王再花,葉廣英,曾燦彪,葉慶生,黃秀紅
(1廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室,廣州 510640;2華南師范大學生命科學學院,廣州 510631)
鐵皮石斛為國內(nèi)名貴中藥材和保健食材。鐵皮石斛作為藥食同源植物被國家藥監(jiān)局批準后,在云南、貴州、浙江、福建、廣西、廣東等地作為食品逐漸被開發(fā),制成石斛茶、飲料、浸膏等百余種產(chǎn)品,其中的鮮榨飲料因方便快捷成為企業(yè)和農(nóng)戶的主要加工銷售產(chǎn)品。因鐵皮石斛鮮榨汁保質(zhì)期短,不適于市場流通,一些科研工作者開始飲料的研制,如石斛乳酸飲料[1]、石斛山楂復配保健飲料[2];經(jīng)石斛提取制作飲料,如將金釵石斛中有效成分生物堿制成飲料[3],將金釵石斛的乙醇浸提濾液作為主劑,其他成分含有維生素C、檸檬酸、硫酸鈉、低聚果糖、白砂糖、蛋白糖、乙基麥芽酚和水;此外還研發(fā)出了霍山石斛運動抗疲勞飲料[4]、鐵皮石斛蘋果復配飲料[5]、鐵皮石斛雪梨保健飲料[6]。
高壓技術(shù)在食品加工過程中能夠滅活有害和腐敗的生物體,延長產(chǎn)品保質(zhì)期,同時對營養(yǎng)素和食品的新鮮品質(zhì)屬性影響最小,是食品加工的主要殺菌途徑之一[7-8]。但有關(guān)鐵皮石斛的殺菌工藝及貯藏穩(wěn)定性的研究報道比較少。李春柳等[9]報道DMDC對生鮮食品特定腐敗菌熒光假單胞菌、隆德假單胞菌的浮游菌和被膜菌具有良好的殺菌效果,并且對桑果汁、荔枝酒、葡萄酒、胡柚汁等具有一定的殺菌效果[10]。乳酸鏈球菌素(Nisin)因?qū)钏固厥暇⑺鬆钛堪麠U菌、葡萄球菌等有抗菌作用且對人安全,已被美國食品藥品監(jiān)管局批準用作食品添加劑[11],在食品加工中應用日漸廣泛。例如發(fā)酵藍莓酒酒精度隨著Nisin 加入量的增大呈極顯著地增大[12],Nisin 與超高壓結(jié)合處理對Escherichia coliO157:H7產(chǎn)生協(xié)同殺菌效果[13]。而DMDC聯(lián)合Nisin在荔枝汁殺菌中有良好的效果[14-15],但生物性殺菌劑Nisin和DMDC的應用報道不多。
多糖是鐵皮石斛的主要活性成分之一[16],其含量是鐵皮石斛質(zhì)量評價的主要指標,具有提高免疫力[17]、護肝[18]、抗腫瘤[19-20]、抗氧化[21]、降血糖[22]等多種功效。筆者通過比較不同殺菌方式多糖、總酚等物質(zhì)的變化,探討鐵皮石斛飲料存儲期的質(zhì)量變化,為鐵皮石斛飲品的加工提供參考。
鐵皮石斛在廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所白云基地(23°23′40″N,113°26′46″E)栽培和采集,為10月取材的鐵皮石斛1.5年新鮮莖。經(jīng)環(huán)境園藝研究所徐曄春研究員鑒定為蘭科石斛屬鐵皮石斛(Dendrobium officinale),存放廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室。
葡萄糖(α-D-glucopyranose,≥99.9%),購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;沒食子酸(≥99.0%),購自上海麥克林生物科技有限公司;硫酸為優(yōu)級純,購自廣州試劑廠;DMDC,購自德國朗盛公司;Nisin(食品級),購自浙江新銀象生物工程有限公司。其他化學試劑為分析純。
