黃子宇 趙必增

腰背痛是臨床常見的一類肌肉骨骼癥狀，該癥狀與椎間盤退變（IDD）密切相關(guān)[1]。椎間盤是位于椎體之間的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，包括髓核、纖維環(huán)和軟骨終板，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使脊柱具有彎曲能力和減震性能。隨著IDD 的進(jìn)展，髓核和纖維環(huán)的抗壓結(jié)構(gòu)和抗壓能力發(fā)生退變。當(dāng)前針對(duì)IDD 的常見療法有手術(shù)治療和保守治療，手術(shù)治療主要包括髓核摘除和椎間融合術(shù)，但都只能緩解IDD臨床癥狀卻無法干預(yù)IDD 的進(jìn)程，尋找更為有效的延緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD 進(jìn)程的治療方案是有潛力的研究方向。隨著干細(xì)胞研究不斷的深入，從細(xì)胞上清液中分離獲取的干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡已成為干細(xì)胞潛在的替代品。許多研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡可促進(jìn)血管再生，減輕炎癥反應(yīng)，抑制凋亡。因此，干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡在延緩IDD 方面也受到了越來越多的關(guān)注。本文就干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡在IDD 中的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 IDD 病理機(jī)制及治療

1.1 IDD 病理機(jī)制

椎間盤由髓核和纖維環(huán)組成，是脊柱的承重和緩沖單元。髓核細(xì)胞位于內(nèi)盤，主要產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)及維持其平衡。當(dāng)機(jī)體發(fā)生IDD 變時(shí)，髓核中蛋白多糖含量減少，髓核膠樣物質(zhì)脫水，導(dǎo)致髓核和纖維環(huán)的抗壓結(jié)構(gòu)異變和抗壓能力下降[2]。研究認(rèn)為，IDD 進(jìn)展包括髓核細(xì)胞消耗和細(xì)胞外基質(zhì)降解，軟骨終板對(duì)纖維環(huán)內(nèi)層和髓核細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)減少[3-4]。

1.2 IDD 當(dāng)前的治療

目前臨床上IDD 常規(guī)治療方法有保守治療和手術(shù)治療，如果保守治療不能緩解疼痛且達(dá)到手術(shù)指征，可以考慮手術(shù)。然而，脊柱融合術(shù)、椎間盤摘除術(shù)等外科手術(shù)是侵入性的，通常需要較長的術(shù)后恢復(fù)時(shí)間且可能出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥，術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高[5]。藥物治療和手術(shù)治療只能緩解腰疼癥狀，未能從根本上延緩IDD 的進(jìn)程。因此，許多研究集中于促進(jìn)椎間盤再生，治療方法包括生長因子療法、基因療法和干細(xì)胞療法。

生長因子療法是將生長因子直接注射到椎間盤中，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，或延緩抑制炎癥反應(yīng)變性。目前常應(yīng)用的生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）和轉(zhuǎn)化生成因子（TGF）-[6]。生長因子療法的主要局限性是生物半衰期短，只有數(shù)小時(shí)或數(shù)天，且生長因子在惡劣的退變椎間盤微環(huán)境中很難維持活力，這些都限制了生長因子在IDD 治療中的應(yīng)用。

基因療法則是通過載體將修復(fù)基因轉(zhuǎn)染至椎間盤內(nèi)的髓核、終板、纖維環(huán)細(xì)胞中，或?qū)⒓?xì)胞取出，改變其特定的基因，再重新植入椎間盤內(nèi)。一旦基因成功轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞上，延緩IDD 的效果將長期存在。然而，基因治療涉及遺傳物質(zhì)主動(dòng)轉(zhuǎn)移，通常使用病毒載體，存在發(fā)生病毒突變、全身病毒感染、免疫反應(yīng)等病毒相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

