楊 雪,魏 葉,朱心瑤,譚 偉,王曉燕,張志勇,王志榮,劉治國*

0 引言

肥胖和糖尿病的主要原因是脂質(zhì)和葡萄糖代謝功能障礙。目前,全球肥胖人數(shù)超過7億人,約占全球人口的10%[1]。2021年全世界糖尿病患者共5.37億,我國約1.4億,是全球第一大糖尿病發(fā)病國家[2]。肥胖對機體胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)均有較大影響,越來越多的證據(jù)表明,肥胖會增加胰島素抵抗和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等患病風險[3-4]。治療胰島素抵抗的藥物較多,但均有一定的不良反應(yīng)。因此,有必要去尋找能夠減輕體重、改善胰島素敏感性且安全性好的藥物或膳食補充劑。黃酮類天然膳食化合物因其在預(yù)防肥胖和糖尿病方面的潛力而受到關(guān)注[5]。金絲桃苷(Hyperoside,Hyp)是一種天然的、植物來源的黃酮醇苷類化合物,具有多種藥理學活性[6-8]。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠建立肥胖伴胰島素抵抗的動物模型,模擬體內(nèi)高血糖、高血脂及胰島素抵抗狀態(tài)等,并觀察金絲桃苷對肥胖伴胰島素抵抗小鼠代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 普通飼料(D12450B)和高脂飼料(D12492)(Research Diets,USA);金絲桃苷(上海陶素生化科技有限公司,批號:142234);羧甲基纖維素鈉(CMC)(Sigma,USA);Merck Milliproe 液相芯片試劑盒(成都米利安生物科技有限公司);蘇木精、伊紅染液(碧云天生物技術(shù)研究所);FastQuant cDNA試劑盒與SYBR Green Master Mix(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 動物試驗 動物模型參照重慶醫(yī)科大學肖曉秋教授課題組方法[9-11]。30只健康6周齡的雄性C57BL/6小鼠[濟南朋悅試驗動物繁育有限公司,許可證號:SCXK(魯)2014-0007],適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、高脂組、金絲桃苷組,每周固定時間稱重。對照組給予普通飼料,高脂組及金絲桃苷組喂養(yǎng)高脂飼料,喂養(yǎng)14周后建模成功(n=10)。將金絲桃苷溶于0.5%CMC中制成混懸液,金絲桃苷組劑量為50 mg/(kg·d)進行灌胃,對照組和高脂組給予相應(yīng)溶媒,灌胃時間為9周。動物實驗結(jié)束前1 d,小鼠過夜禁食后,腹腔注射10%水合氯醛后脫頸處死,收集血清和肝臟等組織。

1.3 血清生化及細胞因子檢測 取全血后靜置30 min,1 000 g 4 ℃離心10 min,采血清,用全自動生化分析儀檢測血糖、TC、TG、LDL、HDL等指標。使用Merck Milliplex液相芯片試劑盒檢測脂聯(lián)素和瘦素。

1.4 葡萄糖耐量實驗(GTT)和胰島素耐量試驗(ITT) 采用GTT檢測小鼠糖耐受能力。小鼠隔夜禁食8 h以上,取尾靜脈血測血糖值為G0,然后腹腔注射葡萄糖(2 mg/kg),分別在注射后15、30、60、120 min檢測血糖,計算曲線下面積(AUC)。實驗結(jié)束前1周,行ITT。小鼠禁食4 h,測得初始血糖后,按照0.5 U/kg注射胰島素,分別在注射后15、30、60、120 min時測量血糖,繪圖并計算AUC。胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評估模型(HOMA-IR)=空腹血糖(mmol/L)×胰島素(μU/ml)/22.5。

1.5 實時熒光定量PCR 按照Trizol試劑盒提取總RNA,用FastQuant cDNA試劑盒獲得cDNA,用SYBR Green Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR),引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 HE染色 小鼠肝臟用4%的多聚甲醛固定后,再用石蠟包埋,切片后行蘇木精-伊紅染色(HE),在光學顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 動物模型 計算出各組小鼠的GTT曲線下面積和體重的平均值,并以對照組為基準,剔除高脂組和金絲桃苷組中低于平均值的小鼠。高脂組和金絲桃苷組小鼠GTT曲線下面積和體重均顯著高于對照組,表明動物模型建立成功。建模成功后灌胃9周。

2.2 金絲桃苷對高脂小鼠體重的影響 第14周開始給藥,給藥前高脂組和金絲桃苷組小鼠體重明顯高于對照組(P<0.05),高脂組和金絲桃苷組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。給藥1周后(第15周),金絲桃苷組小鼠體重略低于高脂組;給藥3周后(第17周),金絲桃苷組和高脂組小鼠體重比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);給藥9周后(第23周),對照組和高脂組及金絲桃苷組小鼠體重差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且金絲桃苷組小鼠體重低于高脂組(P<0.05)。見表2。

表2 三組小鼠周體重比較(g)

2.3 金絲桃苷對小鼠血糖和胰島素抵抗狀態(tài)的影響 給藥5～7周后(第19～21周),GTT結(jié)果顯示,高脂組AUC高于對照組和金絲桃苷組(P<0.05),而對照組與金絲桃苷組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖1A、1B。ITT結(jié)果顯示,高脂組小鼠AUC高于對照組和金絲桃苷組(P<0.05),對照組與金絲桃苷組比較差異無統(tǒng)計學意義,與空腹血糖和GTT結(jié)果一致。見圖1C、1D。給藥9周后(第23周),高脂組小鼠的空腹血糖(FBG)和胰島素抵抗(HOMA-IR)評分高于金絲桃苷組和對照組(P<0.05),而對照組與金絲桃苷組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1E、21F。

