馬迪，肖文芳，李佐，張俊衛(wèi)，陳和明，呂復兵

（1華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院，武漢 430070；2廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

蘭科(Orchidaceae)植物總稱蘭花，是被子植物最大的科之一，約有800個屬28000多個種，除兩極和極端干旱的沙漠外，廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，幾個世紀以來一直是植物學家們研究的熱點[1]。蘭科植物在花部特征上呈多樣化，包括漫長的花期、豐富的花色、奇特的花形等，其作為觀賞植物在國際市場上備受歡迎[2]?；ㄏ闶翘m科植物重要的觀賞性狀之一，由一系列復雜的親脂性、高熔點的低分子揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)組成，在吸引昆蟲傳粉者對其授粉、抵御病原體侵害、與周圍環(huán)境互作等方面都起著至關重要的作用；此外，花香成分還廣泛應用于香水、化妝品、醫(yī)藥甚至調味品等領域[3-4]。

近年來，隨著代謝組學等生物技術的發(fā)展，已經(jīng)鑒定出了部分植物的花香成分，同時分離出了負責植物VOCs 生物合成和調控途徑的候選酶基因。然而，由于蘭花具有較長的生命周期以及復雜而龐大的基因組，人們對蘭花花香合成及調控途徑所知甚少，與其他植物相比，蘭科植物花香成分相關研究仍處于起步階段[5-6]。目前，關于蘭科植物花香成分的研究主要集中在VOCs 的檢測及鑒定上，花香成分主要分為萜烯類化合物、苯丙環(huán)類/苯丙類化合物、脂肪酸衍生物等3類，其中萜烯類化合物是大部分蘭科植物的最主要花香成分。蘭科植物的VOCs 復雜多變，導致在對其進行檢測時極易受到各種因素影響。至于花香成分的生物合成及相關代謝調控途徑等，僅有少部分萜烯類途徑被明確報道。筆者綜述不同蘭科植物花朵香氣成分的異同、影響花香成分檢測的因素及相關合成調控因子，旨在為蘭科植物花香物質的利用、香花品種選育提供參考。

1 蘭花花香成分

1.1 蘭花花香成分生物合成途徑

基于揮發(fā)性有機物的結構性質和合成方式，通常將蘭花花香成分歸為萜類化合物、苯丙烷類/苯環(huán)類化合物以及脂肪酸衍生物3類[7-8]。

萜類化合物廣泛存在于各種植物中，是植物花香成分中最大的一類，包括單萜、倍半萜、雙萜、三萜等各類物質[9-10]。萜類化合物的基本骨架為異戊二烯(C5)，主要通過2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-methy-Derythrito- 4- phosphate，MEP) 途徑和甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)途徑2 條途徑生成萜戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，IPP 和DMAPP在一系列酶的作用下完成各種萜類物質的合成及修飾[11-13]（圖1）。

圖1 蘭科植物花香成分的生物合成途徑

丙烷類/苯環(huán)類化合物為第二大類的植物花香成分，由莽草酸(shikimate，SA)途徑中合成的芳香族氨基酸苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)通過各種酶的催化生成苯甲醛/醇、苯乙醛等化合物[14-16]。

脂肪酸衍生物是含量最少的一類，亞油酸和亞麻酸在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)作用下生成氫過氧化合物中間體，經(jīng)一系列催化反應生成茉莉酸甲酯和其他脂肪酸衍生物[17-18]。

1.2 常見蘭花花香成分

目前，多種蘭花的花香成分已被檢出（表1）。綜合檢測結果來看，不同種屬間的蘭花花香成分存在異同，且揮發(fā)物的相對含量也存在差異。袁媛等[21]分析了9 個不同品種的蕙蘭花朵揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)所有品種均含有金合歡醇及茉莉酸甲酯，除‘鄭孝荷’外，在另外8 個品種中的相對含量均較高，但不同品種中的其他主要成分則不盡相同，‘適圓’、‘大一品’和‘金奧素’中均含有α-愈創(chuàng)木烯，香葉醇則僅在‘適圓’和‘仙綠’中檢測到。夏科等[42]對7 種不同的石斛蘭鮮花進行了GC-MS 分析，發(fā)現(xiàn)各品種中均存在(1R)-(+)-α-蒎烯和順式-β-羅勒烯，其中順式-β-羅勒烯在翅梗石斛中含量最高，(1R)-(+)-α-蒎烯在鼓槌石斛中含量最高，而檜烯僅存在于春石斛‘818’中。在鳥喙文心蘭、蜜糖文心蘭和卡特蘭‘大新1 號’中，含量最高的揮發(fā)性有機物均為(順)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯[33,53]，但其他香氣成分各不相同，鳥喙文心蘭主要為丁羥甲苯和十四烷，蜜糖文心蘭主要為α-蓽澄茄油烯和(反)-3-己烯-1-醇，卡特蘭‘大新1 號’則主要為苯甲醛和甲苯；大花惠蘭‘Sunny bell’和熒光蝴蝶蘭的花香主要組成成分均為芳樟醇，但在2 個不同種中芳樟醇的相對含量并不相同[25,47]。

