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UHPLC-MS/MS和GC-MS/MS測定甜菜中523種農(nóng)藥及代謝物的殘留量

2023-08-10 06:44:56原海越史小萌李備王雯雯劉瀟威賀澤英
關(guān)鍵詞:甜菜質(zhì)譜回收率

原海越,史小萌,李備,王雯雯,劉瀟威,賀澤英*

(1.海南省食品檢驗檢測中心,國家市場監(jiān)管重點實驗室(熱帶果蔬質(zhì)量與安全),???570311;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,天津 300191;3.安捷倫科技有限公司,北京 100102)

甜菜(Beta vulgaris L.)作為重要的糖料作物,在我國北方種植已有100 多年的歷史[1]。甜菜中具有甜菜堿和甜菜纖維等營養(yǎng)物質(zhì),同時也具有一定的藥用價值[2]。但為了防治甜菜生長過程中的病蟲草害,農(nóng)藥的使用是必不可少的,但農(nóng)藥殘留量含量超標(biāo)最終會影響消費者的健康[3]。許多國際組織和國家(如中國、美國和日本)的法規(guī)均規(guī)定了農(nóng)藥在植物源性等食品中的最大殘留限量(MRL)。我國最新制定的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021 將甜菜中的大部分農(nóng)藥殘留水平設(shè)定為0.01~0.5 mg·kg-1。甜菜中的農(nóng)藥殘留檢測對于確保食品安全和遵循生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范都非常重要。

當(dāng)前最常用農(nóng)藥多殘留檢測手段基于色譜串聯(lián)質(zhì)譜。如四極離子阱QqLIT[4]、靜電軌道阱Obritrap[5]和飛行時間TOF[6],可用于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留的高通量分析,其中最常用的質(zhì)譜檢測器為三重四極桿(QQQ),大量文獻表明使用色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜建立果蔬等農(nóng)產(chǎn)品中幾百種農(nóng)藥的殘留檢測方法是可行的。目前針對甜菜中的農(nóng)藥殘留分析檢測報道較少,僅知甜菜安(desmedipham)和甜菜寧(phenmedipham)在甜菜中有方法開發(fā)及相應(yīng)的殘留檢出[7],因此本研究建立一種甜菜中農(nóng)藥多殘留檢測方法具有實際意義。

針對前處理的提取技術(shù),QuEChERS 方法是目前前處理最常用的手段,其中經(jīng)常使用到的凈化材料有十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)和石墨化炭黑(GCB),其中PSA 可以凈化乙腈提取液中的糖類、酸性物質(zhì)等極性干擾物,但其在凈化基質(zhì)的同時可能對一些化學(xué)性質(zhì)的農(nóng)藥具有吸附作用[8],造成回收率降低。文獻中鮮有PSA 對農(nóng)藥吸附的報道。因此,系統(tǒng)考察PSA吸附的影響是非常必要的。

基于以上所述,該文采用UHPLC-ESI-MS/MS 和GC-EI-MS/MS 聯(lián)合建立甜菜中523 種農(nóng)藥及代謝物的多殘留檢測方法,同時優(yōu)化前處理過程中PSA的使用量,考察兩種檢測儀的性能、回收率和定量限(LOQ)及線性和基質(zhì)效應(yīng)等,以期為甜菜中農(nóng)藥多殘留檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

液質(zhì)分析采用UHPLC 系統(tǒng)串聯(lián)三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜(QTRAP 5500+,SCIEX)。氣質(zhì)分析采用氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(GC-EI-MS/MS)(7000 D,Agilent,美國)。

甲醇、乙腈和乙酸乙酯(HPLC 級),購自飛世爾科學(xué)公司(Fair Lawn,美國);甲酸(純度≥99%)和甲酸銨(純度≥99%)來自阿拉丁生化技術(shù)有限公司(上海);水,通過Milli-Q系統(tǒng)(Millipore,美國)純化。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品,由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所提供。用丙酮配制10 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,-20 ℃儲存,備用。

QuEChERS 提取鹽包(Bond Elut QuEChERS P-N 5982-5650:4 g 無水硫酸鎂,1 g 檸檬酸鈉二水合物,0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物,1 g氯化鈉)和分散固相萃取吸附劑PSA,購自安捷倫科技公司(美國)。

