董莉，董文閣，劉曉偉，劉念

（遼寧省旱地農(nóng)林研究所，遼寧 朝陽 122000）

葡萄灰霉病是葡萄生產(chǎn)中的主要病害之一，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起[1]。該病害主要侵染葡萄葉和果實(shí)，葡萄一旦染病后病程發(fā)展迅速，在適宜發(fā)病的環(huán)境條件下幾天后即發(fā)生落粒和果實(shí)軟腐，然后果皮表面產(chǎn)生灰色至淺黃色菌絲和分生孢子，較難控制，最終影響葡萄產(chǎn)量、品質(zhì)[2]。葡萄灰霉病主要通過空氣傳播，田間溫度、濕度條件適宜即可發(fā)生，該病害目前防治仍以化學(xué)防治為主。隨著藥劑使用時間的增長，抗藥性問題開始屢見報道。紀(jì)明山等[3]報道了遼寧省采集到的番茄灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率達(dá)到70%以上，對嘧霉胺的抗性頻率達(dá)到100%，而2006 年當(dāng)?shù)貙︵酌拱返目剐灶l率僅為17.14%[4]。郝永娟等[5]于2015 年報道了天津地區(qū)番茄灰霉病菌對乙霉威的抗性頻率為42.86%。

朝陽地區(qū)具有葡萄栽培適宜的光熱等條件，無霜期短、雨雪天氣少而日照充足、晝夜溫差大、空氣濕度低、土壤適宜，有利于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的鮮食葡萄，栽培方式以露地栽培、溫室促早栽培和冷棚秋延栽培為主，每年4—12 月持續(xù)供應(yīng)鮮食葡萄。朝陽地區(qū)作為環(huán)渤海設(shè)施農(nóng)業(yè)種植區(qū)的重要組成，有著龐大的設(shè)施資源，葡萄種植是當(dāng)?shù)仄胶夥N植結(jié)構(gòu)、降低設(shè)施蔬菜大規(guī)模種植風(fēng)險的有效途徑。考慮到腐霉利、乙霉威、嘧霉胺是灰霉病防治的主要用藥，3種藥劑在朝陽地區(qū)的抗性情況并不明確，為了更好地防治該病害，科學(xué)選擇防治藥劑，該文對3 種藥劑進(jìn)行了抗藥性頻率和抗藥性類型分析，為當(dāng)?shù)鼗颐共』瘜W(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。2022 年9—10 月，在朝陽市6 個縣市區(qū)葡萄種植園收集葡萄果實(shí)，采用單菌落分離法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行病原菌分離，獲得菌樣123 份，放于凍存管內(nèi)，4℃冰箱保存。

1.1.2 供試藥劑。葡萄糖；瓊脂；K2HPO4；MgSO4·7H2O；HCl；KCl；FeSO4·7H2O；L-天冬酰胺；50%腐霉利可濕性粉劑（日本住友化學(xué)株式會社）；80%嘧霉胺水分散粒劑（山東綠豐農(nóng)藥有限公司）；99.1%乙霉威原藥（購于沈陽化工研究院）。

腐霉利和嘧霉胺溶于無菌水內(nèi)，配置成1 000 μg/L母液；乙霉威溶于適量丙酮后加入無菌水，配置成1 000 ug/L母液。藥液保存在棕色試劑瓶內(nèi)，4℃冰箱保存待用。

1.1.3 供試儀器。電子天平、分析天平、滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、冰箱；鑷子、打孔器、挑針、培養(yǎng)皿、棕色試劑瓶、錐形瓶、凍存管、微波爐、電磁爐、封口膜等實(shí)驗(yàn)室常用耗材。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備。

（1）PDA 培養(yǎng)基：將馬鈴薯洗凈去皮，取200 g 切成小方塊，加入去離子水煮沸20~30 min，4 層紗布過濾，待濾液降溫后，加入稱量好的17~20 g 瓊脂粉、20 g 葡萄糖，加水定容至1 000 mL，重新倒入鍋中煮沸融化，然后分裝到錐形瓶中，滅菌鍋121℃，滅菌30 min；

（2）asp 培養(yǎng)基：K2HPO4及MgSO4·7H2O 各1 g 分別溶于30 mL 去離子水中，將兩者混合后用10 mol/L HCl 溶解沉淀物，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，L-天冬酰胺2 g，葡萄糖22 g，瓊脂18~20 g，加去離子水至1 L，分裝到錐形瓶中，滅菌鍋121℃，滅菌30 min[6]。

1.2.2 病樣采集和分離。在葡萄種植區(qū)購買葡萄果穗，裝入未使用過的自封袋內(nèi)，密封帶回。25℃放置5~7 d，待病果長出較多孢子后，用滅菌牙簽蘸取孢子，采用劃線法在水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 獲得單菌落，轉(zhuǎn)移至PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，切取適當(dāng)大小菌塊放于凍存管內(nèi)，封口膜封口，放于4℃冰箱保存待用。

