張 茜 王 暢 曲星源 梁 琛 杜思雨 王 雷

胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤寡脫氧核苷酸（cytosinephosphate-guanine oligodeoxynucleotide，CpG ODN）是人工合成的具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶- 鳥嘌呤二核苷酸的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重復(fù)序列，能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答[1]。游離的CpG ODN 不易黏附細(xì)胞、極易被核酸酶酶解，因而使CpG ODN 的免疫效應(yīng)大大降低。硫代修飾用于增強(qiáng)CpG ODN 的穩(wěn)定性和免疫刺激活性，但它與不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[2]。納米遞藥系統(tǒng)是靶向遞藥的一種無(wú)創(chuàng)給藥方式，實(shí)現(xiàn)藥物至作用部位的直接、高效靶向輸送，為CpG ODN 的高效傳遞和有效攝取提供了方法，增強(qiáng)了對(duì)機(jī)體的免疫效應(yīng)，提高了機(jī)體的免疫應(yīng)答，具有極大應(yīng)用潛力。本文擬就CpG ODN 的研發(fā)進(jìn)程，追蹤其納米粒子制備的研究進(jìn)展及作用，展望其在牙周炎治療方面的應(yīng)用前景。

一、CpG ODN 簡(jiǎn)介

CpG ODN 是一類含有胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸鏈，由CpG 二核苷酸及其5'端的2 個(gè)嘌呤和3' 端的2 個(gè)嘧啶組成，呈單鏈DNA 形式，含有1 個(gè)或多個(gè)非甲基化的CpG 基序，由于具有良好的促進(jìn)免疫應(yīng)答的效果而常在臨床研究中被用作免疫增強(qiáng)劑[3]?；贑pG ODN 結(jié)構(gòu)上的不同，現(xiàn)已鑒定出3 種類型的CpG ODN，即A，B，C型。不同種類的CpG ODN，其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答性質(zhì)亦有所不同。A 型含有部分硫代修飾，呈有序的G-四聚體高級(jí)結(jié)構(gòu)，可以刺激人漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）產(chǎn)生大量I 型干擾素（interferon，IFN-α），并能強(qiáng)烈活化自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，用于抗腫瘤、抗病毒免疫佐劑治療免疫缺陷病[4]。B 型和C 型全部硫代修飾，不同的是，B 型含1 個(gè)或多個(gè)CpG 基序，能強(qiáng)烈刺激B 細(xì)胞增殖并分泌大量免疫球蛋白、白介素（interleukin，IL）-6、IL-10 和IL-12，并能刺激PDC成熟，但活化NK 細(xì)胞作用不如A 型，是亞單位疫苗、DNA 疫苗等疫苗佐劑的選擇[5]。而C 型3'端回文序列形成二聚體，兼有A、B 兩型的作用特點(diǎn)，能逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 免疫應(yīng)答失衡，可作為自身免疫疾病的免疫刺激劑[6]。與其他佐劑相比，CpG ODN 在增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的反應(yīng)方面具有更好的效果，尤其是對(duì)于免疫原性較低的抗原，以及當(dāng)免疫原的劑量不足以引發(fā)有效的免疫反應(yīng)時(shí)[7]。CpG ODN 作為一種良好的免疫佐劑，其本身不具有免疫原性，也不會(huì)誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)[8]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN 可與B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）表達(dá)的Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）-9 相互作用，并誘導(dǎo)機(jī)體Th1 和促炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)[9，10]，觸發(fā)機(jī)體防御機(jī)制，引起明顯而多樣化的免疫反應(yīng)。資料顯示，TLR-9 是一類重要的模式識(shí)別受體，具有固有免疫刺激特性，它的刺激可導(dǎo)致兩種不同的信號(hào)通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子（如IL-6 和（或）干擾素（interferon，IFN）的產(chǎn)生。這兩類細(xì)胞因子對(duì)先天免疫和適應(yīng)性免疫都有不同的影響[11]。目前CpG ODN在特應(yīng)性皮炎[12]、大腸桿菌敗血癥[13]和黑色素瘤[14]等疾病研究方面效果顯著，并在臨床上得到初步應(yīng)用。