圖1 金絲桃苷對小鼠血糖和胰島素抵抗狀態(tài)的影響注:A:葡萄糖耐量試驗(GTT);B:GTT曲線下面積;C:胰島素耐量試驗(ITT);D:ITT曲線下面積;E:空腹血糖;F:胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評估模型(HOMA-IR)評分。*P<0.05

2.4 金絲桃苷對肝臟脂質(zhì)的影響 高脂組和金絲桃苷組小鼠的TC、TG、LDL、HDL均高于對照組(P<0.05),高脂組高于金絲桃苷組 (P<0.05)。見表3。分別取三組小鼠的肝臟進行HE染色,由圖2可見,高脂組和金絲桃苷組小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積多于對照組,而金絲桃苷組少于高脂組。

圖2 三組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積比較

表3 三組小鼠血脂指標比較(mmol/L)

2.5 金絲桃苷對脂聯(lián)素和瘦素分泌的影響 金絲桃苷組小鼠分泌的脂聯(lián)素高于對照組和高脂組(P<0.05),而高脂組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);金絲桃苷組和高脂組小鼠的瘦素高于對照組(P<0.05),金絲桃苷組高于高脂組 (P<0.05)。見表4。

表4 三組小鼠脂聯(lián)素和瘦素含量比較

2.6 金絲桃苷差異化調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)糖脂代謝相關(guān)基因 與對照組相比,高脂組小鼠肝臟內(nèi)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1c)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)基因均明顯升高(P<0.05),而金絲桃苷組均低于對照組和高脂組(P<0.05)。高脂組腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)表達低于對照組(P<0.05),而金絲桃苷組AMPK基因表達高于其他組(P<0.05)。見圖3。

圖3 金絲桃苷差異化調(diào)節(jié)小鼠肝臟內(nèi)基因表達注:*P<0.05

3 討論

胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病的共同特征,且肥胖的2型糖尿病患者胰島素抵抗更明顯[12]。研究表明,肝臟脂質(zhì)沉積與胰島素抵抗和葡萄糖代謝障礙密切相關(guān)[13],血脂異常的2型糖尿病患者發(fā)生血管相關(guān)并發(fā)癥的風險會進一步增加[14]。近年研究表明,天然產(chǎn)物可用于預(yù)防或治療代謝綜合征,如肥胖、2型糖尿病、血脂異常等,且安全性好[15-16]。因此,從天然產(chǎn)物中尋找藥物先導(dǎo)化合物或膳食補充劑來預(yù)防和治療代謝性疾病已成為目前的研究熱點。

金絲桃苷是一種天然的黃酮醇苷類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種活性。本研究顯示,高脂組小鼠體重、血糖、血脂等均明顯高于對照組,而給予金絲桃苷干預(yù)后,小鼠體重和空腹血糖明顯降低;此外,金絲桃苷可明顯降低高脂小鼠TC、TG、LDL、HDL水平;HE染色顯示,金絲桃苷能夠減輕肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積。結(jié)果表明,金絲桃苷能夠改善高脂飲食小鼠糖脂代謝紊亂狀態(tài)。

瘦素和脂聯(lián)素都是脂肪細胞分泌的脂肪因子。瘦素能夠提高胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,可通過激活A(yù)MPK來改善血脂異常[17-19]。研究表明,脂聯(lián)素是一種胰島素增敏劑,能夠促進機體對葡萄糖的利用,增加機體對胰島素的敏感性[20-21]。脂聯(lián)素可增加AMPK 的磷酸化和活化,從而促進脂肪氧化和葡萄糖轉(zhuǎn)運[22]。本研究顯示,金絲桃苷能夠降低高脂組小鼠的血糖,顯著降低小鼠HOMA-IR評分,且與GTT和ITT一致。進一步研究發(fā)現(xiàn),金絲桃苷能夠顯著增加脂聯(lián)素和瘦素的分泌,表明金絲桃苷可能是通過增加脂聯(lián)素和瘦素的分泌,增加葡萄糖的利用,降低血糖,改善高脂組小鼠胰島素抵抗,增強小鼠糖耐受能力。

AMPK是治療代謝性疾病的主要靶點[23]。AMPK低表達可減少脂肪酸的氧化,導(dǎo)致脂肪合成增加[24],而肝臟AMPK高表達可降低脂肪生成和肝臟TG含量,同時增加脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達并促進脂肪酸的β-氧化[25]。結(jié)果顯示,金絲桃苷可促進高脂飲食小鼠AMPK的表達。SREBP1c是控制脂肪開始合成的最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一[26]。?；o酶A羧化酶(ACC)是催化脂肪酸合成的第一個限速步驟,而脂肪酸合成酶(FAS)是負責脂肪酸從頭合成的酶,SREBP1c主要通過激活A(yù)CC和FAS來調(diào)節(jié)脂肪生成過程。研究表明,金絲桃苷能夠降低高脂飲食小鼠的TC、LDL、HDL。進一步研究顯示,金絲桃苷可抑制小鼠肝臟內(nèi)SREBP1c、ACC、FAS的基因表達,表明金絲桃苷可通過減少SREBP1c、ACC和FAS的表達,抑制肝臟內(nèi)的脂質(zhì)合成。

綜上所述,金絲桃苷通過調(diào)節(jié)AMPK和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因,從而改善高脂飲食引起的肥胖小鼠的胰島素抵抗狀態(tài)和肝臟脂質(zhì)積累,表明金絲桃苷可能是治療2型糖尿病的潛在藥物或膳食補充劑。