石明連，朱政全，劉永明，蘇何玲

桂林醫(yī)學(xué)院智能醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣西桂林 541004

轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein，CREB）屬于DNA 結(jié)合蛋白堿性亮氨酸拉鏈（basic-region leucine zipper，bZIP）超家族成員，通過(guò)與基因啟動(dòng)子的環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件（cyclic adenosine monophosphate response element，CRE）結(jié)合，啟動(dòng)具有CRE 序列的靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡和代謝等生理過(guò)程。人CREB基因位于2 號(hào)染色體長(zhǎng)臂33 區(qū)3 帶，編碼含有341 個(gè)氨基酸殘基的蛋白。結(jié)構(gòu)上，CREB 蛋白包含多個(gè)具有特定功能的結(jié)構(gòu)域，其中bZIP 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)CREB 二聚反應(yīng)以及對(duì)CRE 的識(shí)別與結(jié)合，激酶誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（kinase inducible domain，KID）的9 個(gè)絲氨酸（Ser）殘基是多種蛋白激酶磷酸化激活CREB 的位點(diǎn)，基本轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域與TATA-結(jié)合蛋白協(xié)同調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，而富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域則調(diào)控CREB 的轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)CREB 結(jié)合位點(diǎn)的全基因組篩查提示超過(guò)4000 個(gè)基因受CREB調(diào)控[1]。實(shí)際上，CREB基因是原癌基因，CREB 是普遍性的轉(zhuǎn)錄激活因子。有研究應(yīng)用結(jié)合了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、秩次超幾何分布重疊和染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序等技術(shù)的系統(tǒng)分析方法揭示了與腫瘤有強(qiáng)相關(guān)性的CREB 靶基因，其中CREB 上調(diào)的靶基因29個(gè)，CREB 下調(diào)的靶基因20 個(gè)，并且CREB 對(duì)這些基因表達(dá)調(diào)控是非依賴環(huán)磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的[2]。這表明CREB 不僅與腫瘤高度相關(guān)，而且在作為依賴cAMP 的轉(zhuǎn)錄激活因子的同時(shí)，也以非依賴cAMP 的方式對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮促進(jìn)和抑制的雙重作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究指出CREB 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮非常重要的作用，其中消化系統(tǒng)腫瘤是研究熱點(diǎn)。本文就CREB 在消化系統(tǒng)腫瘤中作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CREB 與肝癌（liver cancer，LC）

在LC 的主要類(lèi)型肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細(xì)胞中，CREB 的表達(dá)及其蛋白磷酸化水平均高于正常肝細(xì)胞[3]。磷酸化是CREB 激活的主要方式，磷酸化位點(diǎn)主要位于其KID 的9 個(gè)Ser 殘基，其中Ser133 的磷酸化是CREB 激活的中心環(huán)節(jié)。CREB 磷酸化形成二聚體，然后與靶基因啟動(dòng)子的CRE 結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。在LC 細(xì)胞Huh7中，CREB 蛋白及其Ser133 磷酸化水平的降低可顯著引發(fā)細(xì)胞的自噬[4]，而CREB 的激活則增強(qiáng)HCC浸潤(rùn)并與腫瘤的惡性發(fā)展相關(guān)[5]。CREB 高表達(dá)的HCC患者5年生存率顯著低于CREB低表達(dá)患者[6]。

CREB 在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關(guān)HCC 的發(fā)生中也起到促癌作用。機(jī)制上，這種促癌作用通過(guò)HBV 的非結(jié)構(gòu)蛋白X 調(diào)節(jié)CREB 相關(guān)信號(hào)通路，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/CREB[7]、CREB/Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）[8]和CREB/微小RNA（microRNA，miRNA）-3188 信號(hào)通路[9]，或者調(diào)節(jié)CREB 與相關(guān)蛋白如中心體p4.1 相關(guān)蛋白（centrosomal p4.1-associated protein，CPAP）[10]和皮層肌動(dòng)蛋白（cortactin，CTTN）[11]的表達(dá)和相互作用實(shí)現(xiàn)。

