任春梅，羅桂火，朱云，楊柳，繆倩，陸芳，程兆榜

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014；2龍巖技師學(xué)院，福建龍巖 364000；3江蘇省鹽城市大豐區(qū)劉莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇鹽城 224112）

0 引言

黃瓜綠斑駁花葉病毒(cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)是一種危害葫蘆科作物的重要病毒病害，可造成西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆、葫蘆和絲瓜等葫蘆科作物品質(zhì)和產(chǎn)量上的嚴(yán)重?fù)p失[1]。自1935 年在英國(guó)的黃瓜上首次報(bào)道以來(lái)[2]，目前在歐洲[3]、亞洲[4]、北美洲[5]、大洋洲[6]等20 多個(gè)國(guó)家均有發(fā)現(xiàn)。在中國(guó)，自2002年中國(guó)檢疫部門首次從日本進(jìn)口番木瓜種子中截獲CGMMV以來(lái)，目前遍及全國(guó)23個(gè)省份及地區(qū)[7-8]。

CGMMV 分布范圍廣，與病毒多種傳播方式密切相關(guān)，其不僅可通過(guò)種子帶毒進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，還可以通過(guò)花粉、土壤、嫁接砧木、農(nóng)事操作等進(jìn)行近距離傳播擴(kuò)散[9]。早期受侵染植株癥狀不明顯被忽視，染病后多種途徑的隱匿傳播，極易造成后期坐果或收獲階段病害的嚴(yán)重發(fā)生[10]。CGMMV對(duì)西瓜的直接影響是造成倒瓤，味苦不能食用；對(duì)黃瓜的直接影響是造成畸形，表皮斑駁凸起，嚴(yán)重影響商品性；對(duì)南瓜的直接影響是造成畸形，不結(jié)果不產(chǎn)籽，會(huì)導(dǎo)致瓜類作物嚴(yán)重的產(chǎn)量損失和經(jīng)濟(jì)損失[11-13]。

山東省壽光市是中國(guó)蔬菜之鄉(xiāng)，壽光蔬菜批發(fā)市場(chǎng)是全國(guó)最大的蔬菜集散中心，濰坊市壽光地區(qū)也是設(shè)施蔬菜主要產(chǎn)區(qū)，成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。此處是設(shè)施蔬菜冬暖式大棚蔬菜的發(fā)祥地，坐擁良好的地理位置及政策條件，無(wú)論是種植規(guī)模還是種植技術(shù)均走在全國(guó)前列，建有約4萬(wàn)hm2溫室大棚，其中冬暖棚約1.3萬(wàn)hm2、拱棚約2.7萬(wàn)hm2[14]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)僅黃瓜種植面積就達(dá)1 萬(wàn)hm2以上。因此選取壽光黃瓜作為調(diào)查對(duì)象，對(duì)CGMMV在地區(qū)和品種上的分布、危害現(xiàn)狀及病害發(fā)生特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)查研究，以期為山東高品質(zhì)蔬菜生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查對(duì)象、時(shí)間與地點(diǎn)

2017—2018 年在山東濰坊壽光市化龍鎮(zhèn)、稻田鎮(zhèn)、臺(tái)頭鎮(zhèn)、洛城街道、孫集鎮(zhèn)、何官鎮(zhèn)、田柳鎮(zhèn)、古城鎮(zhèn)、紀(jì)臺(tái)鎮(zhèn)及文家街道約15 hm2的黃瓜種植區(qū)進(jìn)行實(shí)地調(diào)查。

1.2 黃瓜品種劃分與樣品采集處理

按照目前市場(chǎng)需求劃分，壽光市主栽黃瓜品種分為光皮水果黃瓜和普通帶刺黃瓜。光皮水果黃瓜表皮光滑無(wú)刺，瓜長(zhǎng)約13 cm，直徑約3 cm；普通帶刺黃瓜，瓜長(zhǎng)約38 cm，直徑3 cm。

田間采樣時(shí)，采用五點(diǎn)采集法，每個(gè)點(diǎn)隨機(jī)采10片心葉，1片/株。采集的葉片裝于紙質(zhì)信封中，帶回實(shí)驗(yàn)室置-20℃冰箱中待處理。