UV-2405紫外-可見分光光度計,日本Shimadzu公司;UltraScan VIS型全自動色差儀,美國HunterLab公司。
1.4.1 鐵皮石斛飲料制作取鐵皮石斛新鮮莖,料液比1:30(g:g)。飲料制作過程為鐵皮石斛鮮莖→粉碎→過濾→加熱→灌裝→滅菌→成品。
1.4.2 殺菌工藝設(shè)置7種不同殺菌方式對鐵皮石斛飲料進行滅菌處理,M1~M4 處理灌裝玻璃瓶,260 mL/瓶。M5~M7處理飲料100℃煮沸灌裝,倒置排氣。
M1為121℃高溫高壓滅菌5 min;M2為121℃高溫高壓滅菌10 min;M3為121℃高溫高壓滅菌15 min;M4為121℃高溫高壓滅菌20 min;M5為添加0.2 g/kg天然生物活性抗菌肽乳酸鏈球菌素(Nisin),100℃煮沸;M6為添加飲料殺菌劑二甲基二碳酸鹽(DMDC)0.25 g/kg,100℃煮沸;M7 為添加0.25 g/kg DMDC 和0.2 g/kg Nisin,100℃煮沸。分別測定滅菌當天、在37℃保溫貯藏7 d與21 d的飲料的菌落總數(shù),從而初步確定有效的殺菌方式。
1.4.3 鐵皮石斛穩(wěn)定性的測定通過有效滅菌處理的鐵皮石斛飲料在(25±1)℃的培養(yǎng)箱中進行16 周貯藏試驗,每隔1周測定一次菌落總數(shù)、多糖含量、總酚含量、pH及色差度,分析其在不同滅菌條件下貯藏期內(nèi)的穩(wěn)定性。
(1)多糖含量采用改良的苯酚-硫酸法測定[23]。
①葡萄糖標準曲線的確定。精密稱定烘干至恒重的無水葡萄糖對照品0.1 g,用蒸餾水定容至100 mL,取9 mL 溶液至100 mL 容量瓶中加蒸餾水定容至刻度,即得每1 mL含90μg的溶液。
②標準曲線的確定。精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于15 mL 具塞試管中,各加蒸餾水補至1.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,再精密加濃硫酸5 mL,搖勻,置沸水浴中加熱5 min,取出,置冰浴中冷卻,以相同體積蒸餾水為空白,用紫外-可見分光光度計在485 nm 的波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標,繪制標準曲線。
③供試品溶液的制備及測定。取樣品粉末(過三號篩)約0.3 g,精密稱定,加水100 mL(V1),加熱回流2 h,放冷,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,補水至刻度,搖勻,過濾,精密量取過濾液2 mL(V2),置于15 mL離心管中,精密加入無水乙醇8 mL,搖勻,冷藏1 h,取出,5000 r/min離心5 min,棄上清液,沉淀加80%乙醇洗滌2次,每次8 mL,棄上清液,沉淀加熱水溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL(V3)容量瓶中,放冷,加水至刻度,搖勻,即得。
精密量取供試品溶液0.3 mL(V4),蒸餾水0.7 mL,置于15 mL具塞試管中,照標準曲線確定項下的方法,依法測定吸光度,從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量,計算如式(1)。
式中,C為根據(jù)標準曲線得到的多糖含量,V1為樣品提取時定容體積,V2為沉淀多糖時取液量,V3為測定多糖時定容體積,V4為樣品測定時取樣液體積,m為樣品稱量質(zhì)量。
