張 藝,張 繼,葉彩云,王瑞華,黨 璇

0 引言

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種以慢性無(wú)排卵、高雄激素血癥為特征的內(nèi)分泌異常的疾病,患者臨床表現(xiàn)為多毛、經(jīng)期不規(guī)律、不孕[1-2]?；颊呗殉苍龃?、白膜增厚,并伴有顆粒細(xì)胞黃素化。顆粒細(xì)胞是雌激素、孕激素的主要來(lái)源,是組成卵泡的最大細(xì)胞群,支撐卵母細(xì)胞,在PCOS中發(fā)揮重要作用[3]。暴露于雄激素下的顆粒細(xì)胞可導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯[4]。在小鼠PCOS模型中,顆粒細(xì)胞增殖受限,大量凋亡,無(wú)法為卵泡提供營(yíng)養(yǎng)[5]。因此促進(jìn)顆粒細(xì)胞的存活增殖是恢復(fù)PCOS模型卵泡正常發(fā)育的方式之一。研究顯示,芍藥苷在大鼠體內(nèi)可減輕脫氫表雄酮(DHEA)誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵巢纖維化[6]。芍藥苷能否影響PCOS大鼠顆粒細(xì)胞仍有待研究。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1-α(PGC-1α)為線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子,PGC-1α在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)降低與卵巢顆粒細(xì)胞損傷有關(guān),可能是PCOS發(fā)生發(fā)展的重要原因[7]。PGC-1α由線粒體能量代謝相關(guān)調(diào)節(jié)因子控制,如單磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1),AMPK和SIRT1分別通過(guò)磷酸化和脫乙酰化直接影響PGC-1α活性[8]。研究顯示,AMPK/SIRT1信號(hào)通路在PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中被抑制,與卵巢中的顆粒細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān),且可能是PCOS中胰島素抵抗的分子機(jī)制,可作為開(kāi)發(fā)改善PCOS代謝和生殖功能的治療靶點(diǎn)[9]。因此,調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路可被視為對(duì)抗PCOS的潛在藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 SPF級(jí)SD雌性大鼠10只,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2022-0063。芍藥苷、脫氫表雄酮(DHEA)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;Compound C(AMPK抑制劑)、EX527(SIRT1抑制劑)購(gòu)自MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 PCOS模型建立 10只大鼠模型建立前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,按照隨機(jī)數(shù)字表法選取5只作為對(duì)照組,剩余大鼠皮下注射DHEA(6 mg/100 g),連續(xù)注射21 d,從第16天開(kāi)始連續(xù)4 d觀察大鼠陰道涂片,連續(xù)出現(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞為造模成功[10]。對(duì)照組以等量豆油代替。

1.2.2 卵巢顆粒細(xì)胞的分離與鑒定 沖洗大鼠卵巢組織(生理鹽水),去除脂肪與輸卵管等組織,DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),穿刺竇卵泡使顆粒細(xì)胞釋放于培養(yǎng)基內(nèi),過(guò)濾純化,將顆粒細(xì)胞重懸、過(guò)濾。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細(xì)胞貼壁后,去除未貼壁細(xì)胞,每2天更換培養(yǎng)基,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定顆粒細(xì)胞:制備細(xì)胞爬片,洗滌、固定,過(guò)氧化氫孵育、封閉,加入兔抗鼠促卵泡激素受體(FSHR)(1∶200)(顆粒細(xì)胞標(biāo)志物),孵育過(guò)夜,清洗,加入相應(yīng)二抗(1∶2 000),熒光顯微鏡拍照。

1.2.3 細(xì)胞分組 取培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期顆粒細(xì)胞,正常大鼠顆粒細(xì)胞作為對(duì)照組,將模型大鼠顆粒細(xì)胞分為PCOS組、芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組[6]、芍藥苷高濃度+Compound C組[11]、芍藥苷高濃度+EX527組[12],芍藥苷低、高濃度組分別添加200 μg/ml、800 μg/ml芍藥苷,芍藥苷高濃度+Compound C組在800 μg/ml芍藥苷基礎(chǔ)上添加20 μmol/L的Compound C,芍藥苷高濃度+EX527組在800 μg/ml芍藥苷基礎(chǔ)上添加100 μmol/L EX527,培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.4 卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇(E2)和孕酮(P)含量 收集“1.2.3”中各組顆粒細(xì)胞,接種到24孔板,每孔105個(gè)細(xì)胞,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,終止前3 h 加入100 ng/ml FSH,放射免疫法測(cè)定E2與P含量。