盡管越來(lái)越多的研究報(bào)道CREB 具有促癌作用，但促癌作用并非CREB 對(duì)HCC 的全部作用。Li 等[12]分析354 例確診為HCC 患者的HCC 組織和癌旁正常組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，CREB/線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）低表達(dá)與不良臨床結(jié)局相關(guān)，并導(dǎo)致不良預(yù)后。這提示CREB 對(duì)HCC 細(xì)胞生長(zhǎng)也具有抑制作用。實(shí)際上，CREB 被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌和抑癌作用，而CREB 發(fā)揮促癌或者抑癌作用取決于其作用節(jié)點(diǎn)的前后關(guān)系[13]。如果CREB 的表達(dá)與激活以及由此產(chǎn)生的靶基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)通路的影響可以促進(jìn)細(xì)胞增殖且抑制細(xì)胞自噬和凋亡，則CREB 發(fā)揮促癌作用，反之就是抑癌作用。

總之，對(duì)于HCC，已有的研究顯示CREB 主要是促癌作用。CREB 及其磷酸化水平升高促進(jìn)HCC 的發(fā)生發(fā)展。而且，HBV 相關(guān)HCC 也是HBV反式調(diào)節(jié)蛋白非結(jié)構(gòu)蛋白X 通過(guò)影響CREB 相關(guān)信號(hào)通路的致癌結(jié)果。鑒于泛腫瘤研究指出CREB 具有促癌因子和抑癌因子雙重性，因此，盡管目前只有個(gè)別研究報(bào)道CREB 對(duì)HCC 具有抑癌作用，但CREB 在HCC 發(fā)生發(fā)展的什么環(huán)節(jié)或者什么情況下發(fā)揮抑癌作用及其機(jī)制將是下一步值得關(guān)注的研究問(wèn)題。

2 CREB 與食管癌（esophageal carcinoma，EC）

研究報(bào)道，CREB 對(duì)不同病理類(lèi)型的EC 具有不同的影響。應(yīng)用KMplot mRNA 基因芯片和RNA-seq analysis（https：//kmplot.com/analysis/）方法分析發(fā)現(xiàn)，CREBmRNA 的表達(dá)與腫瘤患者的生存率相關(guān)。CREB 表達(dá)升高和其Ser133 位點(diǎn)磷酸化可降低食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）患者的生存率，并且是腫瘤復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)因子。而CREB 高表達(dá)對(duì)于食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者則是生存有利因素[14-15]。

近年來(lái)，非編碼RNA 與CREB 的相互作用在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。Yao 等[16]報(bào)道，miRNA-506 在EC 組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)。體外分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA-506 可抑制EC 細(xì)胞增殖，而抑制miRNA-506 表達(dá)則促進(jìn)EC 細(xì)胞增殖。機(jī)制上，miRNA-506 是通過(guò)靶向CREB基因抑制CREB 轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抑制EC細(xì)胞增殖的作用。Su 等[17]研究指出，在EAC 細(xì)胞系中敲低長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00857，可以抑制細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，包括磷酸化CREB 在內(nèi)的一些癌基因編碼蛋白減少，提示CREB 參與LINC00857 對(duì)EAC的致癌作用。Luo 等[18]報(bào)道了CREB 與非編碼RNA 相互作用影響EC 發(fā)生發(fā)展的另一種方式，CREB 和miRNA-133b 分別正向和負(fù)向調(diào)節(jié)β1，3-N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶2（β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2，β3GNT2）的表達(dá)，形成β3GNT2 表達(dá)的調(diào)控環(huán)路。β3GNT2 在EC 組織中的表達(dá)升高，提示CREB 正向調(diào)控增強(qiáng)，β3GNT2 的高表達(dá)與EC 患者的不良預(yù)后相關(guān)。

