張麗娜 梅燚 王薇薇 吳永成 陳長(zhǎng)軍 劉哲 沈峰 馮汝超 祖艷俠 鄭佳秋

摘要：辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)的主要病害之一，是一種由復(fù)合真菌類群引起的真菌性病害，多危害果實(shí)，嚴(yán)重降低辣椒品質(zhì)和市場(chǎng)價(jià)值，抗性品種培育是重要的育種目標(biāo)。通過對(duì)鹽城、連云港、南通地區(qū)辣椒種植區(qū)進(jìn)行炭疽病病原菌分離、純化，分析其形態(tài)特征，同時(shí)通過基因序列分析確定當(dāng)?shù)靥烤也?yōu)勢(shì)致病菌，以高致病力炭疽病優(yōu)勢(shì)致病菌尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）C18為接種菌，采用菌碟接種法對(duì)128份沿海地區(qū)耐鹽堿辣椒材料進(jìn)行抗炭疽病篩選。結(jié)果表明，沿海地區(qū)辣椒炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌為尖孢炭疽菌；羊角椒資源中，有7份高抗辣椒資源，有21份抗病資源，23份耐病資源，以漢豐一號(hào)作為對(duì)照，炭疽病抗性顯著優(yōu)于漢豐一號(hào)的羊角椒資源有23份，其中包括沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所最新登記的鹽椒4號(hào)品種；牛角椒資源中，有7份耐病資源。沿海地區(qū)炭疽病原菌多樣性調(diào)研和高抗炭疽病辣椒材料的篩選發(fā)掘?yàn)檠睾５貐^(qū)辣椒抗病育種和抗性基因發(fā)掘提供了堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒；炭疽??；致病菌；抗性鑒定

中圖分類號(hào)：S436.418.1+1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）13-0121-06

辣椒（Capsicum annum L.）是我國(guó)產(chǎn)值最大的蔬菜之一，且我國(guó)辣椒種植面積及產(chǎn)量均呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，是全球產(chǎn)量最多的地區(qū)。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2021年我國(guó)辣椒種植面積約82.7萬hm2，產(chǎn)量達(dá)2 013萬t（https：//www.fao.org/faostat/）。辣椒也是江蘇沿海地區(qū)主栽蔬菜作物，由于沿海地區(qū)土壤含鹽量高，辣椒風(fēng)味獨(dú)特［1］，深受消費(fèi)者青睞。但由于沿海地區(qū)辣椒的連年種植，辣椒生產(chǎn)過程中病害問題愈發(fā)嚴(yán)重，尤其是辣椒炭疽病發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，一般年份辣椒平均果實(shí)發(fā)病率為10%～15%，最嚴(yán)重時(shí)甚至達(dá)到50%以上［2］，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到辣椒的種植和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

目前，辣椒炭疽病的防治手段主要包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。但農(nóng)業(yè)防治效果有限，化學(xué)防治帶來的抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和健康問題日益嚴(yán)重，而生物防治手段尚不成熟，防治效果不穩(wěn)定，難以廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，因此推廣和使用抗病品種是辣椒生產(chǎn)上防治炭疽病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。優(yōu)質(zhì)抗炭疽病品種是發(fā)掘抗性基因的材料基礎(chǔ)，由于沿海地區(qū)辣椒品種的選育一直集中在耐鹽堿特性的篩選，免疫和高抗炭疽病辣椒資源匱乏，使得沿海地區(qū)辣椒炭疽病抗病育種一直未取得有效突破，迫切需要在沿海地區(qū)耐鹽堿種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上篩選炭疽病高抗種質(zhì)資源。