1.2 樣品前處理

選擇空白甜菜樣品進行預(yù)分析,以確保不存在目標(biāo)分析農(nóng)藥,進行后續(xù)方法學(xué)考察。

實際樣品采用本實驗室之前研究中開發(fā)的QuEChERS 方法制備[9]。稱取10 g 試樣(精確至0.01 g)放入50 mL的聚丙烯離心管中。然后加入10 mL的乙腈、陶瓷質(zhì)子和上述QuEChERS提取鹽包。密封試管,手動用力振蕩1 min,之后4 200 r·min-1離心5 min。離心后,取6 mL 上清液到15 mL 聚丙烯離心管中,其中含有900 mg 無水MgSO4、150 mg PSA。渦旋混勻1 min,離心機4 200 r·min-1離心5 min。取上清液1 mL 過PTFE 微孔濾膜(0.22 μm)過濾后進行UH?PLC-MS/MS 分析。取2 mL 上清液于10 mL 的玻璃管中,40 ℃水浴中氮氣吹至近干,加入20 μL 的內(nèi)標(biāo)1 mg·L-1環(huán)氧七氯B 溶液,再加入1 mL 乙酸乙酯復(fù)溶,過PTFE微孔濾膜(0.22 μm)后進行GC-MS/MS分析。

1.3 色譜質(zhì)譜檢測條件

1.3.1 UHPLC-ESI-MS/MS

LC 檢測條件:使用C18 色譜柱(HSS T3 柱,2.1×100 mm,1.7 μm,Waters,美國)進行色譜分離;柱溫設(shè)置為40 ℃,流動相A 為水、流動相B 為甲醇,均含2 mmol·L-1甲酸銨和0.01%甲酸,流速為0.3 mL·min-1,洗脫梯度見表1,進樣量為2 μL。

表1 流動相及其梯度條件(VA+VB)Table 1 Mobile phase and gradient conditions(VA+VB)

質(zhì)譜檢測條件:離子源為電噴霧離子源(ESI),掃描方式為正離子和負離子同時掃描,檢測方法為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。電噴霧電壓(ISVF)5 500 V,離子源溫度350 ℃,霧化氣壓力(GS1)3.48×105Pa,加熱器氣壓力(GS2)3.48×105Pa,氣簾氣壓力2.07×105Pa。

1.3.2 GC-EI-MS/MS

氣相色譜條件:色譜柱為VF 1701ms 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。以氦氣為載氣,色譜柱的流速為1 mL·min-1。柱溫箱升溫程序:初始溫度為40 ℃,保持1 min,在以40 ℃·min-1升溫到120 ℃,然后以5 ℃·min-1升溫到240 ℃,再以12 ℃·min-1升溫至300 ℃,保持10 min;在不分流模式下,進樣口溫度為280 ℃,進樣體積為1 μL。

質(zhì)譜條件:離子源為電子轟擊源(EI);電力電壓為70 eV;監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);碰撞氣為氮氣1.5 mL·min-1;載氣為氦氣1 mL·min-1,離子源和傳輸線溫度設(shè)置為280 ℃。

1.4 方法學(xué)考察

根據(jù)歐盟指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)[10],在優(yōu)化條件下,根據(jù)正確度、精密度、定量限(LOQ)、線性和基質(zhì)效應(yīng)5 個方法學(xué)指標(biāo)進行驗證。為確定該方法的準(zhǔn)確度和精密度,在5 個濃度水平上進行回收率的研究。使用溶劑和甜菜空白基質(zhì)提取溶液分別配制523 種農(nóng)藥及代謝物的溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度分別為2、5、10、20、50、100、200 μg·kg-1)進行線性研究,并計算基質(zhì)效應(yīng)。方法的LOQ 定義為滿足回收率和RSD 要求的最低添加濃度。

1.5 實際甜菜樣品農(nóng)藥殘留檢測

購買市售甜菜樣品232 份,勻漿處理后,-20 ℃保存,備用待測。按照1.2 節(jié)前處理方法進行樣品前處理,采用1.3 節(jié)儀器條件進行523 種農(nóng)藥殘留的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 PSA含量優(yōu)化

設(shè)置5 個不同水平的PSA 用量,分別為0、5、10、25、50 mg·mL-1,對提取出的空白甜菜基質(zhì)進行凈化處理。其凈化效果采用GC-MS/MS 的全掃描模式進行比較。由圖1 可見,隨著PSA 用量增加,基質(zhì)凈化效果逐漸提高。之后,將5 個不同水平的PSA 用量用于前處理加標(biāo)提取,GC-EI-MS/MS和LC-ESI-MS/MS檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在供劑的523 種農(nóng)藥中,隨著PSA 使用量的增加,有40 種農(nóng)藥的回收率降低(表2)。其中,多半受影響的是磺酰脲類農(nóng)藥[11],而且PSA 對異狄氏劑醛吸附非常嚴重,即使用量為5 mg·mL-1,高濃度添加下回收率仍僅有50%左右,無法滿足檢測需求。因此,對于異狄氏劑醛,不宜使用PSA進行凈化,受影響的39 種農(nóng)藥在PSA 用量為5 mg·mL-1時可以滿足回收率在60%~120%之間的要求,其余農(nóng)藥的PSA使用量仍為25 mg·mL-1。