(2)采用福林酚比色法測定總酚含量。
①標準曲線的確定。精確稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品5 mg,用蒸餾水溶解并定容至25 mL棕色量瓶中,即得0.2 mg/mL 對照品溶液。精密量取標準溶液0.00、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL,分別置于15 mL 試管中,加入福林試劑0.5 mL,充分搖勻,再加入20%NaCO3溶液1.5 mL,搖勻,定容至10 mL,搖勻,50℃水浴加熱10 min,以蒸餾水為空白,于765 nm 處測定吸光值。
②供試品溶液的制備及測定。精密稱取0.3 g(m)樣品置于100 mL具塞錐形瓶,加50%乙醇50 mL(V1),稱定質(zhì)量,于80℃水浴回流1 h后取出冷卻,再稱重,用50%乙醇補足減失質(zhì)量,過濾,續(xù)濾液作為供試品。量取0.5 mL(V2)待測液,按照標準曲線確定項下方法測定其吸光值,代入式(2)計算其總酚含量。
式中,C為根據(jù)標準曲線計算得到的蘆丁含量,V1為提取液體積,V2為測定時提取液的體積,m為樣品質(zhì)量。
1.4.4 菌落總數(shù)的測定參照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》(GB/T 4789.2—2022),在無菌超凈工作臺上,取1 mL 飲料原液和10 倍的稀釋液分別加入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi),試驗設(shè)置3個重復,每皿內(nèi)加入適量營養(yǎng)瓊脂,冷卻凝固后將其密封并倒置于(36±1)℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后觀察計數(shù)。
1.4.5 色差度測定采用UltraScan VIS 型全自動色差儀(總透射模式)對鐵皮石斛飲料的色澤進行測定,色澤穩(wěn)定性結(jié)果以L、a和b值表示。
1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有試驗結(jié)果數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進行方差分析。
鐵皮石斛飲料營養(yǎng)豐富,pH 5.28,屬于中性飲料,微生物更容易生長繁殖,一般的巴氏殺菌達不到食品殺菌要求,因此探究殺菌工藝是必不可少的。由于致病性O(shè)157大腸桿菌在75℃、1 min 時即可被殺死,因此對于本試驗7 種殺菌方式的篩選,可以只檢測菌落總數(shù)而不檢測大腸菌群。
石斛飲料裝瓶滅菌后,取各滅菌條件下的6 瓶飲料置于37℃培養(yǎng)箱中放置7、21 d,再用培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)觀察細菌菌落總數(shù)。由表1可知,7種殺菌方式在滅菌當天的菌落總數(shù)均為0 cfu/mL,37℃貯藏7、21 d后,M6 處理的飲料中菌落總數(shù)均超過了100 cfu/mL,其他滅菌方法能達到石斛飲料無菌的要求。
表1 不同殺菌方式的菌落總數(shù) cfu/mL