辣椒炭疽病主要侵染辣椒葉片和果實(shí)［3］。葉片病斑初為褪綠水漬狀斑點(diǎn)，逐漸變?yōu)楹稚?，病斑近圓形而中間為淡灰色。果實(shí)上發(fā)病，先產(chǎn)生水浸狀黃褐色斑，擴(kuò)大后呈圓形或不規(guī)則形斑、稍凹陷，具稍隆起的同心環(huán)狀斑，斑上生黑色或紅色小點(diǎn)，潮濕時(shí)溢出淡紅色黏質(zhì)物（病菌的分生孢子盤和分生孢子），干燥時(shí)病斑常干縮似羊皮紙，易破裂［2］。不同地區(qū)辣椒炭疽病病菌種類不同，同一地區(qū)不同辣椒品種辣椒炭疽病菌也不同［4-6］，已報(bào)道的辣椒炭疽病的病原菌主要為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporoides）、黑色炭疽菌（C. nigrum）、黑點(diǎn)炭疽菌（C. capsici）、尖孢炭疽菌（C. acutatum），但沿海地區(qū)辣椒炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌尚不明確。確定沿海地區(qū)辣椒炭疽優(yōu)勢(shì)病原菌，對(duì)制定辣椒炭疽病的防治方案及選育抗病品種具有重要的意義。

針對(duì)上述問題，本研究自江蘇鹽城、連云港、南通地區(qū)采集了辣椒炭疽病病樣，分離鑒定沿海地區(qū)辣椒炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌小種，并在沿海地區(qū)耐鹽堿種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上篩選出能夠高抗炭疽病當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)致病小種的種質(zhì)資源。研究結(jié)果旨在為沿海地區(qū)優(yōu)質(zhì)辣椒炭疽病抗病品種的培育建立優(yōu)質(zhì)的抗病種質(zhì)資源庫，對(duì)滿足生產(chǎn)需求、提高辣椒產(chǎn)能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試標(biāo)準(zhǔn)菌株C18為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室陳長(zhǎng)軍教授提供的尖孢炭疽病菌（C. acutatum）高致病力菌株，該菌株分離自江蘇鹽城。尖孢炭疽菌株轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d后備用。

本研究以江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所多年選育的辣椒品系為試材，穴盤育苗，塑料大棚栽培，采收成熟期無病、整齊的青果接種，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)16果，每果根據(jù)果實(shí)大小接種1～3處。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒炭疽病菌菌株分離

辣椒病樣2021年采集自江蘇鹽城、連云港和南通。病樣采回后從病健交界處切取小塊組織，經(jīng)75%乙醇浸泡3 s后，用滅菌水沖洗，晾干，置于含有硫酸鏈霉素的PDA平板上培養(yǎng)5 d，取菌落邊緣的小塊菌碟轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，培養(yǎng)5 d后，保存，備用。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在26 ℃下于PDA平板培養(yǎng)5 d，菌落邊緣取5 mm大小菌餅至新PDA平板，26 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)生長(zhǎng)變化。光學(xué)顯微鏡下觀察炭疽病菌的分生孢子大小、形態(tài)等顯微特征。

1.2.3 病原菌的分子鑒定

采用真菌DNA快速提取試劑盒（廣州索萊寶生物科技有限公司）提取菌株DNA，0.8%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)提取產(chǎn)物，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用ITS1/ITS4通用引物對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行序列比對(duì)，在MEGA 11軟件中采用Clustal W方法進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)而采用最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，簡(jiǎn)稱MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析親緣關(guān)系。

1.2.4 病原菌的致病力測(cè)定

病原菌致病力測(cè)定采用針刺法接種辣椒［7］。選取分離到的16株尖孢炭疽病菌和C18菌株到PDA平板，5 d后從菌落外周處取直徑5 mm菌碟。用滅菌的1 mm注射器針頭在漢豐一號(hào)辣椒表面人為制造深約為1 mm的傷口，將制備好的菌碟隨機(jī)接種在辣椒傷口表面，以無菌瓊脂塊接種作為對(duì)照，每個(gè)處理6次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)果實(shí)。接種好的辣椒放置于26 ℃培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)5 d后記錄病斑直徑。