1.3 樣品檢測(cè)方法

1.3.1 DAS-ELISA 法參考楊柳等[15]的方法取0.1 g 樣品置于1.5 mL離心管中，液氮研磨，加入1 mL碳酸鹽包被緩沖液溶解，4℃冰箱過(guò)夜。單克隆抗體包被結(jié)束后用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，封閉完成加入事先處理好的樣品，每孔100 μL，設(shè)置葫蘆病葉為陽(yáng)性對(duì)照、健康葉片為陰性對(duì)照，測(cè)定酶標(biāo)儀中OD450值，測(cè)出陰性對(duì)照的值N，若樣品OD值P≥2N，則視為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3.2 RT-PCR 法參考任春梅等[16]的方法，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)CGMMV 的特異性引物，上游引物5′-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3′，下游引物5′-TGGGCCCCTACCCGGGGAAAAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為700 bp，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。據(jù)Takara公司RNA提取試劑盒的說(shuō)明書提取0.1 g樣品總RNA，用20 μL DEPC 水溶解。按照常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 第一鏈。以1 μL cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色15 min，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.4 調(diào)查內(nèi)容

1.4.1 CGMMV 在壽光黃瓜上的地區(qū)分布根據(jù)壽光不同地區(qū)黃瓜種植面積，按照種植面積:調(diào)查面積為100:1的比例，選擇每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)10個(gè)大棚采集樣品，先肉眼觀察田間植株葉片是否有花葉、斑駁及皺縮等疑似癥狀，果實(shí)表面是否有斑駁、凸起，將疑似樣品裝于信封中注明采集地點(diǎn)及時(shí)間，帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。以地區(qū)為對(duì)象，統(tǒng)計(jì)本地區(qū)總計(jì)采集樣品數(shù)，檢出病毒樣品數(shù)，計(jì)算發(fā)病率；并通過(guò)大棚承包戶尋訪，以同期未感染CGMMV黃瓜作對(duì)照，統(tǒng)計(jì)對(duì)照產(chǎn)量(N)和實(shí)際產(chǎn)量(X)，以式(1)計(jì)算該地區(qū)損失率。

1.4.2 CGMMV 在不同品種黃瓜上的危害黃瓜有光皮水果和帶刺普通2 種類型，每種類型有不同的黃瓜品種，根據(jù)壽光地區(qū)品種應(yīng)用情況，隨機(jī)選擇管理?xiàng)l件一致的溫室大棚，按比例采集不同類型黃瓜上疑似CGMMV 癥狀的樣品，利用血清學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法檢測(cè)，計(jì)算發(fā)病率；采收時(shí)期，以未感染同類型黃瓜畝產(chǎn)量為對(duì)照，調(diào)查2種類型黃瓜的損失率。

1.4.3 CGMMV 在黃瓜上的全年發(fā)生動(dòng)態(tài)溫室大棚的建立打破了種植時(shí)間的限制，為迎合市場(chǎng)需要全年每月均可定植黃瓜。2018 年選定稻田鎮(zhèn)的10 個(gè)溫室大棚，每月跟蹤測(cè)定大棚氣溫，統(tǒng)計(jì)全年每月平均氣溫；每月采集固定數(shù)量的黃瓜樣品，統(tǒng)計(jì)黃瓜的發(fā)病率，分析CGMMV在黃瓜上全年發(fā)生動(dòng)態(tài)。

1.4.4 不同生育期黃瓜上CGMMV 發(fā)生情況黃瓜屬于連續(xù)采收型瓜果蔬菜，在無(wú)病毒病且管理得當(dāng)?shù)那闆r下，可連續(xù)采收果實(shí)3～5 個(gè)月。為探究黃瓜不同生育期感染CGMMV 的情況，將黃瓜分為伸蔓期（四葉一心至開花期）、開花期（75%植株開花）、結(jié)瓜期（根瓜坐?。?、成熟期（成熟至全部采收結(jié)束）[17]，明確CGMMV對(duì)黃瓜生長(zhǎng)影響最大的生育期。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

應(yīng)用分析軟件SPSS 17.0 及Excel 對(duì)CGMMV 造成黃瓜不同地區(qū)、品種、類型等的發(fā)病率及損失率進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各數(shù)據(jù)間的差異顯著性應(yīng)用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 壽光黃瓜上CGMMV的地區(qū)分布