干細(xì)胞療法是將各種干細(xì)胞注射到退化的椎間盤中，通過移植干細(xì)胞增殖、分化來調(diào)控和平衡椎間盤內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)椎間盤再生。目前用于治療IDD 的干細(xì)胞有脂肪源性干細(xì)胞（ADSC）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）、髓核間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及肌肉源性干細(xì)胞等[7-8]。BMSC即使在不利條件下也能夠保持顯著的高生存能力，是目前用于IDD 干細(xì)胞療法中最常用的干細(xì)胞[9]。研究顯示，BMSC 可抑制細(xì)胞凋亡水平，從而改善椎間盤變性[10]。Zhou 等[11]將BMSC、ADSC 和纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)處理，結(jié)果表明Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖在BMSC、ADSC 中均表達(dá)上調(diào)，且可分化為纖維環(huán)樣細(xì)胞，但BMSC 修復(fù)纖維環(huán)的效果優(yōu)于ADSC。然而，隨著IDD 的發(fā)展，椎間盤中所含的干細(xì)胞數(shù)量和遷移能力都因退化椎間盤微環(huán)境惡化而下降[12]。此外，椎間盤微環(huán)境與干細(xì)胞所需的生長環(huán)境有很大不同[13]，導(dǎo)致移植細(xì)胞在退化椎間盤惡劣微環(huán)境中缺乏完全的再生反應(yīng)，難以生存，酸性pH[6]和高滲[14]會(huì)嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞活力和表型。

越來越多的研究表明，干細(xì)胞延緩IDD 進(jìn)展的功能大部分是通過旁分泌途徑實(shí)現(xiàn)[8]，而干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡是旁分泌途徑的重要組成部分，它們是源自于供體干細(xì)胞釋放的由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的納米顆粒，其中含有多種生物活性物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、RNA 等）[15]。干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡在髓核再生和椎間盤微環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用[16]，如抑制髓核細(xì)胞凋亡、熱解、異常神經(jīng)侵襲，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)合成及髓核細(xì)胞增殖和自噬，減輕炎癥反應(yīng)，從而抑制或延緩IDD。

2 干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡治療IDD

2.1 細(xì)胞外囊泡特性與功能

細(xì)胞外囊泡包括小細(xì)胞外囊泡和微囊泡等。小細(xì)胞外囊泡是作為細(xì)胞之間通訊的關(guān)鍵信使，包含多種功能蛋白、miRNA、mRNA 及信號(hào)脂質(zhì)等[17]。小細(xì)胞外囊泡直徑一般為30～150 nm，且具有性質(zhì)穩(wěn)定、易獲取、易保存、易轉(zhuǎn)化、無免疫原性等特點(diǎn)。

脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸是細(xì)胞外囊泡的主要功能成分。脂質(zhì)主要位于囊泡膜上，包括膽固醇、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂等。除了維持小細(xì)胞外囊泡的生物穩(wěn)定性外，脂質(zhì)還參與了小細(xì)胞外囊泡的形成和釋放等生物過程[18]。小細(xì)胞外囊泡還富含各種蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞骨架成分、四環(huán)素、熱休克蛋白及其他類型的蛋白質(zhì)[19]。其中，Alix 和Tetraspanin 蛋白如CD81、CD9 和CD63 是小細(xì)胞外囊泡的標(biāo)記[20]。小細(xì)胞外囊泡可通過與細(xì)胞膜融合，將其攜帶的功能核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等傳遞到受體細(xì)胞，進(jìn)而引起受體細(xì)胞功能、活性改變，促使細(xì)胞間的物質(zhì)交換與信息交流[21-22]。鑒于小細(xì)胞外囊泡的功能與優(yōu)勢，注射攜帶有特定基因及治療藥物的小細(xì)胞外囊泡可能成為延緩IDD 的治療手段[23]。

2.2 干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡延緩IDD 的機(jī)制

2.2.1 促進(jìn)基質(zhì)合成

Xiang 等[24]將源自人尿源性干細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡與退變的髓核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)處理，結(jié)果表明隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞增殖顯著增加；細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原表達(dá)水平與共培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，而與退變相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）表達(dá)水平與培養(yǎng)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，提示BMSC 衍生的小細(xì)胞外囊泡可起到促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡的作用。