值得注意的是，盡管高通量技術(shù)的基因表達(dá)分析顯示CREB 的高表達(dá)對(duì)ESCC 患者的生存有利，但國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究指出，CREB 在ESCC 組織中過(guò)表達(dá)，并與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期均呈正相關(guān)，下調(diào)CREB 的表達(dá)可抑制ESCC 細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)S期細(xì)胞周期停滯，引發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移和侵襲[19]。CREB磷酸化使轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）在ESCC 中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤新生血管生成和轉(zhuǎn)移[20]。以上研究表明，CREB 的表達(dá)與磷酸化在ESCC 中同樣發(fā)揮促癌作用。因此，CREB 在EC 中主要是促癌因子，而其抑癌因子的作用目前尚缺少實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 CREB 與胃癌（gastric cancer，GC）

CREB 的表達(dá)與GC 患者的預(yù)后相關(guān)。高表達(dá)CREB的GC患者5年生存率顯著降低[6]。Wang等[21]檢測(cè)285 例原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性GC 組織以及非GC 胃黏膜組織的石蠟包埋標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，CREB 在GC 中高表達(dá)，且與GC 轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和不良預(yù)后相關(guān)。除了CREB 高表達(dá)對(duì)GC 具有促癌作用，CREB 的激活也促進(jìn)GC 的發(fā)生發(fā)展。Koh 等[22]報(bào)道，β受體阻滯劑普萘洛爾抑制了MKN45 和NUGC3 兩種GC 細(xì)胞的CREB 磷酸化激活并阻斷其信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。CREB 激活還與GC 的化療耐藥有關(guān)。Zhang 等[23]利用來(lái)自胃癌細(xì)胞系的Lgr5+干細(xì)胞研究CREB 的激活發(fā)現(xiàn)，抑制CREB 磷酸化導(dǎo)致ATP結(jié)合盒亞家族G 成員2（初級(jí)血型）[ATP binding cassette subfamily G member 2（junior blood group），ABCG2]這種多重藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)下調(diào)是順鉑耐藥的原因之一。另外，Li 等[24]報(bào)道，GC 組織中線粒體核糖體蛋白L33（mitochondrial ribosomal protein L33，MRPL33）的短亞型表達(dá)上調(diào)可通過(guò)阻斷磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱(chēng)AKT）/CREB 信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而促進(jìn)表柔比星反應(yīng)。而MRPL33 的長(zhǎng)亞型則作用相反。

近年來(lái)，CREB 與非編碼RNA 相互作用的研究揭示了諸多GC 發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制。在GC 組織和細(xì)胞中高表達(dá)的CREB 通過(guò)抑制miRNA-186 的轉(zhuǎn)錄降低其對(duì)角蛋白8（keratin 8，KRT8）mRNA 的靶向作用，從而增加KRT8 對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)的上調(diào)作用，使KRT8/HIF-1α軸作用增強(qiáng)，促進(jìn)GC 細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制凋亡[25]。而過(guò)表達(dá)miRNA-450a-5p 則通過(guò)下調(diào)CREB 抑制GC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[26]。Zhuo等[27]報(bào)道了LINC00473 作為癌基因促進(jìn)GC 發(fā)展的模式。LINC00473 一方面靶向水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）mRNA，并通過(guò)CREB 增強(qiáng)AQP3 表達(dá)，促進(jìn)GC細(xì)胞增殖和遷移；另一方面作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）在細(xì)胞質(zhì)中以海綿機(jī)制作用于miRNA-16-5p，緩解其對(duì)細(xì)胞周期蛋白D2（cyclin D2，CCND2）的抑制作用，從而增強(qiáng)LINC00473/miRNA-16-5p/CCND2 軸，促進(jìn)細(xì)胞周期和GC 細(xì)胞增殖。Lai 等[28]報(bào)道，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）0047905 作為ceRNA海綿化miRNA-4516 和miRNA-1227-5p，解除其對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制劑家族B 成員5（serpin family B member 5，SERPINB5）和基質(zhì)金屬蛋白酶11（matrix metalloproteinase 11，MMP11）的抑制。SERPINB5 和MMP11 的過(guò)表達(dá)與GC 患者的不良預(yù)后相關(guān)。靶向下調(diào)circRNA0047905 可降低CREB 磷酸化，阻斷GC 細(xì)胞的AKT/CREB 通路，但由此如何影響GC 的發(fā)展尚待研究。