1.2.5 CCK8法測(cè)定顆粒細(xì)胞活性 收集“1.2.3”中各組顆粒細(xì)胞,按照5 000/孔細(xì)胞數(shù)量接種至96孔,48 h后添加CCK-8試劑孵育,4 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度(OD450)。

1.2.6 克隆形成試驗(yàn) 收集“1.2.3”中各組顆粒細(xì)胞,接種至6孔板中(200個(gè)/孔),2周后觀察克隆形成,棄上清,加入甲醇固定15 min,加入Giemsa染色液,為紫色,拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照“1.2.3”中分組方法將顆粒細(xì)胞接種于6孔板(5×105/孔),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,加入Annexin V-FITC和PI 染料,避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 Western blot法測(cè)定細(xì)胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白并定量,SDS-PAGE電泳后,將部分蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉(5%脫脂奶粉),添加兔抗p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、SIRT1(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、GAPDH(作為內(nèi)參,稀釋比1∶5 000),孵育過(guò)夜,添加二抗,孵育1 h,ECL試劑進(jìn)行顯色后經(jīng)凝膠成像儀曝光、觀察,Image-J軟件分析蛋白含量,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 顆粒細(xì)胞的鑒定 對(duì)照組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞呈多邊形或梭形,細(xì)胞間由偽足連接在一起(圖1A);PCOS組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞呈多形性或纖維狀(圖1B);免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組與PCOS組大鼠顆粒細(xì)胞FSHR均呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1C-D)。

圖1 顆粒細(xì)胞形態(tài)以及免疫熒光圖注:A.培養(yǎng)3 d的對(duì)照組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài);B.培養(yǎng)3 d的PCOS組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài);C.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)對(duì)照組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞FSHR陽(yáng)性表達(dá);D.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)PCOS組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞FSHR陽(yáng)性表達(dá)

2.2 各組卵巢顆粒細(xì)胞雌激素、孕激素分泌情況 與對(duì)照組相比,PCOS組卵巢顆粒細(xì)胞E2、P水平降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組及芍藥苷高濃度組卵巢顆粒細(xì)胞的E2、P水平升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組卵巢顆粒細(xì)胞的E2、P水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組卵巢顆粒細(xì)胞E2、P水平測(cè)定

2.3 各組卵巢顆粒細(xì)胞活性情況 與對(duì)照組相比,PCOS組顆粒細(xì)胞OD450值降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組顆粒細(xì)胞OD450值升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組顆粒細(xì)胞OD450值降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組顆粒細(xì)胞OD450值情況

2.4 各組卵巢顆粒細(xì)胞克隆形成數(shù)情況 與對(duì)照組相比,PCOS組顆粒細(xì)胞克隆形成數(shù)降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組顆粒細(xì)胞克隆形成數(shù)升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組顆粒細(xì)胞克隆形成數(shù)降低(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組顆粒細(xì)胞克隆形成數(shù)比較

圖2 各組卵巢顆粒細(xì)胞克隆形成圖注:PCOS:多囊卵巢綜合征;Compound C:AMPK抑制劑;EX527:SIRT1抑制劑

2.5 各組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組相比,PCOS組顆粒細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組顆粒細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組顆粒細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),見(jiàn)表4、圖3。

表4 各組顆粒細(xì)胞凋亡情況

圖3 各組顆粒細(xì)胞凋亡情況注:PCOS:多囊卵巢綜合征;Compound C:AMPK抑制劑;EX527:SIRT1抑制劑

2.6 各組卵巢顆粒細(xì)胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)的比較 與對(duì)照組相比,PCOS組卵巢顆粒細(xì)胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組卵巢顆粒細(xì)胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組卵巢顆粒細(xì)胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平降低(P<0.05),見(jiàn)表5、圖4。

表5 各組卵巢顆粒細(xì)胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)情況

圖4 各組卵巢顆粒細(xì)胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)注:A.對(duì)照組;B.PCOS組;C.芍藥苷低濃度組;D.芍藥苷高濃度組;E.芍藥苷高濃度+Compound C組;F.芍藥苷高濃度+EX527組