Zhang 等[25]研究證實(shí)，經(jīng)含miR-15a 的小細(xì)胞外囊泡處理的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞可上調(diào)蛋白聚糖、Ⅱ型膠原mRNA 和蛋白水平，同時(shí)下調(diào)血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶（ADAMTS）4/5、MMP-3/13 mRNA 和蛋白水平，通過磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和Wnt3a/ -連環(huán)蛋白軸下調(diào)MMP-3 促進(jìn)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化。

退行性椎間盤組織中的自噬功能障礙是細(xì)胞死亡的主要原因，而自噬是調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞間基質(zhì)代謝的重要途徑[26]。研究證實(shí)，自噬激活可以促進(jìn)髓核細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡釋放，從而防止髓核細(xì)胞基質(zhì)降解；自噬激活可通過攜帶miR-27a的小細(xì)胞外囊泡延緩IDD 進(jìn)程，其在白細(xì)胞介素（IL）-1 刺激下可抑制MMP-13 表達(dá)[27]。

2.2.2 減輕細(xì)胞凋亡反應(yīng)

終板軟骨細(xì)胞凋亡和鈣化可導(dǎo)致椎間盤內(nèi)營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，加重椎間盤變性，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的小細(xì)胞外囊泡可顯著降低終板細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（Runx2）等因子表達(dá)水平，其潛在機(jī)制可能與miR-31-5p/活化轉(zhuǎn)錄因子（ATF）6/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激途徑調(diào)節(jié)有關(guān)[28]。

Zhu 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 衍生的小細(xì)胞外囊泡通過靶向混合譜系酶3（MLK3）傳遞miR-142-3p 來抑制髓核細(xì)胞的凋亡。Yuan 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的小細(xì)胞外囊泡通過靶向甲基轉(zhuǎn)移酶樣14(METTL14)有效提高髓核細(xì)胞的活力并避免焦亡。METTL14 在IDD 患者髓核細(xì)胞中高度存在，其以胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）-2 依賴性方式穩(wěn)定NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（NLRP）3 mRNA。升高的NLRP3水平導(dǎo)致IL-1 和IL-18 水平上調(diào)，并引發(fā)髓核細(xì)胞死亡。這種致病軸可能被人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的小細(xì)胞外囊泡阻斷，小細(xì)胞外囊泡攜帶的miR-26a-5p 可以直接降解METTL14。

Cheng 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 衍生的小細(xì)胞外囊泡可有效抑制腫瘤壞死因子（TNF）- 誘導(dǎo)髓核細(xì)胞的凋亡過程，這可能與其小細(xì)胞外囊泡攜帶的miR-21 經(jīng)PI3K/Akt 信號(hào)通路靶向磷酸酶與緊張素同系物（PTEN），從而轉(zhuǎn)入髓核細(xì)胞相關(guān)。

2.2.3 抑制炎癥反應(yīng)

作為椎間盤變性的征兆之一，炎癥總是伴隨著促炎因子的釋放，它是導(dǎo)致椎間盤源性疼痛的關(guān)鍵因素。炎癥因子如TNF- 、IL、一氧化氮和前列腺素E2 的相互作用和異常表達(dá)可引起炎癥并加速IDD[32]。隨著炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，來自背根神經(jīng)節(jié)的免疫細(xì)胞和疼痛感應(yīng)神經(jīng)纖維開始浸潤受損的椎間盤組織。一旦髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞開始釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，疼痛的神經(jīng)纖維就會(huì)受到刺激并開始傳遞疼痛。此外，炎癥因子還可以加速細(xì)胞衰老及細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白表達(dá)，并抑制細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)分子表達(dá)以增強(qiáng)退行性 過程[33]。

Cui 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p 在IDD 髓核組織中表達(dá)下調(diào)；干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡通過將所含的miR-129-5p 遞送到髓核細(xì)胞抑制髓核細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解，同時(shí)降低巨噬細(xì)胞M1 型極化程度。