1.2.5 炭疽病抗性鑒定

辣椒果期抗病性鑒定采用針刺法［7-8］，略有改進(jìn)。將活化的尖孢炭疽菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上，5 d后從菌落外周1/3處制備菌碟。試驗(yàn)于2021年進(jìn)行，辣椒材料種植于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所新洋試驗(yàn)基地，采集轉(zhuǎn)色期果實(shí)，75%乙醇表面消毒并晾干后，用直徑1 mm的注射器針頭刺穿果實(shí)表皮，制造深約1 mm的傷口，將制備好的菌碟隨機(jī)接種在辣椒傷口表面，每種品系（種）辣椒設(shè)置3～6次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)果實(shí)。接種好的辣椒放置于26 ℃培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)5 d后檢查結(jié)果。

成熟果病級(jí)調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑直徑≤0.5 cm；2級(jí)，病斑直徑>0.5～1.0 cm；3級(jí)，病斑直徑>1.0～2.0 cm，病斑上無霉或有少量霉層；4級(jí)，病斑直徑>2.0～3.0 cm，病斑上霉層較多；5級(jí)，病斑直徑>3.0 cm，病斑上有大量霉層。

病害嚴(yán)重度=∑（發(fā)病植株數(shù)×病級(jí)數(shù)）/（總植株數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）×100%；

品系群體抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)：高抗（HR），病害嚴(yán)重度0～20.0；抗?。≧），病害嚴(yán)重度20.1～40.0；耐?。═），病害嚴(yán)重度40.1～50.0；感?。⊿），病害嚴(yán)重度>50.0。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，在Excel中進(jìn)行基本處理后，使用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析，使用LSD Test（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的菌落特征和形態(tài)

試驗(yàn)共分離18個(gè)菌株。經(jīng)ITS鑒定，其中16株為尖孢炭疽病菌（C. acutatum），1株為鏈格孢屬（Alternaria spp.）菌株，1株為鐮刀菌屬（Fusarium spp.）菌株。因此，沿海地區(qū)炭疽病主要致病菌為尖孢炭疽病菌。尖孢炭疽菌引起的辣椒炭疽病果上病斑褐色，水漬狀，呈橢圓形；菌落初期呈灰白色，絨毛狀，后期呈灰色，輪紋狀（圖1）。

2.2 病原菌的分子鑒定

將分離得到的16株尖孢炭疽菌的rDNA-ITS序列與炭疽菌屬所得序列進(jìn)行序列比對(duì)和尖孢炭疽菌3株代表菌株及C18、膠孢炭疽菌、黑色炭疽菌、黑點(diǎn)炭疽菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)16株尖孢炭疽病菌與尖孢炭疽菌KJ627844、AJ749679、MH818319、C18聚在同一分支，親緣關(guān)系置信度99%，膠孢炭疽菌、黑色炭疽菌、黑點(diǎn)炭疽菌聚在另一分支（圖2）。

2.3 病原菌致病力測(cè)試

將尖孢炭疽菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C18和16株分離到的尖孢炭疽菌接種到漢豐一號(hào)辣椒上，根據(jù)漢豐一號(hào)的病斑大小確定分離得到的幾株病原菌的致病力。結(jié)果表明（表1），標(biāo)準(zhǔn)菌株C18致病力和YC14、NT01、NT02、LYG03致病力相差不大，病斑直徑約為10 mm；YC11致病力最強(qiáng)，病斑直徑為14.05 mm；LYG18致病力最弱，病斑直徑為2.55 mm。

2.4 沿海地區(qū)耐鹽辣椒品系對(duì)炭疽病抗性鑒定

利用尖孢炭疽病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C18對(duì)110份羊角椒資源和18份牛角椒資源進(jìn)行炭疽抗性篩選（圖3）。結(jié)果表明，羊角椒資源（表2）中，有12份資源辣椒平均病斑直徑＜5 mm，有23份資源平均病斑直徑滿足5 mm≤R＜10 mm，剩余75份資源平均病斑直徑≥10 mm；牛角椒資源（表3）中，6份平均病斑直徑滿足5 mm≤R＜10 mm的資源，其他12份資源平均病斑直徑≥10 mm。根據(jù)品系抗病性劃分，羊角椒資源中，高抗辣椒資源有YHS1715、YHS0519、YHS1512、YHS0498、YHS1198、YHS2131、YHS1037共7份，抗病資源有YHS0247、YHS1933、YHS1c10、YHS5471、YHS1372、YHS0972、YHS2551、YHS3852、YHS9823、YHS6621、YHS5523、鹽椒4號(hào)、YHS4131、YHS5522、YHS85a1、YHS5520、YHS3861、YHS5614、YHS3121、YHS5243、YHS3833共21份，23份耐病資源，59份感病資源；牛角椒資源中，7份耐病資源，11份感病資源。目前，羊角椒是沿海地區(qū)廣泛種植的辣椒，其中漢豐一號(hào)是沿海地區(qū)種植規(guī)模最大，經(jīng)濟(jì)效益最高的羊角椒品種，以漢豐一號(hào)作為對(duì)照，炭疽病抗性顯著優(yōu)于漢豐一號(hào)的有23份羊角椒資源，其中包括了沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所最新登記的鹽椒4號(hào)品種，是目前最優(yōu)的值得推廣的抗炭疽病辣椒品種。

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)抗炭疽病辣椒品種十分稀缺，種質(zhì)資源較少。張世才等對(duì)74份美國(guó)、西班牙等的辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行尖孢炭疽菌的抗性鑒定，共篩選到2份高抗材料和2份抗病材料，抗病資源的僅占5.4%［9］。馬蓉群等以青島當(dāng)?shù)刂饕虏【t色炭疽菌對(duì)收集的73份辣椒資源進(jìn)行炭疽病抗性鑒定，篩選到7份抗病材料，未篩選到免疫和高抗材料，抗病材料占比9.6%［10］。呂玲玲等對(duì)全國(guó)不同地區(qū)采集到的62份辣椒材料進(jìn)行炭疽病抗性鑒別，共篩選到2份免疫資源，3份高抗資源，5份抗病資源，抗病性材料占比16.1%［11］。種質(zhì)資源是育種工作的基石，而篩選抗病材料是抗病性育種的關(guān)鍵，所以對(duì)耐炭疽病辣椒資源的篩選與鑒定，對(duì)辣椒抗病性選育有重要意義。對(duì)于辣椒耐炭疽病材料的室內(nèi)鑒定，國(guó)內(nèi)多采取苗期噴霧接種的方式，在實(shí)際生產(chǎn)中，由于辣椒炭疽病菌主要在結(jié)果期侵染果實(shí)，因此，以接種離體果實(shí)的方法來評(píng)價(jià)辣椒對(duì)炭疽病抗性于辣椒育種而言更為準(zhǔn)確［12］。同時(shí)，辣椒炭疽是一種復(fù)合侵染的真菌性病害，不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)致病菌存在差異，致病性也各不相同［3］，這也為炭疽病抗病材料的篩選帶來巨大的挑戰(zhàn)。

目前，辣椒炭疽病抗病性的鑒定主要依賴接種后觀察發(fā)病，外觀表現(xiàn)是受基因控制的，所以通過分子輔助篩選材料是否具備抗病基因是最可靠、最直接的鑒定材料抗病性的方法［13-14］。根據(jù)正向遺傳學(xué)研究思路，抗性基因的篩選，首先要基于抗原材料，構(gòu)建分離群體，結(jié)合抗性表型和分子標(biāo)記分離情況，找到與炭疽病抗性緊密連鎖的基因，為辣椒抗炭疽病育種提供依據(jù)［15-17］。

