試劑盒、快速SBS試劑盒購自Illumina Corporation，PCR試劑盒購自Qiagen Corporation。–20℃低溫冰箱、–80℃超低溫冰箱、制冰機、電子天平、超凈工作臺、超速離心瓶、超速離心機、臺式離心機、量程移液槍及槍頭、EP管、全波長紫外/可見光掃描分光光度計、恒溫水浴箱。

1.3 藥物準備

健脾益腎方組成：黃芪15g，土茯苓30g，桑寄生15g，淫羊藿10g，丹參15g，秦艽10g，豨薟草10g，女貞子15g，當歸12g。水煎取藥汁200ml，每日1劑，分2次服用。

1.4 研究方法

分別收集所有研究對象入組時及早期痛風性腎損害患者中藥干預3個月后的中段尿，差速離心法收集尿液中的外泌體，TRIzol法提取總RNA。將提取的RNA使用高通量測序檢測miRNA表達譜，比對19個可作為生物標記物的miRNA在早期痛風性腎損害中藥干預前后的表達變化。

1.4.1 尿液收集 尿液收集前一日22時后停止進食、飲水，留取次日清晨第一次小便的中段尿液。使用2個100ml無菌離心管收集尿液，每管70ml，編號后置于低溫環(huán)境待測。

1.4.2 尿液外泌體分離 將42μl 0.001mol/L的亮抑酶肽和350μl 0.1mol/L的苯甲基磺酰氟滴入裝有70ml尿液樣本的離心管中，緩緩搖勻；4℃ 17 000×g的轉速下離心0.5h；收集上清液，4℃ 200 000×g的轉速下離心1h；去除上清液，留取管底沉淀物，加入56μl 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液后搖勻，加入已編好序號的EP管，最后滴入56μl 60mg/ml的二硫基蘇糖醇緩沖液；EP管浸入60℃恒溫水箱中加熱10min；–80℃冰箱保存，以備后續(xù)操作使用。

1.4.3 樣本總RNA的提取、質控 使用TRIzol法提取外泌體中的總RNA，用NanoDrop?ND-1000測定樣本總RNA濃度和純度。

1.4.4 制備miRNA測序文庫 在每個樣本總RNA的5’及3’端加入RNA接頭，運用Illumina RT引物和擴增引物進行反轉錄擴增，合成cDNA，再用PCR擴增。再從PAGE膠上選出135～155bp的PCR擴增片段，同時用QIAquick PCR Purification Kit進行純化。最后運用Agilent 2100 Bioanalyzer定量文庫。將樣本滴定到最后的濃度8pmol/L，再用TruSeq Rapid SR cluster Kit（GD-402-4001）在Illumina cBot上進行簇生成。

1.4.5 上機測序 運用TruSeq Rapid SBS Kit（FC-402-4002），在Illumina NextSeq 500測序儀上開展50個周期的測序。

1.5 統(tǒng)計學方法

運用STEM軟件統(tǒng)計分析miRNA的表達趨勢。以正常人群miRNA的平均表達值為基準，經(jīng)STEM軟件轉換為0，將中藥干預前、后的平均表達值進行比較，判斷表達的上調或下調。

2 結果

2.1 樣本總RNA和文庫質檢結果

2.1.1 總RNA濃度和純度檢測結果 用NanoDrop?ND-1000檢測尿液外泌體總RNA的OD值，結果顯示OD260/OD280為1.33～1.68，OD260/OD230為0.69～1.61。說明RNA純度可，雜質含量較少，經(jīng)上機前檢驗，各項檢測參數(shù)均基本滿足后續(xù)miRNA測序實驗要求。

2.1.2 測序文庫質控結果 利用Agilent 2100 Bioanalyzer，使用Agilent DNA 1000 chip kit測定測序文庫質量，文庫長度為142～146bp。

2.1.3 miRNA數(shù)據(jù)質量評估 將樣本中的片段去接頭后，長度在16～30nt的片段主要集中在22nt左右，說明后續(xù)miRNA測序結果質量可靠。

2.2 miRNA的時間序列基因表達趨勢

運用STEM軟件分析發(fā)現(xiàn)，早期痛風性腎損害患者與正常人群的尿液外泌體源性miRNA有明顯差異；早期痛風性腎損害患者中藥干預后19個可作為生物標記物的miRNA中平均表達值上調5個，平均表達值下調14個，見表1。

3 討論

痛風性腎病的損害是多方面的，一旦出現(xiàn)嚴重的腎損害，會給患者、家庭和社會帶來沉重的負擔。祖國醫(yī)學未曾有“痛風性腎病”的病名記載，現(xiàn)根據(jù)其主要臨床表現(xiàn)可歸屬為尿濁、石淋、腎水等范疇?！吨T病源候論·石淋候》記載“石淋者，淋而出石也”。故尿酸性結石及血尿者可歸為石淋、血淋；若有蛋白尿者，可歸于尿濁、膏淋；出現(xiàn)腎功能不全者，可歸為水腫、腎水等。中醫(yī)學認為，患者稟賦不足、脾腎虧虛是疾病發(fā)生的內因，感受六淫邪氣、飲食不節(jié)是疾病發(fā)生的外因[9-12]。故本病的病機多屬脾腎虧虛，夾濕、夾瘀阻滯經(jīng)絡所致。