二、CpG ODN 納米粒子

納米粒子是一類具有納米級(jí)尺寸的生物材料，通常直徑在10～1000 nm 之間，呈分散狀或固體顆粒。納米粒子能夠?qū)⑺幬餃?zhǔn)確地傳遞到目標(biāo)部位，因而受到了廣泛的關(guān)注。納米粒子遞藥系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于尺寸小，改善了細(xì)胞膜的跨膜運(yùn)輸、淋巴器官的靶向性和可持續(xù)的DC 激活，可以將藥物輸送到細(xì)胞內(nèi)的特定區(qū)域；同時(shí)還可以改善藥物溶解性、穩(wěn)定性和安全性[15]?，F(xiàn)有資料顯示，納米粒子遞藥系統(tǒng)主要包括脂質(zhì)體、聚合物、無(wú)機(jī)物、樹枝狀大分子等陽(yáng)性材料，對(duì)細(xì)胞膜具有強(qiáng)烈的粘附作用。基于納米粒子的CpG ODN 遞送進(jìn)一步保護(hù)CpG ODN 免受DNA 酶的傷害，使CpG ODN 在體內(nèi)長(zhǎng)期滯留；提高細(xì)胞對(duì)CpG ODN 的攝取效率，將CpG ODN 遞送到靶組織，使機(jī)體的免疫反應(yīng)得到改善[16，17]。研究[18]顯示，CpG ODN 在結(jié)合納米材料后可以緩慢釋放，96 小時(shí)內(nèi)釋放不到50%的載藥量；但在pH 值降低時(shí)，促進(jìn)納米粒子的分解，并加速CpG 的釋放，并被細(xì)胞內(nèi)化，促進(jìn)了其在細(xì)胞內(nèi)的富集，增強(qiáng)了與TLR-9 的結(jié)合能力。此外，CpG 納米粒子分散的穩(wěn)定性與粒徑分布、Zeta 電位相關(guān)，良好的尺寸和表面電荷不僅有利于納米粒子在水溶液中的良好分散，而且促進(jìn)細(xì)胞膜的結(jié)合和細(xì)胞的內(nèi)化[19]。有學(xué)者[20]基于脂質(zhì)體制備CpG ODN 納米粒子，粒徑分別為54.0 nm 和43.0 nm，電位分別為1.12±8.26 和0.34±11.2 mV，成功遞送了CpG ODN，改善DC 細(xì)胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的表達(dá)，改善T 細(xì)胞反應(yīng)和抗原特異性抗體反應(yīng)，有很強(qiáng)的預(yù)防作用。真菌聚合物也是實(shí)現(xiàn)高效的傳遞系統(tǒng)之一。Tiwari 等人將CpG ODN 與裂藻素成功制備納米粒子，在增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)方面具有更強(qiáng)的能力—包括產(chǎn)生活性氧、一氧化氮和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)[21]。越來(lái)越多的研究表明，CpG ODN 納米粒子具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，成為納米科學(xué)和納米技術(shù)重要的研究?jī)?nèi)容。

三、CpG ODN 及CpG ODN 納米粒子在牙周炎中的應(yīng)用

全球有一半以上人口患有不同程度的牙周疾病（包括牙周炎和牙齦炎），超過10%的人為重度牙周炎[22]。目前已公認(rèn)牙周炎是多因素疾病，牙菌斑是引發(fā)牙周炎的始動(dòng)因子。但是，宿主的免疫反應(yīng)也會(huì)損害局部牙周組織，因此，除了機(jī)械手段的基礎(chǔ)治療外，在臨床上常輔以藥物治療來(lái)減少牙菌斑中的牙周致病菌，阻止微生物入侵或擴(kuò)散時(shí)發(fā)生的免疫反應(yīng)[23]。近年來(lái)，有不少學(xué)者將CpG ODN 及CpG ODN納米粒子用于牙周炎治療的研究，并取得一定的研究進(jìn)展。

1.促進(jìn)成骨，減少骨吸收作用：促進(jìn)骨的再生在牙周炎治療中具有重要意義和價(jià)值。眾所周知，在骨的改建過程中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Yu[24]等人探討了CpG ODN 對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3 增殖和成骨分化的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示CpG ODN 調(diào)節(jié)MC3T3 細(xì)胞的成骨分化，增加成骨分化基因（如骨鈣素）的相對(duì)表達(dá)，證明CpG ODN有望成為治療牙周炎和促進(jìn)骨再生的療法。此外，有學(xué)者將CpG ODN 與N-乙?；?L-亮氨酸改性聚乙烯亞胺制備納米粒子作用于RAW264.7 巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)此納米粒子細(xì)胞毒性相對(duì)較低，轉(zhuǎn)染效率較高，明顯降低破骨細(xì)胞分化因子（如激活T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子核因子NFATc、原癌基因c-fos、核因子-κB 受體激活劑 RANK 和基質(zhì)金屬蛋白酶9）的表達(dá)，從而減少破骨細(xì)胞的形成，在抵抗炎癥和骨吸收方面起著重要作用[25]。CpG ODN 還可通過上調(diào)牙周組織中Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runt -related transcription factor 2，Runx2）和與成骨細(xì)胞分化和骨形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（Osterix）的表達(dá)水平，降低炎癥因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控牙周組織改建，減少正畸力作用下大鼠牙齒的移動(dòng)距離[26，27]。除了調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)，CpG ODN 對(duì)多種細(xì)胞周期和凋亡也可產(chǎn)生一定的影響。有證據(jù)表明，CpG ODN 影響MC3T3 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期[24]，顯著降低RAW264.7 巨噬細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)部分早期細(xì)胞凋亡[25]，還可促進(jìn)感染狀態(tài)下人成骨肉瘤細(xì)胞MG63 的細(xì)胞增殖，降低G1 期細(xì)胞百分比，促使細(xì)胞進(jìn)入S 期并抑制細(xì)胞早期凋亡[28]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在不影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）形態(tài)的情況下，CpG ODN 可顯著促進(jìn)BMSCs 的增殖和成骨分化[29]。綜上，骨重建受成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞之間的平衡、骨/免疫系統(tǒng)的相互作用調(diào)控。