圖1 GC-MS/MS全掃描下不同用量PSA對空白基質(zhì)的凈化效果Figure 1 Purification of different dosage of PSA on blank matrix by GC-MS/MS full scan model

表2 不同PSA含量下受PSA影響的農(nóng)藥及其回收率Table 2 Pesticides affected by PSA and their recoveries under different PSA dosage

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

液相和氣相色譜條件參數(shù)基于GB 23200.121—2021 和GB 23200.113—2018 兩項國家標(biāo)準(zhǔn)的要求,農(nóng)藥的MRM 條件除標(biāo)準(zhǔn)中已有的453 種外,對其余70 種進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。對于UHPLC-MS/MS,對每種農(nóng)藥進行質(zhì)譜端的針泵優(yōu)化,以優(yōu)化MRM 條件和相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù),主要包括去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)以及不同的加合方式,即[M+H]+或[M+NH4]+。其中24 種適用于UHPLC-ESI-MS/MS 檢測。對于這24 種農(nóng)藥,首先使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化多個MRM 條件。然后在空白甜菜提取溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對這些MRM 進行對比,選取兩個響應(yīng)最佳的離子對作為定量和定性離子。對于GC-EI-MS/MS,有45 種農(nóng)藥適用于其檢測。首先全掃描確定前體離子碎片和保留時間。然后,用產(chǎn)物離子模式對每種農(nóng)藥進行分析,最終在多個MRM 條件中確定兩個最佳的MRM 條件和相應(yīng)的碰撞能量(CE)。表3 和表4 僅列出新增70種農(nóng)藥的詳細色譜和質(zhì)譜參數(shù),其余453種農(nóng)藥及代謝物的詳細條件可參考上述兩項標(biāo)準(zhǔn)。

表3 UHPLC-MS/MS分析中農(nóng)藥的保留時間和MRM參數(shù)Table 3 Retention time and MRM parameters of pesticides in UHPLC-MS/MS analysis

2.3 儀器方法驗證與比較

2.3.1 儀器性能

經(jīng)過統(tǒng)計篩查,523 種農(nóng)藥,有399 種適合于UH?PLC-MS/MS 檢測,266 種適合于GC-MS/MS 檢測。其中有142種同時適用于兩種儀器檢測。

2.3.2 回收率和定量限LOQ

回收率在2、5、10、100 μg·kg-1和200 μg·kg-15個不同濃度水平考察,每個添加水平下設(shè)置重復(fù)組(n=5)來確定方法的準(zhǔn)確度和精密度,添加回收樣品的真實濃度與空白基質(zhì)提取液配制已知農(nóng)藥濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行比較,計算回收率。每種農(nóng)藥的定量限LOQ根據(jù)添加回收試驗的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 確定,根據(jù)SANTE 11312/2021 的要求,定量限為回收率和RSD均可接受的最低添加濃度。

UHPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 的回收率和RSD在5 個不同添加濃度水平下,GC-MS/MS 檢測農(nóng)藥的回收率大部分在80%~100%之間,RSD絕大多數(shù)≤10%。除5 μg·kg-1濃度水平條件下UHPLC-MS/MS 檢測農(nóng)藥的回收率大部分在60%~80%之間,其他濃度水平下,農(nóng)藥的回收率也大部分在80%~100%之間。同樣,絕大多數(shù)RSD≤10%。兩種檢測儀器檢測的全部農(nóng)藥 回 收 率 為65.1%~116.4%,RSD≤24.1%,根據(jù)SANTE 文件要求絕大多數(shù)農(nóng)藥得到了令人滿意的回收率和RSD。UHPLC-MS/MS和GC-MS/MS的添加回收試驗結(jié)果顯示523 種農(nóng)藥及代謝物在甜菜中的定量限LOQ 絕大多數(shù)為2 μg·kg-1,8 種農(nóng)藥的定量限LOQ 為5 μg·kg-1。該方法523 種農(nóng)藥的定量限LOQ均低于GB 2763—2021 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的在甜菜中的最大殘留限量MRL 值。各項指標(biāo)等均達到農(nóng)藥殘留測定分析的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求,表明試驗所建立的方法可滿足在甜菜中的同時殘留測定分析需求。

此外,142 種適用于兩種儀器檢測的農(nóng)藥的回收率和RSD 相比較的結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥的回收率大部分仍然在80%~100%之間。對于RSD,UHPLC-MS/MS的重現(xiàn)性要比GC-MS/MS略好??傮w來說,相對于UHPLC-MS/MS,GC-MS/MS 對此142 種農(nóng)藥的檢測無明顯差異。

