張國(guó)翠，王建，勞海黎，張盟，孟慶捷

微陣列芯片技術(shù)在耐多藥結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用研究

張國(guó)翠，王建，勞海黎，張盟，孟慶捷

濱州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州 251700

探討微陣列芯片技術(shù)在耐多藥結(jié)核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）臨床診斷中的應(yīng)用。收集2020年6月至2021年5月經(jīng)濱州市中心醫(yī)院確診的245例住院肺結(jié)核患者的標(biāo)本（痰液標(biāo)本125例和痰培養(yǎng)分離菌株120例）。痰液標(biāo)本同時(shí)采用DNA微陣列芯片技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)其結(jié)核桿菌陽(yáng)性率。痰液標(biāo)本和分離菌株均采用DNA微陣列芯片技術(shù)進(jìn)行肺結(jié)核耐多藥檢測(cè)和分枝桿菌菌種鑒定。125例痰液標(biāo)本經(jīng)DNA微陣列芯片技術(shù)和痰培養(yǎng)法檢測(cè)，陽(yáng)性率分別為58.4%（73/125）和24.8%（31/125），兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=14.520，<0.001）。采用DNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)125例痰液標(biāo)本和120例分離菌株，共檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例，非結(jié)核分枝桿菌7例。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例檢出耐藥者41例，其中耐異煙肼15例，耐利福平19例，同時(shí)耐兩種藥物7例。非結(jié)核分枝桿菌包括胞內(nèi)分枝桿菌4例，堪薩斯分枝桿菌2例，鳥(niǎo)分枝桿菌1例。DNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)周期短，能同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測(cè)和菌種鑒定，對(duì)MDR-TB的早期診斷和治療有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

肺結(jié)核；非結(jié)核分枝桿菌；耐多藥肺結(jié)核病；異煙肼；利福平

世界衛(wèi)生組織報(bào)道的全球每年新發(fā)耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）患者37.8萬(wàn)例，中國(guó)的新發(fā)病例數(shù)約11萬(wàn)[1-3]。我國(guó)結(jié)核病控制的總體形勢(shì)仍然嚴(yán)峻，耐藥結(jié)核病尤其是MDR-TB是目前結(jié)核病防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。MDR-TB引起的高發(fā)病率及高病死率在結(jié)核病控制中引起更多的關(guān)注[2-4]。傳統(tǒng)耐多藥檢測(cè)方法耗時(shí)且敏感度較低，無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求，本研究利用DNA微陣列芯片技術(shù)快速診斷和鑒別診斷肺結(jié)核及其耐藥情況，為臨床早期診斷治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2020年6月至2021年5月經(jīng)濱州市中心醫(yī)院確診的245例住院肺結(jié)核患者的標(biāo)本（痰液標(biāo)本125例和痰培養(yǎng)分離菌株120例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《肺結(jié)核診斷 WS 288—2017》中診斷標(biāo)準(zhǔn)；有肺結(jié)核典型臨床癥狀；經(jīng)影像學(xué)檢查，肺部有活動(dòng)性肺結(jié)核病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肺部疾?。痪癞惓；颊?。納入患者中男127例，女118例，年齡18～76歲，平均年齡46.9歲。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)濱州市中心醫(yī)院內(nèi)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2020005）。

1.2 試劑和儀器

晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒（DNA微陣列芯片法）和晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）購(gòu)自博奧生物技術(shù)有限公司。使用儀器有ABI500熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀；晶芯?E-Cycler?96 PCR儀；晶芯?BioMixer?Ⅱ芯片雜交儀；晶芯?SlideWasher?芯片洗干儀；晶芯?LuxScan?10K/B微陣列芯片掃描儀等。

1.3 方法

125份合格痰液標(biāo)本取半量（約2.5ml）加入兩倍體積4%NaOH溶液，震蕩15min，取0.1ml液化痰液接種酸性羅氏培養(yǎng)基中，37℃孵育，4周報(bào)告結(jié)果，操作按《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]要求；剩余半量（約2.5ml）痰液標(biāo)本加入兩倍體積4%NaOH溶液，反復(fù)震蕩后靜置30min，取1ml液化痰液加入1.5ml離心管中，高速離心（14 000轉(zhuǎn)/min）10min，棄上清，加1ml生理鹽水于沉淀中離心（15 000轉(zhuǎn)/min）10min，棄上清，再加50μl核酸提取液于沉淀中，充分震蕩，100℃金屬浴10min，離心（15 000轉(zhuǎn)/min）5min，取其上清作為反應(yīng)模板，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交和掃描判讀。

120例患者支氣管肺泡灌洗液經(jīng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)報(bào)告陽(yáng)性的分離菌株，用取菌環(huán)直接挑取單個(gè)菌落加入80μl核酸提取液中，置100℃金屬浴10min，離心5min，取上清。所得核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交和掃描判讀。結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測(cè)和分枝桿菌菌種鑒定實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[6]基因芯片法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.4 質(zhì)量控制

每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行耐藥檢測(cè)時(shí)，芯片內(nèi)部設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控。一個(gè)分枝桿菌屬質(zhì)控，一個(gè)結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控，2個(gè)芯片制備質(zhì)控，2個(gè)芯片雜交質(zhì)控，一個(gè)空白對(duì)照質(zhì)控，一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)控，以及靶基因ropB、KatG和inhA擴(kuò)增質(zhì)控。如果其中任何一個(gè)質(zhì)控結(jié)果錯(cuò)誤，則標(biāo)本結(jié)果定位無(wú)效，需要進(jìn)行復(fù)檢；每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)設(shè)有空白對(duì)照質(zhì)控、陰性對(duì)照質(zhì)控、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控、四個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)痰液的結(jié)核桿菌陽(yáng)性率比較

125份痰液標(biāo)本采用DNA微陣列芯片技術(shù)和痰培養(yǎng)法檢測(cè)，DNA微陣列芯片技術(shù)檢出陽(yáng)性73例（58.4%），痰培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性31例（24.8%），兩種方法檢出陽(yáng)性結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=14.520，<0.001）。

2.2 125例痰液和120例分離菌株的菌種鑒定情況

采用DNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)125例痰液和120例分離菌株，共檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例（痰液73例，分離菌株119例），非結(jié)核分枝桿菌7例（痰液6例，分離菌株1例）。7例非結(jié)核分枝桿菌包括胞內(nèi)分枝桿菌4株，堪薩斯分枝桿菌2株，鳥(niǎo)分枝桿菌1株。

2.3 192例結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐多藥檢測(cè)情況

DNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例，檢出野生型151例，耐藥者41例，總耐藥率21.4%；其中，檢出耐異煙肼（isoniazid，INH）單藥者15例（7.8%），耐利福平（rifampicin，RIF）單藥者19例（9.9%）；同時(shí)耐INH和RIF者7例（3.6%），其基因型分布見(jiàn)表1。

3 討論

MDR-TB是指同時(shí)對(duì)包括INH和RIF兩種或兩種以上抗結(jié)核藥物發(fā)生耐藥的結(jié)核分枝桿菌所致的結(jié)核病。傳統(tǒng)MDR-TB的表型診斷方法主要有絕對(duì)濃度法和比例法，上述兩種方法必須在獲得菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，耗時(shí)較長(zhǎng)且培養(yǎng)的敏感度較低，導(dǎo)致部分患者漏診或不能及時(shí)被檢出。DNA微陣列芯片技術(shù)在固相載體上很小面積內(nèi)包被多達(dá)千萬(wàn)個(gè)核酸分子，組成微點(diǎn)陣列，在一定條件下載體上的核酸分子可與來(lái)自標(biāo)本互補(bǔ)的核酸片段雜交，然后把標(biāo)本中的核酸片段進(jìn)行標(biāo)記，在專(zhuān)用的芯片閱讀儀上可檢測(cè)到雜交信號(hào)，敏感度和特異性較高。DNA微陣列芯片技術(shù)操作僅需兩步，即擴(kuò)增和雜交，可將檢測(cè)時(shí)間由傳統(tǒng)方法的2～3個(gè)月縮短到6h左右，檢測(cè)RIF和INH耐藥情況的同時(shí)還能完成菌種鑒定分型。

