李 玲 劉 楊 夏 凡 張秋瑩 王小波 謝明水

(1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院,隨州,441300; 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,隨州,441300)

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤,占每年新發(fā)惡性腫瘤的10%以上,嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1]。傳統(tǒng)治療肺癌的手段包括手術(shù)、化療等,而手術(shù)治療存在復(fù)發(fā)等問題,且很多患者由于發(fā)現(xiàn)較晚,錯(cuò)過了手術(shù)治療的最佳時(shí)期[2]?；熕幬锶珥樸K等雖能抑制腫瘤生長(zhǎng),但是存在不良反應(yīng)大、耐藥等問題[3]。因此,開發(fā)新的治療肺癌的藥物已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn),一些中藥中提取的成分對(duì)肺癌具有明顯的抑制作用,姜黃素可通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,抑制肺癌細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[4],刺五加多糖可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路,對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用[5],靈芝孢子粉及其提取物可通過抑制血管生成,降低肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)[6]。吳茱萸堿是中藥吳茱萸中主要的生物堿類物質(zhì),具有一定的抗腫瘤作用,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[7]。然而,對(duì)吳茱萸堿對(duì)肺癌的在體抗腫瘤研究較少[8]。本實(shí)驗(yàn)以Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠模型為研究對(duì)象,評(píng)估吳茱萸堿的在體抗肺癌作用,并從調(diào)控血管生成及HIF-1α/VEGF信號(hào)通路入手,初步探究吳茱萸堿治療肺癌的在體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 試劑：吳茱萸堿[分子式：C19H17N3O;分子量：303.36 Da;純度≥98%;化學(xué)物質(zhì)登錄(Chemical Abstracts Service,CAS)號(hào)：518-17-2]購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司;順鉑注射液(規(guī)格10 mg/支)購(gòu)自齊魯制藥有限公司(批號(hào)：8K029A89);羅斯威爾公園紀(jì)念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：11875119)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS,貨號(hào)：10100147)、青霉素/鏈霉素(貨號(hào)：15140148)、胰酶(貨號(hào)：25200072)購(gòu)自美國(guó)Gibco生物有限公司;RNA提取(貨號(hào)：DP419)、反轉(zhuǎn)錄(貨號(hào)：KR106-02)、擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào)：FP205-02)購(gòu)自天根生物科技有限公司;免疫組織化學(xué)一抗VEGF(貨號(hào)：ab1316)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α,HIF-1α)(貨號(hào)：ab1)、CD31(貨號(hào)：ab182981)購(gòu)自英國(guó)Abcam生物科技有限公司。儀器：光學(xué)顯微鏡(Nikon,日本,型號(hào)：ECLIPSE TS100);熒光定量PCR儀(Bio-RAD,美國(guó),型號(hào)：iQTM5)。

1.2 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞體外培養(yǎng) 小鼠Lewis肺癌瘤株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)取液氮保存的小鼠Lewis肺癌瘤株37 ℃水浴融化,加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液(90%1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素),于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液,至80%左右融合時(shí)用胰酶消化傳代,3 d傳代1次[9]。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立 選取40只雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量(20.0±2.0)g,購(gòu)于北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0028。動(dòng)物級(jí)別：無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)別,室溫(22±2)℃,給予無菌飼料及無菌水。將培養(yǎng)后的Lewis細(xì)胞用胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度至約1×107個(gè)/mL。充分搖勻瘤細(xì)胞懸液,于右腋窩皮下接種瘤細(xì)胞懸液0.2 mL,接種后7 d成瘤[10]。該實(shí)驗(yàn)被湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2020-06)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案 將成瘤后的小鼠平均分為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組及吳茱萸堿低、高劑量組,每組10只。模型對(duì)照組每天灌胃生理鹽水0.2 mL,陽性對(duì)照組小鼠于第1、3、5、7、9、11、13天腹腔注射順鉑2 mg/kg,吳茱萸堿低、高劑量組小鼠每天分別灌胃吳茱萸堿10、20 mg/kg,連續(xù)灌胃14 d。