痛風性腎病是痛風發(fā)展到后期出現(xiàn)的病癥，其中醫(yī)辨證雖與痹證有相似之處，但亦有不同。黃勇等[13]認為在高尿酸血癥時即可祛除濕、痰、瘀，調節(jié)氣血陰陽，阻斷疾病進展，為“治未病”范疇，正如《丹溪心法》所云“與其救療于有疾之后，不若攝養(yǎng)于無疾之先”。若發(fā)展至腎臟損害時，根據(jù)四診辨證分型，各中醫(yī)學者觀點又有所不同。劉旭生將痛風性腎病分為急性期、好轉期、緩解期，分別使用桃紅四物湯合四妙湯加減、濟生腎氣丸合參苓白術散加減、溫脾湯合真武湯加減予以治療[14]。丁穎迪[15]在結合臨床經(jīng)驗的基礎上將痛風性腎病分為脾腎虛衰、濕毒內滯，氣陰兩虛、水濕內停，濕熱痹阻、瘀血內停等證。以上諸證在臨床診治中可單獨出現(xiàn)，也可相互夾雜。

本研究的健脾益腎方由經(jīng)驗方“芪苓顆粒/尿酸利仙方”化裁而來。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)“芪苓顆粒/尿酸利仙方”可有效治療高尿酸血癥、痛風、痛風性腎病等，療效確切[16-19]。本方證因脾腎兩虛日久，濕瘀互結于腎，以致腎失封藏，精微物質外泄。本病多屬邪實正虛，邪實宜攻，正虛宜補，故當健脾祛濕、益腎化瘀。方中以黃芪益氣健脾，脾健則水濕得化。土茯苓、豨薟草利水滲濕，使?jié)裥巴獬鲇新?。桑寄生、女貞子、淫羊藿補益腎臟，腎元充則精微藏。丹參、當歸活血化瘀，佐以秦艽化濕通絡，使?jié)耩鲩_解。諸藥合用，既能健脾益腎，又可清熱利濕、化瘀泄?jié)?，使正氣得復，邪氣自去?/p>

本研究發(fā)現(xiàn)，與干預前比較，中藥干預后19個可作為生物標記物的miRNA有5個平均表達值上調（hsa-miR-5100、hsa-miR-4454、hsa-miR-4286、hsa-miR-1260a、hsa-miR-1260b），其余14個均下調。miRNA是基因表達負調控因子，最早在秀麗隱桿線蟲的lin-4和let-7中發(fā)現(xiàn)，可通過靶向結合信使RNA的特定位點調控靶基因的表達。每個miRNA可有幾十甚至幾百個靶基因，而多個miRNA也可共同調節(jié)一個靶基因，從而在miRNA和靶基因間構成復雜的調控網(wǎng)絡。迄今為止，人類基因組已測定的miRNA遠超過2000種。miRNA具有高度保守性、時序性和組織特異性等特點，在不同的物種之間有一定的價值。miRNA涉及動物、植物和真菌等生物的廣泛生物過程，并發(fā)揮重要作用。失調的miRNA表達與多種人類疾病相關，其還參與腫瘤、內分泌等疾病的發(fā)生發(fā)展[20-21]。

表1 miRNA的平均表達值（STEM軟件轉換后）

注：A正常人群，B早期痛風性腎損害患者中藥干預前，C早期痛風性腎損害患者中藥干預后

運用健脾益腎方對痛風性腎損害患者進行干預，對miRNA表達變化具有一定的調節(jié)作用，其中表達上調的5個miRNA中，hsa-miR-5100可能與腎損傷的系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關，hsa-miR-1260a可能與狼瘡性腎炎、巴爾干地方性腎病相關，hsa-miR-1260b可能與Ⅳ級狼瘡性腎炎相關[22]。但miR-4454、miR-4286的相關研究較少，特別是在腎臟疾病方面，仍有很大的挖掘潛力，有待深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)的差異性miRNA暫未證實與痛風性腎損害有直接關聯(lián)，有待今后多中心、大樣本研究進一步論證。通過生物信息學挖掘和潛在調控機制分析，可為痛風性腎損害發(fā)病的機制研究提供新依據(jù)，對保護腎功能的臨床治療提供早期預警標識，為中藥療效評價及中藥研發(fā)提供新思路。

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Study on the changes of urinary microRNA expression of Jianpi Yishen decoction in patients with gout renal damage

CHEN Jian’ao, LUO Heng, HU Yanyan, XU Hong

1.Department of Science and Education, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, Zhejiang, China; 2.Department of Neurology, Hangzhou Fuyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 311400, Zhejiang, China

To analyze the changes of microRNA (miRNA) expression in urine of patients with gout renal damage before and after the intervention of Jianpi Yishen decoction.The expression profiles of urine exosome-derived miRNAs were detected by high-throughput sequencing before and after intervention in patients with early gout renal damage, and the expression changes were compared.Urine exosome-derived miRNAs were significantly different between the patients with early gout renal damage and the normal population. After the intervention of Jianpi Yishhen decoction, the expression of 19 miRNAs that could be used as biomarkers were up-regulated in 5 and down-regulated in 14.Jianpi Yishen decoction can regulate the expression of miRNA in patients with gout renal damage to some extent, and differentially expressed miRNA may be involved in the occurrence and development of renal damage.

Gout renal damage; MicroRNA; Jianpi Yishen decoction

R589.7

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.019

浙江省科技計劃項目（2017C33196）

陳堅翱，電子信箱：280185808@qq.com

（2022–10–13）

（2023–07–05）