此外，小細(xì)胞外囊泡可抑制H2O2誘導(dǎo)髓核細(xì)胞炎癥因子如IL-6、一氧化氮合酶（NOS）表達(dá)，從而在減輕炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用[35]。高級(jí)糖基化終產(chǎn)物（AGE）與炎癥、代謝功能障礙和ER 應(yīng)激密切相關(guān)，通常積聚在衰老和退行組織中，尤其是在富含膠原蛋白的組織中，AGE 積累可促進(jìn)C/EBP 同源蛋白（CHOP）表達(dá)和髓核細(xì)胞受損[36]。Liao 等[37]通過AGE 誘導(dǎo)人髓核細(xì)胞引發(fā)ER 應(yīng)激，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的小細(xì)胞外囊泡通過激活A(yù)kt和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來減弱ER 應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，改善未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR）過度激活，并降低CHOP 表達(dá)，從而使髓核細(xì)胞最終免受過度凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，過度氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致IDD 癥狀發(fā)生的早期事件，NLRP3 炎性小體則是導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的重要因素，小細(xì)胞外囊泡通過抑制炎癥介質(zhì)和NLRP3 炎癥小體活化，在病理性髓核細(xì)胞中起抗炎作用[35,38]。

此外，退變椎間盤內(nèi)巨噬細(xì)胞表型或功能變化可直接導(dǎo)致微環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞和炎癥因子聚集，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和椎間盤降解。M1 型巨噬細(xì)胞可以分泌大量的炎癥因子如TNF- 、IL-1 等，它們會(huì)招募更多的巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致椎間盤持續(xù)處于炎癥狀態(tài)，無法進(jìn)入組織修復(fù)期[39]。相反，M2型巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的吞噬能力，可以促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)[40]。Cui 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的小細(xì)胞外囊泡可遞送miR-129-5p 并靶向LGR1基因，隨后抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的激活，使巨噬細(xì)胞向M1型極化，從而緩解IDD 進(jìn)展。

2.3 存在的問題

在小細(xì)胞外囊泡應(yīng)用于治療IDD 時(shí)，小細(xì)胞外囊泡快速清除和破壞是2 個(gè)主要問題。此外，小細(xì)胞外囊泡治療劑的開發(fā)方面仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，目前小細(xì)胞外囊泡制劑生產(chǎn)受到了異質(zhì)性、低生產(chǎn)率等的限制，因此需開發(fā)及優(yōu)化生產(chǎn)細(xì)胞外囊泡制劑的方法[41]。同時(shí)，給藥方式對(duì)于小細(xì)胞外囊泡的應(yīng)用也很重要，給藥方式包括系統(tǒng)注射和局部注射。單次注射可能無法確保長期緩解退變過程，而重復(fù)注射可能會(huì)破壞椎間盤結(jié)構(gòu)。因此，尋找合適的小細(xì)胞外囊泡載體可能是未來的熱門研究。目前已有關(guān)于小細(xì)胞外囊泡與生物材料結(jié)合應(yīng)用于IDD 治療的相關(guān)研究。Xing 等[3]將一種熱敏無細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠與ADSC 衍生的小細(xì)胞外囊泡結(jié)合，該復(fù)合物兼具髓核組織與ADSC 的特性，可改善IDD，但仍需要大量的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)佐證。

3 結(jié)語

干細(xì)胞及其細(xì)胞外囊泡治療IDD 可延緩癥狀。IDD 進(jìn)程中伴隨著髓核細(xì)胞功能退化，移植健康且具有活力的干細(xì)胞可通過多種途徑恢復(fù)髓核細(xì)胞的活性。但由于退化椎間盤中惡劣的微環(huán)境，移植間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和分化仍存在一些問題。致瘤性、異位骨化、免疫反應(yīng)等并發(fā)癥限制了干細(xì)胞組織工程療法應(yīng)用的普及。細(xì)胞外囊泡由于不是細(xì)胞，沒有相關(guān)的免疫反應(yīng)、腫瘤形成和基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，且保留了其來源細(xì)胞原本的特性，因此干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡治療IDD 有可能優(yōu)于干細(xì)胞療法[42-43]，但其存在有提取率低、量較少等問題[44]，未來的研究應(yīng)側(cè)重于改進(jìn)分離和富集技術(shù)，制定標(biāo)準(zhǔn)化程序，從而大規(guī)模生產(chǎn)干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡。