張曉英　王勝　王洪鳳等

關(guān)鍵詞 馬鈴薯Ｘ病毒； 智能聰； 促生； 抗??； 殼寡糖； 褐藻寡糖

中圖分類號(hào)： Ｓ４３２．４ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２２２８

植物病毒病嚴(yán)重阻礙農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展。馬鈴薯Ｘ病毒（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，ＰＶＸ）是世界范圍內(nèi)在煙草和馬鈴薯等作物上普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重的侵染性病毒［１２］。由ＰＶＸ引起的煙草花葉病造成煙草減產(chǎn)１０％～８０％［３］，對(duì)以煙葉為支柱產(chǎn)業(yè)的地區(qū)和煙農(nóng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［４］。由于病毒的絕對(duì)寄生性，目前針對(duì)植物病毒沒有特效藥劑。

殼寡糖是植物識(shí)別病原物的非特異性信號(hào)，通過誘導(dǎo)植物本身的防衛(wèi)反應(yīng)提高其對(duì)病害的抵抗能力［５］，殼寡糖在田間對(duì)煙草花葉病毒病的防治效果可達(dá)２０％～４０％［６］。褐藻寡糖不僅具有抗菌和抗氧化作用，還能調(diào)節(jié)植物免疫應(yīng)答［７８］，盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)０．２０％的褐藻寡糖可以有效誘導(dǎo)植物抵抗煙草花葉病毒?。ǎ簦铮猓幔悖悖铮恚铮螅幔椋悖觯椋颍酰?，ＴＭＶ）的侵染，對(duì)病毒抑制率可達(dá)９０．４％［９］。宛氏擬青霉Paecilo-myces variotii經(jīng)過發(fā)酵獲得的提取物智能聰（ＺＮＣ）是一種超高活性的植物免疫誘抗劑，可以作為誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)植物免疫應(yīng)答，引起植物體內(nèi)活性氧（ＲＯＳ）暴發(fā)、胼胝質(zhì)沉積和病程相關(guān)蛋白基因（ｐｒｏ-ｔｅｃｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ，ＰＲ）的表達(dá)；智能聰通過苯丙氨酸解氨酶（Ｌ-ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｍｍｏｎｉａ-ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ）途徑促進(jìn)水楊酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ，ＳＡ）的積累，調(diào)控ＲＮＡ 沉默相關(guān)標(biāo)志基因NBDCL３的表達(dá)來提高煙草抗ＰＶＸ的能力［１０］，盆栽和田間試驗(yàn)均表現(xiàn)出對(duì)病毒病有較為顯著的防治效果［１１１２］。

目前，農(nóng)藥仍是馬鈴薯Ｘ 病毒病的重要防治手段，但也隨之造成嚴(yán)重的人畜健康、環(huán)境安全及病毒抗藥性問題，阻礙了煙草行業(yè)的健康發(fā)展。為篩選能夠有效防治馬鈴薯Ｘ 病毒病的藥劑，本試驗(yàn)以模式植物本氏煙為研究對(duì)象，研究智能聰分別配施殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草生長(zhǎng)的促進(jìn)作用及抵抗ＰＶＸ侵染的效果，為防治由ＰＶＸ引起的煙草花葉病毒病的復(fù)配藥劑篩選提供科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

宛氏擬青霉Puecilom yces variotii提取物智能聰，有效成分７．５ｍｇ／ｍＬ，由山東蓬勃生物科技有限公司提供；９０％殼寡糖原藥和９０％褐藻寡糖原藥由南陽樸欣肥業(yè)有限公司提供。

供試植物為本氏煙Nicotiana benthamiana。挑選大小、長(zhǎng)勢(shì)一致、無病無蟲的４～８葉齡幼苗用于試驗(yàn)。

帶有綠色熒光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）基因的馬鈴薯Ｘ病毒（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，ＰＶＸ）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)朱常香老師課題組提供。

其他試劑和儀器主要有：石英粉（過６００目篩）、碳酸鹽緩沖溶液（ＣＢＳ，ｐＨ９．６）、馬鈴薯Ｘ 病毒酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海源桔生物科技有限公司）、酶標(biāo)分析儀（美國伯騰儀器有限公司）、３６５ｎｍ 長(zhǎng)波紫外燈（美國ＳＰＥＣＴＲＯＬＩＮＥ）、研磨器等。

１．２試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在溫度２３℃，相對(duì)濕度５０％～６０％，光照６０００～７０００ｌｘ的人工氣候室中進(jìn)行。藥劑用水稀釋后均勻噴施于長(zhǎng)勢(shì)均勻的煙草植株葉片正面，以噴施清水為對(duì)照（ＣＫ）。每７ｄ噴施１次，共噴霧２次。試驗(yàn)設(shè)６個(gè)處理（表１），每處理噴施６株，即６個(gè)重復(fù)。

病毒接種試驗(yàn)在第２次噴施藥劑后２ｈ進(jìn)行，首先在煙草未完全展開幼葉下方的３片展開葉正面均勻撒少許石英粉，采用摩擦接種的方式每葉接種５０μＬ含ＰＶＸ 的病毒汁液，每處理接種６株，即６個(gè)重復(fù)，接種后將植株放于人工氣候室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，５ｄ后在長(zhǎng)波紫外光下觀察接種煙草發(fā)病情況，取每株發(fā)病的幼葉，用錫箔紙包裹并寫好編號(hào)，于液氮速凍后保存于－８０℃冰箱中待用。

１．３生長(zhǎng)指標(biāo)及開花數(shù)量測(cè)定

分別測(cè)量第１次噴藥前、第１次噴藥后７ｄ、第２次噴藥后７ｄ各處理的株高，并于第２次施藥后７ｄ測(cè)量各處理煙草的根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、全株鮮重和干重，統(tǒng)計(jì)開花數(shù)量。

１．４ELISA檢測(cè)病毒含量，計(jì)算病毒抑制率

取接種病毒后５ｄ已發(fā)病的不同處理葉片樣品按照０．１ｇ（葉片重量）∶１ｍＬ（碳酸鹽緩沖溶液）的比例進(jìn)行研磨，研磨液倒入離心管里，５０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ，取上清液于干凈的離心管內(nèi)，按照馬鈴薯Ｘ病毒酶聯(lián)免疫分析試劑盒的操作步驟測(cè)定樣品中馬鈴薯Ｘ病毒含量，以４５０ｎｍ波長(zhǎng)處的ＯＤ值表示。

參照馬志強(qiáng)等的方法［１３］，以對(duì)照和處理之間的馬鈴薯Ｘ病毒含量（ＯＤ）的差異計(jì)算各處理對(duì)病毒的抑制率。

病毒抑制率＝（對(duì)照組ＯＤ－處理組ＯＤ）／對(duì)照組ＯＤ×１００％。

１．５數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ１４．０軟件中ＤＭＲＴ法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)并計(jì)算各處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用ＩｍａｇｅＪ軟件進(jìn)行發(fā)病葉片熒光強(qiáng)度的量化。

２結(jié)果與分析

２．１智能聰配施殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

智能聰配施殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草株高的促進(jìn)作用顯著優(yōu)于單劑。噴施兩次不同單劑后，幼苗株高均顯著高于對(duì)照。其中，第１次噴施后７ｄ，智能聰處理組的株高比對(duì)照增加１７．９１％，殼寡糖處理組增加１３．４６％，褐藻寡糖處理組增加８．６３％。第２次噴施后７ｄ，株高增加率分別為１９．５０％、１１．２５％和１１．４８％，其中智能聰處理株高顯著高于其他２個(gè)單劑處理，促生效果最好。智能聰分別配施殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草幼苗株高的促進(jìn)作用均顯著高于單劑，其中智能聰與殼寡糖復(fù)配處理的煙草株高比單施殼寡糖增加１３．８９％～２５．２４％，與褐藻寡糖復(fù)配處理的煙草株高比單施褐藻寡糖增加２６．３１％～４８．７０％（圖１）。

智能聰與殼寡糖和褐藻寡糖復(fù)配均表現(xiàn)出較好的促根系生長(zhǎng)作用。智能聰與殼寡糖復(fù)配處理的主根長(zhǎng)、鮮重顯著高于殼寡糖單用（犘＜０．０５），分別增加１６．００％、１５．５７％，側(cè)根數(shù)、干重雖高于殼寡糖單劑處理，但差異不顯著，分別增加１１．９５％、１６．６０％。智能聰與褐藻寡糖復(fù)配處理的主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、鮮重和干重顯著高于褐藻寡糖單劑處理，分別增加２０．４１％、２３．２０％、２３．６０％和３１．０３％（圖２）。這表明，智能聰配施褐藻寡糖對(duì)煙草生長(zhǎng)具有較好的促進(jìn)作用。

２．２智能聰配施殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草植株開花的影響

施用智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖可增加煙草植株的開花數(shù)量，其中智能聰和殼寡糖配施時(shí)促進(jìn)作用最好。殼寡糖和褐藻寡糖分別配施智能聰相對(duì)單劑表現(xiàn)出較好的增效作用，其中，殼寡糖與智能聰復(fù)配時(shí)開花數(shù)量比單劑處理增加５６．２５％；褐藻寡糖與智能聰復(fù)配時(shí)開花數(shù)量比單劑處理增加８３．３４％（圖３）。

２．３智能聰配施殼寡糖及褐藻寡糖對(duì)煙草對(duì)PVX病毒抗性的影響

葉面噴施各處理藥劑后２ｈ接種ＰＶＸ病毒，培養(yǎng)５ｄ后在長(zhǎng)波紫外燈下觀察各處理葉片的熒光強(qiáng)度，并檢測(cè)發(fā)病煙草植株葉片的病毒含量。結(jié)果顯示，各處理組葉片的熒光強(qiáng)度經(jīng)過量化后存在顯著差異，其中熒光強(qiáng)度最低的是智能聰配施殼寡糖，抑制效果最為明顯（圖４，圖５）。各處理組煙草葉片中病毒的含量均顯著低于對(duì)照，其中病毒含量最低的為智能聰復(fù)配殼寡糖，其次為智能聰復(fù)配褐藻寡糖處理（圖６）。３種藥劑單用對(duì)ＰＶＸ均有較好的抑制作用，智能聰處理顯著優(yōu)于殼寡糖和褐藻寡糖處理，病毒抑制率分別為６６．８６％、４８．１１％和４５．５０％（表２）。智能聰與殼寡糖或褐藻寡糖配施均能較好地抑制ＰＶＸ，其中與殼寡糖配施處理對(duì)病毒抑制率為７１．２６％，與褐藻寡糖配施時(shí)病毒抑制率為６８．４８％。因此，智能聰對(duì)兩種藥劑均有較明顯的增效作用，與殼寡糖復(fù)配對(duì)病毒的抑制作用比殼寡糖單用增加４８．１２％，與褐藻寡糖復(fù)配比褐藻寡糖單用增加５０．６５％（圖６，表２）。

３結(jié)論與討論

３．１智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草的促生作用

本研究發(fā)現(xiàn)，施用智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草幼苗的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用，與之前的報(bào)道基本一致［１２，１４１５］。為了進(jìn)一步提高藥劑效果，本研究將智能聰分別配施殼寡糖和褐藻寡糖，評(píng)價(jià)其對(duì)煙草促生和抗病毒病的效果。研究結(jié)果證明復(fù)配制劑對(duì)煙草的促生作用顯著高于單用殼寡糖和褐藻寡糖。智能聰可促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)、發(fā)育［１６］，本研究發(fā)現(xiàn)其也能促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，但關(guān)于智能聰如何調(diào)控?zé)煵萆L(zhǎng)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

３．２智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草的抗病作用

免疫誘抗劑智能聰對(duì)田間的煙草病毒病具有較好的防治效果，葉面噴施１ 次５００ｎｇ／ｍＬ 的智能聰，對(duì)煙草病毒病的防治效果可達(dá)５７．０７％［１２］，本研究顯示，葉面噴施２次５０ｎｇ／ｍＬ的智能聰對(duì)ＰＶＸ的抑制率可達(dá)６６．８６％，可能是試驗(yàn)所用的煙草品種不同，并且室內(nèi)培養(yǎng)條件下病毒來源等穩(wěn)定可控，而田間環(huán)境因素復(fù)雜多變，煙草病毒病多是多種病毒復(fù)合侵染，因此存在一定的差異。

褐藻寡糖主要是通過水楊酸（ＳＡ）信號(hào)途徑及胼胝質(zhì)沉積等抵抗ＰＶＸ、ＴＭＶ 的侵入［１７］，進(jìn)而增強(qiáng)煙草對(duì)兩種病毒的抗性。殼寡糖主要通過誘導(dǎo)煙草表皮產(chǎn)生ＨＯ 和ＮＯ信號(hào)分子來提高煙草抗病毒侵染的能力［１８］，因此其對(duì)ＴＭＶ 具有較好的防治效果，本試驗(yàn)中對(duì)ＰＶＸ的防治效果均與上述結(jié)果相符。褐藻寡糖在室內(nèi)煙草抗ＴＭＶ 試驗(yàn)中對(duì)ＴＭＶ的抑制率可達(dá)９０．４％［９］，而本試驗(yàn)中褐藻寡糖對(duì)ＰＶＸ的抑制率較低，可能是試驗(yàn)所用病毒不同以及褐藻寡糖用量較少。

智能聰分別與殼寡糖和褐藻寡糖復(fù)配對(duì)病毒的抑制均表現(xiàn)出較好的作用。其中效果最好的是智能聰與殼寡糖復(fù)配，對(duì)病毒的抑制率為７１．２６％；其次是智能聰與褐藻寡糖復(fù)配，病毒抑制率為６８．４８％。兩種復(fù)配對(duì)ＰＶＸ的抑制率存在一定差異，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對(duì)煙草均有較好的促生作用并能提高煙草抗ＰＶＸ的能力。智能聰與殼寡糖和褐藻寡糖復(fù)配，對(duì)煙草的促生作用和抗病毒效果顯著優(yōu)于單劑，其中促生效果最好的復(fù)配制劑為０．０５μｇ／ｍＬ的智能聰加１２μｇ／ｍＬ的褐藻寡糖，抗馬鈴薯Ｘ病毒效果較好的復(fù)配制劑為０．０５μｇ／ｍＬ的智能聰加３０μｇ／ｍＬ的殼寡糖。