采用能有效殺滅鐵皮石斛飲料中微生物的滅菌處理M1~M4、M5、M7在(25±1)℃的培養(yǎng)箱中進行貯藏試驗,由于M1處理的鐵皮石斛飲料在貯藏5~16周期間,每次至少出現(xiàn)3管(總共6管)飲料腐敗變質(zhì);M2處理也存在部分腐敗變質(zhì)現(xiàn)象,所以將此2 種方法剔除;M4處理盡管不變質(zhì),但殺菌方式比M3時間長5 min,考慮到滅菌時間過長會降低營養(yǎng)成分,將此法剔除。因此,最終分別測定鐵皮石斛飲料在M3、M5、M7處理下貯藏0~16 周后的菌落總數(shù)、多糖含量、總酚含量、pH及色差度,分析其在不同滅菌條件下貯藏期內(nèi)的穩(wěn)定性。
分別在鐵皮石斛飲料貯藏過程中進行定期菌落總數(shù)的測定。在滅菌當天,M3 處理的飲料菌落總數(shù)為0 cfu/mL,M5和M7處理則為10 cfu/mL,M5、M7處理的飲料分別在貯藏1、2 周后達到0 cfu/mL,說明生物殺菌劑在貯藏過程中持續(xù)起作用。在貯藏過程中,3種滅菌方式的飲料菌落總數(shù)均達到了《果、蔬飲料衛(wèi)生食品安全國家標準飲料》(GB 7101—2022)規(guī)定的≤100 cfu/mL,說明3種滅菌處理的鐵皮石斛飲料在貯藏期內(nèi)可以保持良好的品質(zhì),不會發(fā)生腐敗變質(zhì)。
由表2可知,在16周的貯藏期間,3種殺菌條件下的鐵皮石斛飲料多糖含量均明顯下降,在殺菌0 d,相對鐵皮石斛飲料滅菌前即原液的多糖含量,M3 處理的多糖含量下降最多,達36 mg/100 mL,M5 和M7 下降較少,約13 mg/100 mL。在貯藏1周后,M5和M7處理的多糖含量幾乎不變,2 周后出現(xiàn)明顯下降,而M3的多糖含量在滅菌后下降明顯,在貯藏11周期間下降不明顯,這可能與M3殺菌條件過于劇烈,M5和M7中的生物殺菌劑Nisin、DMDC在貯藏期間緩慢起作用有關(guān)。滅菌當天和貯藏1 周,M5 的多糖含量顯著高于M3;滅菌當天和貯藏2周內(nèi),M7多糖含量也顯著高于M3。而隨著貯藏時間延長約16 周,M5 和M7 殺菌條件下其飲料多糖含量均出現(xiàn)明顯下降。
表2 不同滅菌條件鐵皮石斛飲料多糖含量變化mg/100 mL
由表3可知,3種殺菌方式鐵皮石斛飲料滅菌后的總酚含量均下降,比滅菌前的原液減少約0.50 mg/100 mL,均具有顯著差異,這可能與多酚類物質(zhì)在光照和高溫下易分解有關(guān)。隨著鐵皮石斛飲料貯藏時間的延長,3種殺菌方式總酚含量變化的趨勢大致相同,雖然貯藏期間會出現(xiàn)小波動,但總體上沒有出現(xiàn)明顯下降,說明鐵皮石斛飲料中酚類物質(zhì)在16周貯藏期間基本沒有發(fā)生氧化等化學反應,而貯藏期間總酚含量的小波動可能與試驗誤差有關(guān)。在同一貯藏期內(nèi),3種殺菌方式的總酚含量中,以M3、M7為佳,大于M5的總體趨勢。
表3 不同滅菌條件鐵皮石斛飲料總酚含量變化mg/100 mL
圖1表明,3種滅菌方式的鐵皮石斛飲料在滅菌前后的pH幾乎不變,均在5.30左右。隨著貯藏時間的延長,M3、M5 處理滅菌條件下鐵皮石斛飲料的pH 基本不變,且兩者pH 幾乎相等。M7處理下的鐵皮石斛飲料在貯藏1 周后pH 發(fā)生驟變,上升到6.46,在之后貯藏期間幾乎維持在6.50左右。
圖1 不同滅菌條件鐵皮石斛飲料貯藏過程中pH變化
在色度測定中,L表示亮度指數(shù),L值越大,亮度越大;a表示有色物質(zhì)的紅綠色度偏向,正值越大,偏向紅色的程度越大,負值絕對值越大,偏向綠色的程度越大;b表示有色物質(zhì)的黃藍色度偏向,正值越大,偏向黃色的程度越大,負值絕對值越大,偏向藍色的程度越大。