前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，壽光地區(qū)因南北土壤性質(zhì)的差異，設(shè)施蔬菜主要分布在南方鄉(xiāng)鎮(zhèn)。表1 結(jié)果顯示，所調(diào)查的10 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均發(fā)生CGMMV，生長(zhǎng)后期發(fā)病率為21.30%～49.64%，其中稻田鎮(zhèn)造成的損失率高達(dá)28.05%。在壽光地區(qū)黃瓜上CGMMV仍普遍存在，推測(cè)原因是工廠式集約化育苗模式使帶毒種苗先在內(nèi)部傳播，再轉(zhuǎn)銷于種植戶，造成隱匿侵染源向外擴(kuò)散；嫁接技術(shù)的頻繁使用，加速CGMMV 傳播擴(kuò)散；種植戶缺乏對(duì)CGMMV 的認(rèn)識(shí)，農(nóng)事操作不加趨避，導(dǎo)致連片發(fā)生；相關(guān)檢疫部門重視力度不夠，病殘?bào)w隨意堆放，帶病種苗隨意傳播。

表1 壽光市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)CGMMV的發(fā)生情況

2.2 CGMMV在不同黃瓜品種上危害差異

表2的采樣檢測(cè)結(jié)果顯示，2種類型的黃瓜抗性存在一定的差異，光皮黃瓜發(fā)病率及損失率均顯著高于帶刺黃瓜，說(shuō)明光皮黃瓜的抗性比帶刺黃瓜低，此結(jié)果不僅可指導(dǎo)生產(chǎn)，也為抗病材料的篩選提供參考。

表2 光皮黃瓜和帶刺黃瓜CGMMV檢測(cè)

2.3 CGMMV在黃瓜上全年發(fā)生動(dòng)態(tài)

病害的流行受多方面的影響，例如光照、溫濕度、寄主等。由圖1可看出，1—12月定植黃瓜上CGMMV的變化與全年溫度變化呈正相關(guān)，病毒高發(fā)期集中在夏季高溫高濕階段，全年平均最高溫6、7、8 月發(fā)病率分別為63.33%、62.50%、42.67%，說(shuō)明CGMMV 的發(fā)生發(fā)展與溫度變化存在一定的關(guān)系。再者壽光蔬菜種植主要依靠溫室大棚，大棚內(nèi)溫度普遍高于外界溫度，因此高溫條件可能是造成病毒大面積流行爆發(fā)的誘導(dǎo)因素。

圖1 CGMMV全年變化規(guī)律

2.4 不同生育期黃瓜上CGMMV發(fā)生情況

不同生育期CGMMV 造成的損失各有差異。早期病害較輕，生長(zhǎng)后期病害較嚴(yán)重。伸蔓期平均發(fā)病率為7.25%，開花期平均發(fā)病率21.23%，結(jié)瓜期平均發(fā)病率23.34%，成熟期平均發(fā)病率34.11%。分析其原因，早期因嫁接感染、土壤傳播、種子傳毒等原因造成小部分感染，中期因農(nóng)事操作等直接接觸造成大面積傳播，后期同樣通過(guò)農(nóng)事操作繼續(xù)大面積傳播，最終造成前期危害面積小，而后期逐漸擴(kuò)大的局面。早期種子種苗帶毒是造成病害較大流行的根本原因，農(nóng)事操作是造成較大流行的主要原因，在生產(chǎn)過(guò)程中，一旦發(fā)現(xiàn)疑似病株應(yīng)及時(shí)清除避免交叉感染造成更大的危害。