2.抗炎作用：對(duì)于牙周病而言，其相關(guān)的免疫保護(hù)機(jī)制與黏膜免疫中唾液分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，S-IgA）的作用密不可分[30]。Bai 的研究[31]證明了CpG ODN 與牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-fimA 組裝的納米粒子在誘導(dǎo)黏膜S -IgA 反應(yīng)， 降低骨中環(huán)加氧酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2）和核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表達(dá)方面的潛力，從而抑制炎癥，減少破骨細(xì)胞的激活和分化，從而減少牙周炎骨吸收。此外，有研究發(fā)現(xiàn) CpG ODN 可協(xié)同促進(jìn)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞增殖和遷移，提示CpG ODN 在炎癥反應(yīng)過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能[32]。

B 淋巴細(xì)胞是牙周炎確立期和晚期的主要細(xì)胞，參與B 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御，在牙周病發(fā)病機(jī)制起著重要作用。同時(shí)，B 細(xì)胞直接參與骨吸收的調(diào)節(jié)，并且是骨保護(hù)素的主要來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN 不僅能誘導(dǎo)IFN 和促炎基因的低水平上調(diào)，并且可以強(qiáng)有力地激活B 細(xì)胞[33]，促進(jìn)B 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用。

3.抗菌作用：在牙周炎中，細(xì)菌的存在也是促進(jìn)牙周組織的破壞的重要原因之一。眾所周知，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎中主要的致病菌之一，可誘導(dǎo)炎癥誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，并促進(jìn)牙槽骨吸收。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN/DNA 質(zhì)粒編碼Flt3 配體納米粒子可有效增強(qiáng)DCs，并提供平衡的Th1 和Th2 型細(xì)胞因子應(yīng)答介導(dǎo)的特異性免疫球蛋白，可有效減輕P.gingivalis的感染[34]，防止P.gingivalis與唾液蛋白結(jié)合，抑制P.gingivalis在牙面上的黏附[35]。同樣地，在Xiao[36]和Chang[37]的研究中，證實(shí)了CpG ODN 納米粒子，控制P.gingivalis所致的口腔感染，顯著減少與P.gingivalis感染相關(guān)的骨吸收。有學(xué)者[38]研究了P.gingivalisLPS 和CpG ODN 對(duì)先天性樣B 細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)CpG ODN 能抑制先天性樣B 細(xì)胞的早期和晚期凋亡，增強(qiáng)了P.gingivalisLPS 誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖，進(jìn)一步提高了B 細(xì)胞免疫防御功能。

研究表明，CpG ODN 可以模擬細(xì)菌DNA，與TLR-9 結(jié)合，對(duì)先天性免疫和適應(yīng)性免疫都有不同的影響，這種影響不僅表現(xiàn)在促進(jìn)骨的生成，也體現(xiàn)在對(duì)細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)的抑制。而納米材料的應(yīng)用進(jìn)一步提高了CpG ODN 的穩(wěn)定性，從而更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作用于機(jī)體，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。

CpG ODN 是一種TLR 激動(dòng)劑，也是一種免疫保護(hù)劑，用于抵抗細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物感染。然而，CpG ODN 發(fā)揮作用與自身穩(wěn)定性、受體結(jié)合能力，以及受體激活能力等諸多因素相關(guān)。因此，如何提高CpG ODN 的免疫活性，一直是人們思考的問題，其中納米技術(shù)的應(yīng)用為CpG ODN 發(fā)揮作用提供了新型藥物遞送系統(tǒng)和療法，開辟了新思路。多項(xiàng)研究顯示含有CpG ODN 的納米粒子進(jìn)一步提高了其免疫保護(hù)作用，使免疫效應(yīng)得到改善，并廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究和治療。值得注意的是，安全性始終是使用CpG ODN 的首要問題。目前有很多評(píng)估CpG ODN 的免疫活性和安全性研究，大多數(shù)研究表明，CpG ODN 納米粒子較游離CpG ODN 在免疫治療方面有更好的治療作用，尚未發(fā)現(xiàn)其毒副作用。這與治療方法高度相關(guān)，因?yàn)樵谀承┣闆r下，這可能受益于免疫系統(tǒng)的刺激（如疫苗和抗癌應(yīng)用），而另一些情況下可能受益于抑制免疫信號(hào)（如自身免疫性疾病）或避免免疫信號(hào)（如反義RNA 介導(dǎo)的有效載荷傳遞）的傳遞[39]。盡管CpG ODN 納米粒子的研究在短期內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)明顯異常，但是仍需持之以恒地觀察與深入的研究。