圖2 142種農(nóng)藥在甜菜中的回收率和RSD分布Figure 2 Recovery and RSD distribution of 142 pesticides in beet

2.3.3 線性和基質(zhì)效應(yīng)

以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)峰面積或與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo),進行回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論采用GC-MS/MS還是UHPLC-MS/MS,所有農(nóng)藥在所設(shè)計的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均高于0.99,并且,UHPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 結(jié)果顯示的部分相關(guān)系數(shù)高于0.999,線性關(guān)系也無明顯差異。

通過比較溶劑和甜菜基質(zhì)中農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計算基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)存在時,痕量化合物的定量分析可能會受到影響[12]。一般在GC-EIMS/MS 和LC-ESI-MS/MS 中分別報道基質(zhì)增強或抑制。51.80%、23.60%和24.60%的目標(biāo)物在UHPLCMS/MS 分析中分別呈強基質(zhì)效應(yīng)(ME≤-50% 或ME≥50%)、中 等 基 質(zhì) 效 應(yīng)(-50%≤ME≤-20% 或20%≤ME≤50%)和弱基質(zhì)效應(yīng)(-20%≤ME≤20%)。22.20%、21.10%和56.70%的目標(biāo)物在GC-MS/MS 分析中分別呈強基質(zhì)效應(yīng)(ME≤-50%或ME≥50%)、中等基質(zhì)效應(yīng)(-50%≤ME≤-20%或20%≤ME≤50%)和弱基質(zhì)效應(yīng)(-20%≤ME≤20%)。針對142 種適用于兩種儀器檢測的農(nóng)藥在UHPLC-MS/MS 分析中多呈強基質(zhì)效應(yīng),而在GC-MS/MS 分析中多呈弱基質(zhì)效應(yīng)。由于在GC-MS/MS 和UHPLC-MS/MS 檢測結(jié)果中顯示出部分農(nóng)藥存在較強的基質(zhì)效應(yīng),為最大程度消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,更大程度保證檢測的準(zhǔn)確性,在實際樣品檢測中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析。

2.4 實際樣品測定及分析

用這兩種色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法對232 份甜菜樣品進行了分析,以評價這兩種方法在甜菜農(nóng)藥殘留檢測方面的可靠性。在10 個不同樣本中共檢出5 種農(nóng)藥殘留,具體數(shù)據(jù)見表5。毒死蜱、馬拉硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯在我國均有登記使用,且為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用品種,但除線磷并未在我國登記。在定量方面,3種同時適用于兩種儀器檢測農(nóng)藥(毒死蜱、溴氰菊酯、氰戊菊酯),其定量結(jié)果在兩種儀器上結(jié)果一致,表明兩種檢測技術(shù)可靠。

表5 實際樣品的農(nóng)藥檢測Table 5 Pesticide detection of real samples

甜菜樣品檢測結(jié)果顯示毒死蜱、馬拉硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯低于GB 2763—2021 標(biāo)準(zhǔn)的MRL值,除線磷未在我國登記因此在GB 2763—2021 標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定MRL 值。其中,毒死蜱檢出率為2.16%、除線磷檢出率為2.16%、馬拉硫磷檢出率為0.43%、溴氰菊酯檢出率為0.43%、氰戊菊酯檢出率為0.43%,232 份樣品中的農(nóng)藥殘留量未經(jīng)檢測超過我國制定的MRL 值。但根據(jù)歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)有少量樣品中的毒死蜱(5 份)、溴氰菊酯(1 份)和氰戊菊酯(1 份)殘留量超標(biāo)。

3 結(jié)論

(1)建立同時檢測甜菜中523 種農(nóng)藥及代謝物的QuEChERS 提取結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的多殘留分析方法。523 種農(nóng)藥及代謝物中有399種適合于UHPLC-MS/MS檢測、266種適合于GC-MS/MS 檢測、142 種同時適用于兩種儀器檢測。

(2)該方法線性關(guān)系良好,添加回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在規(guī)定范圍內(nèi),絕大多數(shù)農(nóng)藥的LOQ 為2 μg·kg-1、8 種農(nóng)藥的LOQ 為5 μg·kg-1,低于各農(nóng)藥在我國規(guī)定的MRL 值,方法性能滿足農(nóng)藥殘留在農(nóng)作物中的檢測分析要求,說明該方法適用于甜菜中的農(nóng)藥多殘留準(zhǔn)確定性和定量分析及市場監(jiān)督抽查等,具有很好的實際應(yīng)用價值。

(3)實際樣品檢出未登記農(nóng)藥除線磷,其他農(nóng)藥殘留量均低于我國限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的MRL 值,但部分農(nóng)藥殘留量超過歐盟限量值。

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