由圖2~4可知,3種滅菌條件下的鐵皮石斛飲料在滅菌前后色澤變化均明顯,L值、b值均下降,說明滅菌后的鐵皮石斛飲料的亮度、黃色程度均減小,a值絕對值減小,葉綠素被破壞,飲料綠色程度下降,與外觀現(xiàn)象一致,飲料殺菌后綠色明顯變淡。3 種殺菌方式的溫度均≥100℃,殺菌后的色澤與原液的對比結(jié)果表明溫度對飲料的色澤影響明顯。在16 周貯藏期間,M3殺菌條件下的鐵皮石斛飲料的色澤亮度L值在緩慢上升,在后期則趨于平穩(wěn)趨勢,a值和b值均處于變化平緩趨勢。相對于滅菌當天,M5處理下的飲料貯藏2周后色澤L值有增加趨勢,a值基本不變,b值在貯藏1周后出現(xiàn)了明顯下降,在2~16 周期間基本不變,期間出現(xiàn)的2次大波動,可能與樣品不均勻有關(guān)。M7殺菌方式的鐵皮石斛飲料中a值變化不大,其L值、b值波動較大,可能與M7 處理飲料pH 在貯藏期間上升有關(guān),出現(xiàn)飲料亮度和黃色程度值時高時低。
圖2 不同滅菌條件鐵皮石斛飲料L值貯藏過程中的變化趨勢
圖3 不同滅菌條件鐵皮石斛飲料a值貯藏過程中的變化趨勢
圖4 不同滅菌條件鐵皮石斛飲料b值貯藏過程中的變化趨勢
總體而言,與原液相比,鐵皮石斛飲料殺菌后L值、a絕對值和b值均減?。粡目偟内厔菘?,在貯藏期間,L值有較小的增加趨勢,a值和b值基本不變,外觀色澤沒有發(fā)生很大的變化??梢?,在25℃貯藏過程中鐵皮石斛飲料能保持良好的色澤穩(wěn)定性。
多糖是石斛莖的主要活性成分之一,具有增強免疫力、降血壓、降血糖、抗氧化及抗腫瘤等多種藥效[24-27]。飲料的殺菌工藝恰當與否,不僅影響產(chǎn)品的保質(zhì)期,而且影響產(chǎn)品的質(zhì)量。殺菌技術(shù)有熱力殺菌技術(shù)和非熱力殺菌技術(shù)2類。熱力殺菌中的巴氏殺菌是飲料生產(chǎn)工業(yè)上最普遍的殺菌方法,因為大多數(shù)果蔬飲料為pH<4.6的酸性飲料[28],乳飲料線生產(chǎn)殺菌型濃縮酸奶則主要采用溫度90~95℃、30 s巴氏殺菌[29]。鐵皮石斛飲料的pH 5.28,為中性飲料,巴氏殺菌不能使鐵皮石斛飲料達到商業(yè)殺菌標準,故本研究采用保溫試驗法篩選出有效的滅菌方法。在研究火龍果果汁飲料以及銀杏飲料制備工藝的殺菌工藝時,均采用保溫試驗進行篩選[30],霍山石斛運動飲料制作也選用90℃、殺菌20 min[4],與研究采用的高溫高壓滅菌方法類似。
采用能有效殺滅鐵皮石斛飲料中微生物的滅菌處理M1、M3、M5、M7 進行了16 周貯藏試驗,在貯藏過程中,發(fā)現(xiàn)M1 在貯藏第5 周后菌落總數(shù)不穩(wěn)定,菌落總數(shù)檢測中總是出現(xiàn)飲料腐敗變質(zhì)??梢姡瑑H以保溫試驗法篩選最佳殺菌工藝的方式不妥。為了確保飲料產(chǎn)品在貨架期內(nèi)的微生物都符合商業(yè)殺菌標準,飲料殺菌工藝應該在滅菌條件初步篩選后進行至少16 周貯藏試驗。
何磊[3]制作金釵石斛飲料采用的殺菌方式為121℃、15 min;鐵皮石斛原球莖飲料在納他霉素、Nisin 和殼聚糖3 種復合生物保鮮劑共同作用下達到商業(yè)殺菌標準[31];石斛枸杞菊花復合飲料在90℃水浴鍋中滅菌30 min,其菌落總數(shù)還是≥100 cfu/g;丁勇[5]在制作鐵皮石斛蘋果復合飲料,加熱90~95℃、滅菌15~20 min后,室溫儲藏2個月后檢測菌落總數(shù)≤3 cfu/mL;李蕾等[6]于115℃滅菌15 min 的鐵皮石斛雪梨飲料細菌總數(shù)≤50 cfu/mL,大腸桿菌≤3 cfu/mL。本試驗篩選出M3、M5、M7 這3 種殺菌條件,可見,石斛飲料在高溫或生物殺菌劑處理下具有較長的貨架期。