表1 耐藥結(jié)核桿菌DNA微陣列芯片法檢測(cè)結(jié)果

研究顯示，采用DNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)的INH和RIF總耐藥率為17.81%～27.5%，耐多藥率為6.85%，INH和RIF單耐藥率分別為13.3%、7.5%[1-4]。本研究DNA微陣列芯片技術(shù)共檢測(cè)245例患者，結(jié)核分枝桿菌檢出率78.4%，總耐藥率21.4%，INH、RIF耐藥率分別7.8%和9.9%，耐多藥率3.6%。本研究結(jié)果顯示，41例耐藥者基因突變位點(diǎn)前兩位的是katG315（G→C）突變型、rpoB531（C→T）突變型，其突變發(fā)生率分別為36.6%（15/41）和39.0%（16/41），與相關(guān)研究有所差異[7]。

國(guó)內(nèi)報(bào)道，臨床分離株藥物作用靶基因發(fā)生突變是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥的主要分子機(jī)制，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)96%耐RIF菌株的rpoB基因中一個(gè)81bp區(qū)域出現(xiàn)點(diǎn)突變；耐INH菌株中約70%與katG基因突變有關(guān)，20%～35%與inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)突變有關(guān)，katG/inhA位點(diǎn)總突變率為35.1%（33/94）[8-10]。

非結(jié)核分枝桿菌感染有逐年升高趨勢(shì)，由1984年的4.2%升至2010年的22.9%[9]。山東省2625株分離菌株檢出36株非結(jié)核分枝桿菌，占1.4%，其中29株為胞內(nèi)分枝桿菌（80.6%）[10]。北京市721株分離菌株檢出非結(jié)核分枝桿菌93株（12.9%），以膿腫分枝桿菌占首位[11]。上海市877株分離菌株P(guān)CR快速鑒定法檢出非結(jié)核分枝桿菌96株（10.9%）[12]。本研究結(jié)果中，非結(jié)核分枝桿菌占比2.9%（7/245），胞內(nèi)分枝桿菌居首位，其次為堪薩斯分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌。提示我國(guó)非結(jié)核分枝桿菌發(fā)病率有一定差異，可能與患者所在區(qū)域、生活環(huán)境和生活習(xí)性有關(guān)。

綜上所述，DNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)周期短，操作簡(jiǎn)單，能同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測(cè)和菌種鑒定，對(duì)MDR-TB的早期診斷和治療有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Application of microarray chip technology in clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis

Department of Clinical Laboratory, Binzhou Central Hospital, Binzhou 251700, Shandong, China

To explore the application of microarray chip technology in the clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB).Samples (125 sputum specimens and 120 strains isolated from sputum culture) were collected from 245 patients diagnosed with pulmonary tuberculosis in Binzhou Central Hospital from June 2020 to May 2021. Sputum samples were tested by DNA microarray chip technology and traditional culture method. DNA microarray chip technology was used to detect multidrug resistance and identify mycobacterium strains in sputum samples and isolated strains.The positive rates of 125 sputum samples were 58.4% (73/125) and 24.8% (31/125) by DNA microarray chip technology and sputum culture, respectively, and the difference between the two methods was statistically significant (2=14.520,<0.001). Using DNA microarray chip technology, 125 sputum samples and 120 isolated strains were detected. A total of 192 mycobacterium tuberculosis complex and 7 nontuberculous mycobacteria were detected. Among 192 cases of mycobacterium tuberculosis complex, 41 cases were drug resistant, including 15 cases resistant to isoniazid, 19 cases resistant to rifampicin and 7 cases resistant to both drugs. Nontuberculous mycobacteria included 4 cases Mycobacterium intracellulare, 2 case Mycobacterium kansasii and 1 case Mycobacterium avium.DNA microarray chip technology has a short detection cycle, can be used to detect multidrug resistance and strain identification of mycobacterium tuberculosis at the same time, and has great clinical application value for early diagnosis and treatment of MDR-TB.

Tuberculosis; Nontuberculous mycobacteria; Multidrug resistant tuberculosis; Isoniazid; Rifampicin

R372

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.018

張國(guó)翠，電子信箱：15215437913@163.com

（2023–01–15）

（2023–07–18）