3 結(jié)論與討論

山東省壽光地區(qū)現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)高度集中，種苗需求量日益增加，自此興起了許多種苗繁育工廠，農(nóng)戶所需蔬菜種苗均由種苗公司集中繁育、銷售，銷售范圍涉及全國(guó)各地。集約化高效生產(chǎn)也存在弊端，一旦種苗公司種苗出現(xiàn)問(wèn)題，病害將會(huì)快速大面積傳播。筆者調(diào)查了山東壽光10 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均不同程度受CGMMV危害，發(fā)病率在21.30%～49.64%之間，地區(qū)間存在著明顯的差異，可能與種植管理水平、品種抗性、品種來(lái)源及種植布局相關(guān)。其中稻田鎮(zhèn)以前以種植胡蘿卜和韭菜為主，近些年黃瓜收益較好，溫室大棚不斷興建，但種植經(jīng)驗(yàn)相對(duì)不足，缺乏病毒病預(yù)防意識(shí)。農(nóng)戶缺乏自己的判斷，對(duì)種苗來(lái)源、攜帶病毒與否以及抗性強(qiáng)弱等一概不知，缺乏必要的防治措施。農(nóng)戶對(duì)CGMMV認(rèn)識(shí)不深，不知曉CGMMV從何而來(lái)如何傳播，一旦出現(xiàn)病毒病就認(rèn)為是苗有問(wèn)題，拔除的病殘茬隨意堆放，病毒粒體極易擴(kuò)散傳播，給檢測(cè)部門工作造成極大不便。這也是造成壽光CGMMV 大面積流行爆發(fā)的主要原因。因此，相關(guān)部門應(yīng)做好農(nóng)戶的培訓(xùn)工作，加強(qiáng)農(nóng)戶對(duì)CGMMV 的認(rèn)知及病害的防范措施，規(guī)范種苗公司種苗繁育，實(shí)行種苗規(guī)范經(jīng)營(yíng)，達(dá)到種苗健康標(biāo)準(zhǔn)才可給予銷售。

一般高溫條件下病毒病易發(fā)生，溫度越高發(fā)病速度越快[18]。研究表明，溫度影響植物病毒的傳播和癥狀在宿主植物中的表達(dá)，在29℃條件下，CGMMV 在黃瓜植株體內(nèi)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移速度明顯快于24℃條件[19]。由此推測(cè)一定條件的高溫處理能促進(jìn)病毒快速增殖。本調(diào)查結(jié)果顯示，全年6、7、8月月均溫超過(guò)25℃，溫室大棚月均溫度超過(guò)29℃。全年CGMMV 流行規(guī)律與年溫度變化規(guī)律呈正相關(guān)，在平均溫度較低的月份病毒發(fā)生較輕，溫度較高月份病毒病發(fā)生普遍較重，可見(jiàn)溫度是促進(jìn)病毒病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。因此，夏季尤其要注意病毒病的發(fā)生。

自然生長(zhǎng)條件下，生育前期病毒病發(fā)病輕，越到生長(zhǎng)后期發(fā)病越嚴(yán)重。調(diào)查研究表明，山東壽光地區(qū)生育前期病毒病發(fā)病較輕?？赡苁且?yàn)樵缙诜N苗帶毒或者前茬土壤帶毒，前期帶毒率不高，農(nóng)事操作日益頻繁，將病毒傳播開，造成后期發(fā)病嚴(yán)重。研究表明，西瓜種子傳毒率為2.25%，甜瓜種子傳毒率為2.83%[20]。一般來(lái)說(shuō)種子帶毒率高、傳毒率低難以造成大面積流行，但研究表明感染CGMMV病株經(jīng)整枝打杈可鄰近傳播至少9株以上[21]。自大面積推廣嫁接苗種植方式后，哪怕種子傳毒率低，也可通過(guò)嫁接或整枝打杈的方式大面積傳播。由此，嫁接及日常整枝打杈可能是造成黃瓜生育后期發(fā)病越來(lái)越重的原因，因此健康種苗的培育顯得尤為重要。

隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展，病毒病已成為困擾種植戶的一個(gè)難題。本研究對(duì)全國(guó)主要設(shè)施蔬菜生產(chǎn)基地之一的山東壽光黃瓜上CGMMV 進(jìn)行了一次系統(tǒng)調(diào)查，統(tǒng)計(jì)分析了目前此病害在山東壽光黃瓜上的分布和危害，針對(duì)性提出了該病害的防治指導(dǎo)意見(jiàn)，為本地黃瓜的安全生產(chǎn)提供技術(shù)參考，提升了壽光蔬菜的口碑，增加了產(chǎn)業(yè)效益。當(dāng)然在本研究的基礎(chǔ)上，還需弄清病毒的侵染源，對(duì)黃瓜進(jìn)行抗病性篩選，明確病毒的流行規(guī)律等，以期從源頭上控制病毒，選出抗性較強(qiáng)又適合市場(chǎng)需求的品種，制定出適合壽光地區(qū)黃瓜病害的綜合防控措施，為蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展保駕護(hù)航。