1.5 一般情況觀察 給藥期間第0、3、6、9、12天運(yùn)用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組小鼠腫瘤長(zhǎng)徑與短徑,計(jì)算腫瘤體積,計(jì)算公式為：腫瘤體積(cm2)=腫瘤長(zhǎng)徑(cm)×短徑(cm)2/2;給藥14 d后,測(cè)量各組小鼠體質(zhì)量,之后收集分離腫瘤、胸腺、脾組織,稱取各組織重量,計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾指數(shù),抑瘤率計(jì)算公式為：抑瘤率(%)=[模型對(duì)照組平均瘤重(g)-藥物干預(yù)組平均瘤重(g)]/模型對(duì)照組平均瘤重(g)×100%;胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重量(mg)/體質(zhì)量(g),脾指數(shù)(mg/g)=脾重量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.6 定量PCR(Quantitative PCR,qPCR) 運(yùn)用試劑盒提取小鼠腫瘤組織中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板,按照試劑盒說明分別加入引物和SuperReal PreMix Plus等,擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min,95 ℃ 20 s,56 ℃,20 s,40循環(huán)。qPCR儀檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α,HIF-1α) mRNA表達(dá),采用β-actin為內(nèi)參。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 免疫組織化學(xué) 將1.5中收集的小鼠腫瘤運(yùn)用甲醛溶液固定,之后進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片,免疫組織化學(xué)染色觀察吳茱萸堿干預(yù)后各組小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1,PECAM-1,CD31)表達(dá)情況。一抗稀釋倍數(shù)：VEGF(1∶400),HIF-1α(1∶200),CD31(1∶2 000)。光學(xué)顯微鏡對(duì)腫瘤組織免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行拍照,運(yùn)用Image J軟件對(duì)拍照后的圖片中VEGF及TGF-β1陽性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行量化,計(jì)算出平均光密度。同時(shí)在200×視野下隨機(jī)選取3個(gè)視野,分別計(jì)數(shù)CD31陽性表達(dá)血管數(shù)目,取平均值計(jì)算組織微血管密度(Microvessel Density,MVD)。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸堿對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及臟器指數(shù)的影響 與模型對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組、吳茱萸堿各給藥劑量組小鼠腫瘤生長(zhǎng)顯著減緩,腫瘤體積減小(P<0.05或P<0.01)。見圖1。吳茱萸堿干預(yù)14 d后,陽性對(duì)照組及吳茱萸堿各給藥劑量組小鼠腫瘤重量顯著減少(P<0.05或P<0.01),抑瘤率分別為53.13%、20.49%、38.54%。臟器指數(shù)結(jié)果顯示,陽性對(duì)照組小鼠胸腺、脾指數(shù)較模型對(duì)照組比較明顯降低(P<0.05或P<0.01),吳茱萸堿各給藥劑量組胸腺、脾指數(shù)與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖1 吳茱萸堿干預(yù)期間各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線(n=10)

表2 吳茱萸堿干預(yù)14天后各組小鼠腫瘤重量、抑瘤率及臟器指數(shù)

2.2 吳茱萸堿對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)的影響 吳茱萸堿干預(yù)14 d后,與模型對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組及吳茱萸堿高劑量組小鼠腫瘤組織中HIF-1α基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),陽性對(duì)照組及吳茱萸堿低、高劑量組小鼠腫瘤組織中VEGF基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖2。

圖2 吳茱萸堿干預(yù)14 d后各組小鼠腫瘤組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平

2.3 吳茱萸堿對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)及MVD的影響 吳茱萸堿干預(yù)14 d后,與模型對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組及吳茱萸堿低、高劑量組腫瘤組織中HIF-1α及VEGF陽性表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見圖3,表3。吳茱萸堿干預(yù)14 d后,陽性對(duì)照組及吳茱萸堿低、高劑量組腫瘤組織中MVD顯著減少(P<0.01)。見圖4,表4。

圖3 吳茱萸堿干預(yù)14 d后各組小鼠腫瘤組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)(×200)