鐵皮石斛飲料經(jīng)M3、M5、M7 處理后在25℃下進行貯藏,在貯藏過程中,鐵皮石斛飲料的菌落總數(shù)均符合飲料的食品安全國家標準,但本產(chǎn)品中最主要的功能性成分多糖在貯藏期間含量明顯下降,與鐵皮石斛飲料中的多糖在180 d 貨架期內(nèi)不存在明顯變化[32]的研究結(jié)果不一致,這可能與飲料制作方式不同有關(guān),高壓滅菌將會導致石斛多糖損失,本試驗M3 處理下的石斛多糖也呈現(xiàn)一致的結(jié)果。3種滅菌條件下的飲料多糖含量與滅菌前原液相比,均顯著下降,M3處理即高壓滅菌方式后的多糖含量下降比M5、M7 處理多,說明生物殺菌劑在一定程度上減少了高溫高壓殺菌造成的營養(yǎng)成分損失量。但在分別貯藏1 周、2 周后,M5、M7處理下的多糖含量驟然下降,與M3處理的含量相當。M5 和M7 處理均使用了抑菌劑,且2 種方法對貯藏期內(nèi)多糖含量的影響基本一致,為節(jié)約成本,M5處理較優(yōu)。
Landl 等[33]研究認為飲料中的總酚含量變化與酚類物質(zhì)是否發(fā)生氧化、殘余多酚氧化酶酶活、果蔬品種等有關(guān)。飲料在pH 4~6 范圍內(nèi)可防止多酚類物質(zhì)的氧化。3種殺菌處理均導致鐵皮石斛飲料的總酚含量下降,但貯藏期間均沒有出現(xiàn)明顯下降,說明殺菌導致飲料中酚類物質(zhì)發(fā)生了氧化從而降解,由于鐵皮石斛飲料在pH 5左右,有效阻止了多酚類物質(zhì)的氧化。在同一貯藏期內(nèi),3 種殺菌方式的總酚含量大致呈現(xiàn)M3≈M7>M5 的趨勢,故在多酚含量方面,M3 和M7為較佳選擇。
M3和M5處理下的鐵皮石斛飲料pH均無明顯變化,這與徐路[31]觀察到的貯藏期間鐵皮石斛原球莖飲料pH降低的情況不同,可能與殺菌方式不同有關(guān)。而M7處理下的鐵皮石斛飲料在貯藏1周后升至pH 6左右,可能在Nisin和DMDC生物殺菌劑共同作用下,飲料中的蛋白質(zhì)被降解,釋放出堿性基團,導致pH 上升[34]。雖然16 周貯藏期間菌落總數(shù)在食品安全標準內(nèi),但考慮細菌更易滋生在堿性環(huán)境中,故M3、M5殺菌方式優(yōu)于M7。
與未殺菌原液相比,3 種殺菌方式均使樣品的L值、a絕對值和b值減小,本試驗測得殺菌后鐵皮石斛飲料總酚含量顯著下降,說明酚類物質(zhì)的反應及變化將引起飲料色澤的改變[35],并且鐵皮石斛飲料貯藏時間的色澤變化與總酚含量變化一致,L值有較小的增加趨勢,a值和b值基本不變,總體說明飲料色澤穩(wěn)定性良好。在25℃貯藏條件下,M3和M5的色澤變化趨勢更加平穩(wěn),故M3、M5殺菌方式較優(yōu)。
綜合考慮貯藏期間多糖含量、總酚含量、pH 以及色澤穩(wěn)定性,確定M3和M5為鐵皮石斛飲料的較優(yōu)殺菌方式,為此類飲料的開發(fā)生產(chǎn)提供一定參考價值。但當該方法應用于實踐生產(chǎn)中時,工藝還需要進一步完善,還需要做放大試驗。筆者只研究了未添加食品添加劑的鐵皮石斛飲料16 周貯藏期內(nèi)主要營養(yǎng)物質(zhì)含量、色澤穩(wěn)定性等變化趨勢,而成品在貯藏期內(nèi)的變化規(guī)律以及更長時間的貯藏品質(zhì)研究,還有待進一步深入探討。