4 CREB 與結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）

CREB 對(duì)維持CRC 細(xì)胞的惡性特征具有重要作用。Fujishita 等[29]報(bào)道，磷酸化CREB 在有腫瘤轉(zhuǎn)移的CRC 小鼠和患者中表達(dá)。此外，cAMP/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/CREB 通路可上調(diào)CRC 腫瘤標(biāo)志物白細(xì)胞激活黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM）和凸素1（prominin 1，PROM1），使CRC 維持腫瘤干細(xì)胞特性和轉(zhuǎn)移潛能。敲除CREB基因?qū)⒔档虲RC細(xì)胞的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移起始能力。CREB 還通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3（glucose transporter 3，GLUT3）[30]和核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2）[31]

的表達(dá)促進(jìn)CRC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。亞硒酸鹽可通過(guò)阻斷CREB 信號(hào)通路，在體外和體內(nèi)抑制CRC 細(xì)胞中B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）引發(fā)的細(xì)胞凋亡。值得注意的是，盡管雙嘧達(dá)莫被報(bào)道可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但在CRC 細(xì)胞HCT-8 中，雙嘧達(dá)莫可能通過(guò)誘導(dǎo)CREB 磷酸化促進(jìn)細(xì)胞的增殖[32]。

CREB與非編碼RNA的相互作用在CRC細(xì)胞惡變中具有重要影響。其中miRNA-101、miRNA-134和miRNA-205 等miRNA 對(duì)CREB 的靶向作用可下調(diào)CREB 的表達(dá)，弱化CREB 信號(hào)通路，抑制CRC細(xì)胞增殖和遷移[33-35]。例外的是，miRNA-150 對(duì)CREB 信號(hào)通路的抑制則促進(jìn)CRC 細(xì)胞的侵襲和遷移[36]，這種現(xiàn)象值得關(guān)注與深入研究。circRNA在CRC 中起到癌基因的作用。circ_0079993、circ_0136666、circ_002178 和circ_0006357 等circRNA 被報(bào)道促進(jìn)CRC 細(xì)胞的增殖[37-40]。實(shí)際上，它們是作為ceRNA 以海綿機(jī)制分別作用于miRNA-203a-3p、miRNA-383、miRNA-542-3p 和miRNA-133b，消除其對(duì)CREB 的靶向作用，從而增強(qiáng)CREBmRNA 的穩(wěn)定性和CREB 表達(dá)，促進(jìn)CRC 的發(fā)展。非編碼RNA 以miRNA 靶向下調(diào)CREB 表達(dá)，并以circRNA 作為ceRNA 海綿化消除miRNA 對(duì)CREB 的靶向下調(diào)作用是CREB 影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。