圖4 吳茱萸堿干預(yù)14 d后各組小鼠腫瘤組織CD31蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)

表3 各組小鼠腫瘤組織HIF-1α及VEGF免疫組織化學(xué)平均光密度值

表4 各組小鼠腫瘤組織MVD水平

3 討論

本研究所運(yùn)用的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞系,常用于在體肺癌荷瘤模型實(shí)驗(yàn)[11]。相比其他人源肺癌細(xì)胞株,Lewis細(xì)胞更易成瘤,所需注射細(xì)胞數(shù)量少,且由于其來源于C57BL/6小鼠,不需要運(yùn)用裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可在SPF級(jí)環(huán)境下進(jìn)行,大幅度提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性,目前在抗肺癌藥物的在體實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛[12]。在注射7 d后,小鼠腋窩下可觸及明顯的腫塊,提示造模成功[13]。本研究結(jié)果表明,吳茱萸堿干預(yù)14 d過程中,與生理鹽水干預(yù)小鼠比較,腫瘤生長(zhǎng)明顯減緩,且干預(yù)后腫瘤重量顯著降低,低、高劑量組抑瘤率分別達(dá)到了20.49%、38.54%,這些結(jié)果表明吳茱萸堿具有在體抗肺癌生長(zhǎng)的作用。此外,本研究選取順鉑作為陽性對(duì)照[14],順鉑干預(yù)小鼠抑瘤率高于吳茱萸堿高劑量組。然而順鉑組小鼠出現(xiàn)脾、胸腺指數(shù)顯著降低,表明順鉑干預(yù)對(duì)小鼠免疫功能構(gòu)成一定的影響。而吳茱萸堿干預(yù)組小鼠脾、胸腺指數(shù)未出現(xiàn)明顯降低,提示吳茱萸堿對(duì)小鼠免疫功能影響較小,相比于順鉑更加安全。然而,由于本研究只進(jìn)行了臟器指數(shù)的統(tǒng)計(jì),吳茱萸堿能否在臨床上作為一種安全有效的治療肺癌的藥物,仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究還發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿干預(yù)后腫瘤組織血管生成數(shù)量顯著降低,此外,吳茱萸堿還可下調(diào)腫瘤組織中VEGF及HIF-1α表達(dá)。腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)需要血管輸送能量物質(zhì),抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)為開發(fā)抗腫瘤藥物提供了新思路[15-16]。HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的激活是血管生成過程中的重要環(huán)節(jié)[17]。正常情況下,細(xì)胞中的HIF-1α可在脯氨酰羥化酶作用下被降解。腫瘤細(xì)胞增殖迅速,代謝旺盛,使其周圍長(zhǎng)期缺氧,缺氧可引發(fā)脯氨酰羥化酶活性減退,使HIF-1α無法被降解,這時(shí)HIF-1α?xí)M(jìn)入細(xì)胞核,促進(jìn)其下游相關(guān)基因VEGF的表達(dá),VEGF可使血管通透性增高,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,進(jìn)而對(duì)腫瘤組織中血管生成起促進(jìn)作用[18-20]。

綜上所述,本研究表明吳茱萸堿具有在體的抗肺癌作用,其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF及HIF-1α表達(dá),抑制其血管生成。

吳茱萸堿具有抗肺癌荷瘤小鼠作用,且其作用機(jī)制可能與減少腫瘤組織中HIF-1α及VEGF表達(dá)從而抑制腫瘤中血管生成相關(guān)。雖然吳茱萸堿對(duì)小鼠臟器指數(shù)無明顯影響,但其安全性(如對(duì)肝腎功能、血常規(guī)、凝血功能的影響)仍需要在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,吳茱萸堿的體內(nèi)抗腫瘤作用及對(duì)血管生成的影響雖已驗(yàn)證,但仍需要在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。吳茱萸堿作為一種潛在的抗腫瘤藥物,能否應(yīng)用于臨床仍需要深入研究。

利益沖突聲明：作者聲明沒有利益沖突。