1.2.3 葡萄灰霉病菌對腐霉利、嘧霉胺、乙霉威抗藥性測定。采用最低抑制濃度法（MIC）開展對腐霉利、嘧霉胺、乙霉威3 種藥劑的抗藥性頻率檢測，鑒別濃度分別為腐霉利5 μg/mL，嘧霉胺1 μg/mL，乙霉威1μg/mL[7]。將培養(yǎng)基降溫至60℃左右時，加入待測藥劑，倒入9 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)制成含藥平板，每皿倒入培養(yǎng)基7~10 mL。將待測菌樣在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，用5 mm 打孔器打取菌餅，放入含藥平板上，每皿3 個，3 d 后觀察生長情況。在鑒別濃度下，能夠正常生長的為抗性菌株，不能正常生長的為敏感菌株。計(jì)算抗性菌株頻率：嘧霉胺用L-asp 培養(yǎng)基，腐霉利、乙霉威用PDA 培養(yǎng)基。

抗性頻率（%）=抗性菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄灰霉病對腐霉利的抗性

對采集到的123 株葡萄灰霉病菌開展腐霉利抗性頻率試驗(yàn)（表1），結(jié)果顯示，朝陽地區(qū)葡萄灰霉病對腐霉利的抗性菌株數(shù)為103 株，抗性頻率為83.74%，抗性頻率最低為朝陽縣的57.14%，最高為龍城區(qū)的95.65%。

表1 葡萄灰霉病菌對腐霉利抗性頻率檢測

2.2 葡萄灰霉病對乙霉威的抗性

從表2 可以看出，采集到的葡萄灰霉病菌株對乙霉威的抗性頻率為57.72%，抗性菌株數(shù)71 株，不同地區(qū)菌株的抗性頻率不同，其中喀左縣抗性頻率最低，建平縣抗性頻率最高。

表2 葡萄灰霉病菌對乙霉威抗性頻率檢測

2.3 葡萄灰霉病對嘧霉胺的抗性

從表3 可以看出，123 株葡萄灰霉病菌對嘧霉胺的抗性菌株數(shù)為116 株，抗性頻率為94.31%，雖然不同地區(qū)灰霉病菌抗性頻率不同，但最低抗性頻率也達(dá)到92.11%，其中建平縣和朝陽縣采集的菌株對嘧霉胺全部表現(xiàn)抗藥性。

表3 葡萄灰霉病菌對嘧霉胺抗性頻率檢測

2.4 葡萄灰霉病對3 種藥劑的抗性類型

從表4 可以看出，采集的123 株葡萄灰霉病菌株對腐霉利、乙霉威、嘧霉胺的抗藥性類型共有6 種：ProSDieSPyrR、ProRDieSPyrR、 ProRDieRPyrR、 ProSDieRPyrR、 ProRDieSPyrS、ProRDieRPyrS，其中表現(xiàn)三重抗性菌株占比47.97%，雙重抗性菌株占比41.47%（RSR 類型31.71%，SRR 類型8.13%，RRS 類型1.63%），單一抗性類型占比8.94%（SSR 類型6.50%，RSS 類型2.44%）。

表4 朝陽地區(qū)葡萄灰霉病菌對3 種殺菌劑的抗性類型及分布

3 結(jié)論與討論

腐霉利、乙霉威、嘧霉胺是朝陽市葡萄灰霉病防治使用多年的藥劑，多年的藥劑選擇壓力下，病菌極易產(chǎn)生抗藥性，及時了解灰霉病菌抗性發(fā)展問題，對當(dāng)?shù)仄咸鸦颐共》乐尉哂兄匾闹笇?dǎo)意義。該試驗(yàn)結(jié)果表明，朝陽市葡萄灰霉病對嘧霉胺已產(chǎn)生普遍抗藥性，對腐霉利的抗藥性也達(dá)到了83.74%，乙霉威的抗性頻率稍低，但也達(dá)到57.72%。被檢測的123 株葡萄灰霉病菌株表現(xiàn)了6 種抗性類型（RRR、RSR、SRR、RRS、SSR、RSS），其中對3 種被測藥劑表現(xiàn)三重抗藥性的病菌占比最高，達(dá)到47.97%，雙重抗性菌株達(dá)到41.47%，說明朝陽地區(qū)葡萄灰霉病菌對3 種藥劑的抗藥性發(fā)生較為普遍。為更好地防治葡萄灰霉病，保障葡萄產(chǎn)量和效益，建議生產(chǎn)上應(yīng)減少嘧霉胺、腐霉利的使用次數(shù)，使用其他作用方式的藥劑進(jìn)行代替，同時注意輪換用藥，不得隨意加大藥劑使用濃度。