本研究對(duì)沿海地區(qū)辣椒炭疽病果實(shí)進(jìn)行了病原菌分離純化和鑒定，共分離得到16株尖孢炭疽病菌，1株鏈格孢屬和1株鐮刀菌屬病原真菌，因此，沿海地區(qū)辣椒炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌為尖孢炭疽病菌。為篩選適應(yīng)沿海地區(qū)的抗炭疽病辣椒種質(zhì)資源，本研究對(duì)128份耐鹽辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行尖孢炭疽菌抗性篩選，共篩選出7份高抗資源，21份抗病資源，為后期辣椒抗炭疽病品種的研發(fā)及抗性基因的遺傳和定位研究提供了材料基礎(chǔ)。本次鑒定僅用沿海地區(qū)主要致病菌尖孢炭疽病菌進(jìn)行接種，但炭疽病的田間發(fā)病還存在其他致病菌，此次篩選到的抗病材料仍需進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和篩選，抗病資源的抗病機(jī)制及抗病遺傳規(guī)律尚不清楚，是下一步的研究重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］張海英，吉雪花，李慧姬，等. 色素辣椒果實(shí)品質(zhì)對(duì)鹽、堿脅迫的差異響應(yīng)［J］. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，39（2）：198-203.

［2］鄭 潔，周成麗，趙東風(fēng)，等. 辣椒炭疽病的發(fā)病癥狀與防治方法［J］. 上海蔬菜，2021（3）：39-40.

［3］賀字典，薛制國(guó)，薛 雨，等. 辣椒炭疽病菌種類及主栽品種抗病性鑒定［J］. 河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2020，34（2）：5-9，18.

［4］王 妮，尹顯慧，彭麗娟，等. 辣椒炭疽病病原鑒定及其殺菌劑毒力測(cè)定［J］. 植物保護(hù)，2019，45（4）：216-223.

［5］劉方玲. 四川辣椒炭疽病的病原學(xué)研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：1-52.

［6］歐陽超，劉思珍，滿益龍，等. 辣椒炭疽病菌效應(yīng)因子NIS1-PCR-RFLP標(biāo)記系統(tǒng)的建立［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，52（9）：2473-2481.

［7］毛愛軍，胡 洽，耿三省. 辣椒炭疽病抗病性鑒定技術(shù)及利用［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2004，19（2）：87-91.

［8］沈會(huì)芳，楊祁云，謝祥恩，等. 辣椒尖孢炭疽菌生物學(xué)特性研究［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，48（5）：110-117.

［9］張世才，李怡斐，王春萍，等. 辣椒種質(zhì)尖孢炭疽菌抗性鑒定與評(píng)價(jià)［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2022，49（4）：885-892.

［10］馬榮群，黃 粵，宋正旭，等. 辣椒炭疽病抗性資源篩選［J］. 北方園藝，2008（9）：186-187.

［11］呂玲玲，李 威，谷 會(huì)，等. 辣椒資源對(duì)炭疽病的抗性比較研究［J］. 種子，2014，33（2）：60-62.

［12］林 清，呂中華，黃任中，等. 辣椒炭疽病抗性鑒定方法研究［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，19（6）：1071-1073.

［13］Lee J，Hong J H，Do J W，et al. Identification of QTLs for resistance to anthracnose to two Colletotrichum species in pepper［J］. Journal of Crop Science & Biotechnology，2010，13（4）：227-333.

［14］deAlmeidaCLP，dosSantosB C，Sudré C P，et al. Genotype-

Ideotype distance index and multivariate analysis to select sources of anthracnose resistance in Capsicum spp.［J］. European Journal of Plant Pathology，2020，156（1）：223-236.

［15］Sun C Y，Mao S L，Zhang Z H，et al. Resistances to anthracnose （Colletotrichum acutatum） of Capsicum mature green and ripe fruit are controlled by a major dominant cluster of QTLs on chromosome P5［J］. Scientia Horticulturae，2015，181：81-88.

［16］Kethom W，Mongkolporn O. New QTLs for anthracnose resistance identified in Capsicum baccatum ‘PBC80-derived recombinant inbred lines［J］. Euphytica，2021，217（6）：128.

［17］Guo G J，Wang S B，Liu J B，et al. Rapid identification of QTLs underlying resistance to Cucumber mosaic virus in pepper （Capsicum frutescens）［J］. Theoretical and Applied Genetics，2017，130（1）：41-52.