3 討論

PCOS是育齡期女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌失調(diào)疾病,患者表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、不孕、痤瘡、多毛,影響女性生殖健康。顆粒細(xì)胞是構(gòu)成卵泡的細(xì)胞群,為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng),是后續(xù)雌激素、孕激素的關(guān)鍵來(lái)源,對(duì)胚胎植入子宮內(nèi)膜提供支持,其豐富程度與卵子質(zhì)量密切相關(guān)[13-14]。在高雄激素刺激下,顆粒細(xì)胞數(shù)量不足,卵泡發(fā)育不良,也是患者不孕的重要原因。因此,去除刺激并恢復(fù)顆粒細(xì)胞的正常增殖是PCOS疾病治療的方式之一。

芍藥苷是來(lái)源于芍藥科植物的活性物質(zhì),具有抗癌、抗自由基損傷、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性、免疫調(diào)節(jié)等活性,且芍藥苷毒性很低,對(duì)大鼠心、肝、脾、肺等多種臟器無(wú)明顯毒副作用。芍藥甘草湯是PCOS的治療名方,程瑤[15]研究顯示,在PCOS疾病狀態(tài)下,大鼠代謝異常,芍藥苷草湯的主要成分-芍藥苷的生物利用度顯著下降。于春玲等[16]研究顯示,芍藥苷可調(diào)整經(jīng)期前綜合征大鼠血清雌激素水平以及大腦皮層雌激素受體表達(dá)。以上研究均表明,芍藥苷可能在PCOS大鼠顆粒細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究中,經(jīng)芍藥苷處理大鼠,血清E2、P水平升高,提示芍藥苷對(duì)促進(jìn)PCOS大鼠的激素分泌有效。將大鼠顆粒細(xì)胞分離并培養(yǎng),經(jīng)鑒定,PCOS模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞FSHR陽(yáng)性率升高,FSHR是顆粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,提示制備的顆粒細(xì)胞具備正常形態(tài)。給予不同濃度芍藥苷處理,發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞的活性增加,凋亡率下降,且在兩個(gè)濃度中細(xì)胞活性與凋亡率存在差異。細(xì)胞增殖升高與凋亡的降低也充分證明了芍藥苷對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的作用。但芍藥苷發(fā)揮促卵巢顆粒細(xì)胞增殖,抑制顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步分析。

AMPK是一種細(xì)胞代謝傳感器,在保護(hù)細(xì)胞功能方面起著至關(guān)重要的作用。研究顯示,PCOS大鼠不孕可能與AMPK通路受阻導(dǎo)致的線粒體損傷有關(guān)[17]。鄧煜等[18]研究顯示,白藜蘆醇可通過(guò)激活A(yù)MPK通路抑制多囊卵巢綜合征大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬。以上研究表明,AMPK可在PCOS中發(fā)揮作用。SIRT1可參與DNA修復(fù)、細(xì)胞存活等細(xì)胞過(guò)程,其在卵母細(xì)胞的發(fā)育以及衰老中發(fā)揮作用[19]。PGC-1α是一種多功能轉(zhuǎn)錄輔激活因子,可參與調(diào)解線粒體生物發(fā)生的多種核受體和轉(zhuǎn)錄因子的活性,在高能量需求的組織中高表達(dá),調(diào)控能量代謝,與雌激素受體相結(jié)合,參與卵巢癌的調(diào)控[20]。金小琴等[21]研究顯示,PGC-1α對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞代謝有影響。

本研究中,PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞AMPK受抑制,與正常大鼠卵巢顆粒細(xì)胞比較,p-AMPK/AMPK值降低,SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)降低,提示AMPK/SIRT1/PGC-1α通路可能在卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡中發(fā)揮作用。為探究芍藥苷能否通過(guò)調(diào)整此通路影響顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡,本研究還檢測(cè)了芍藥苷處理后的顆粒細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)p-AMPK/AMPK值升高,SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)升高,提示芍藥苷可能通過(guò)調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路發(fā)揮作用,為驗(yàn)證此猜想,在芍藥苷高濃度基礎(chǔ)上分別添加AMPK抑制劑(Compound C)、SIRT1抑制劑(EX527),發(fā)現(xiàn)芍藥苷對(duì)顆粒細(xì)胞的作用均被逆轉(zhuǎn),此結(jié)果驗(yàn)證了本研究開(kāi)始的猜想。

綜上所述,芍藥苷可能通過(guò)調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促進(jìn)PCOS卵巢顆粒細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞凋亡。