5 CREB 與其他消化系統(tǒng)腫瘤

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）中CREB 的表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Song 等[41]報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINCO0857 通過(guò)間充質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化（mesenchymal- epithelial transition，MET）上調(diào)CREB 和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）的表達(dá)，促進(jìn)PC 細(xì)胞的增殖，CREB 的激活促進(jìn)PC 細(xì)胞生長(zhǎng)。CREB 是鋅依賴的轉(zhuǎn)錄因子，被鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（zinc transporter 4，ZIP4）激活。Zhang 等[42]報(bào)道，PC 細(xì)胞中ZIP4 對(duì)CREB 的激活可增加具有癌基因功能的miRNA-373 的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)腫瘤蛋白p53 可誘導(dǎo)核蛋白1（tumor protein p53 inducible nuclear protein 1，TP53INP1）、大腫瘤抑制因子激酶2（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）以及CD44 的表達(dá)，促進(jìn)PC 的發(fā)展。膠原蛋白Ⅺα1（collagen type Ⅺalpha 1 chain，COL11A1）對(duì)CREB的激活是通過(guò)誘導(dǎo)AKT 磷酸化，提升CREB 的Ser133 水平，因此增強(qiáng)AKT/CREB 信號(hào)，并通過(guò)AKT/CREB/Bcl-2/Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）信號(hào)通路抑制線粒體跨膜功能，促進(jìn)PC 細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[43]。CREB 激活促進(jìn)PC 轉(zhuǎn)移，致癌蛋白Kirsten 鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）增加磷酸化激活的CREB 的Ser133 水平，CREB 的Ser133 與突變型p53和CREB相互作用，上調(diào)轉(zhuǎn)移前先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A1（forkhead box A1，F(xiàn)OXA1），激活其轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，驅(qū)動(dòng)PC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[44]。CREB 激活還與PC 患者的低生存率相關(guān)。Srinivasan 等[45]報(bào)道，煙草致癌物誘導(dǎo)的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）介導(dǎo)CREB 磷酸化，使吸煙者的CREB 激活水平顯著升高，促進(jìn)PC 細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低PC 患者的生存率。與上述CREB 磷酸化對(duì)PC 的影響相反，CREB 去磷酸化抑制PC 細(xì)胞的增殖。PH 域富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶2（PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase 2，PHLPP2）誘導(dǎo)CREB 去磷酸化，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1），抑制PC 細(xì)胞增殖。Wu 等[46]報(bào)道了CREB 亞型CREB3 對(duì)另一種消化系統(tǒng)腫瘤膽囊癌（gallbladder cancer，GBC）的作用。miRNA-181b 靶向CREB3 調(diào)節(jié)因子（CREB3 regulatory factor，CREBRF），解除其對(duì)CREB3 的抑制與降解作用，由此促進(jìn)GBC 的病理性發(fā)展，并阻斷抗腫瘤藥物人參皂苷RG3 對(duì)GBC細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用?，F(xiàn)有研究資料表明，CREB在消化系統(tǒng)其他腫瘤中主要顯示癌基因?qū)傩?，其表達(dá)與激活促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其作用網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)制則具有復(fù)雜性。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，CREB 在HCC、EC、GC、CRC 和PC等消化系統(tǒng)腫瘤中主要發(fā)揮促癌因子的作用。大多數(shù)情況下，消化系統(tǒng)腫瘤組織中CREB和p-CREB水平升高，并與細(xì)胞增殖、凋亡抑制和患者的不良預(yù)后相關(guān)。盡管目前有關(guān)CREB 在消化系統(tǒng)腫瘤中抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的報(bào)道較少，但由于泛腫瘤研究發(fā)現(xiàn)CREB 具有促癌因子和抑癌因子雙重性，所以CREB 在消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮抑癌作用及其機(jī)制應(yīng)該是未來(lái)值得關(guān)注的研究問(wèn)題。近年來(lái)，CREB 與非編碼RNA 相互作用對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究報(bào)道快速增加，揭示了諸多新的CREB 相關(guān)促癌和抑癌機(jī)制，也為消化系統(tǒng)腫瘤提供了新的潛在診斷和預(yù)后標(biāo)志，以及潛在靶點(diǎn)。腫瘤患者存在廣泛的代謝異質(zhì)性，因此對(duì)CREB 在腫瘤中作用網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)制的深入研究可能產(chǎn)生復(fù)雜的結(jié)果，但對(duì)于精準(zhǔn)和個(gè)性化的腫瘤治療卻十分必要。