表1 部分蘭花花朵主要揮發(fā)性成分

從花香成分的類型看，萜烯類化合物在蘭花花香成分中占有主導地位。倍半萜金合歡醇是蕙蘭、春蘭中相對含量最高的花香組成成分[21,27]；而文心蘭多數(shù)品種中花香組成成分含量最高的羅勒烯及其異構體(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯也是萜烯類物質[29-33]；蝴蝶蘭的主要組成成分為單萜類的芳樟醇和沉香醇[44-49]。但也有部分蘭科花卉的花香物質主要成分為苯丙烷類/苯環(huán)類化合物或者脂肪酸衍生物。如文心蘭‘白仙女’和‘紅夢香’的花香主要成分為苯乙醛和苯甲醛[34]，大花惠蘭‘大鳳’的則為脂肪酸衍生物亞麻酸乙酯和亞油酸甲酯[24]，這2 種物質同時也是鼓槌石斛和大包鞘石斛中含量較大的揮發(fā)性化合物[43]，而大花奇唇蘭的花朵主要揮發(fā)物為己醛和脂肪酸衍生物乙酸十六酯[59]。石斛蘭略有不同，主要揮發(fā)性有機物組成成分更為豐富，萜烯類、苯丙烷類、脂肪酸衍生物的含量不相上下，不同種中的組成和占比均不相同[36-43]。

花朵中某一種揮發(fā)性有機物含量并不能準確反映出它對花朵整體香氣的貢獻程度，香氣強度值為某一組分揮發(fā)物的含量與其香氣閾值的比，是衡量揮發(fā)性物質對香氣貢獻度的重要指標，揮發(fā)物的香氣強度值越大，對香氣的貢獻也就越大，而不同揮發(fā)物的香氣特征則決定了其嗅感類型[62]。不同蘭花的花香由其花朵揮發(fā)物中香氣強度值高的幾種主要致香成分決定，具有香甜氣味的茉莉酸甲酯和金合歡醇是蕙蘭、建蘭‘小桃紅’產(chǎn)生濃郁香味的主要物質[21-22]，而蜜糖文心蘭和香水文心蘭的主要賦香成分是橙花油氣味的3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯[31,33]，香氣閾值較低的水果香味的乙酸辛酯、木香味的α-蒎烯、香甜味的3-蒈烯和花香味的羅勒烯等是多數(shù)石斛的主體香氣成分[37-40]；花香型的芳樟醇是蝴蝶蘭的關鍵致香成分，也是大多數(shù)蘭科植物的香氣特征物質之一[45-47]。嗅感無香的蘭花花朵也存在揮發(fā)性成分，嗅感不具花香的蝴蝶蘭花朵中揮發(fā)性成分主要是反式-壬烯醛和黃瓜醛，但也能檢測到微量的致香成分芳樟醇和香葉醇，但其微量揮發(fā)未達嗅覺閾值[51]。

2 蘭花花香成分檢測的影響因素

2.1 采樣時期

同一朵花在不同開花時期、同一開花時期一天中的不同時段所釋放出來的揮發(fā)性有機物的種類和含量均不相同。黃昕蕾等[36]檢測發(fā)現(xiàn)鼓槌石斛在花蕾期、始花期、盛花期、衰敗期檢測出的花朵揮發(fā)性成分種類分別是3、6、31、5種，不同花期揮發(fā)性成分的種類和釋放量皆呈先上升后下降的趨勢,在盛花期達到最高，而盛花期花朵隨一天中開放時段的不同，香氣成分種類和釋放量也呈先上升后下降的趨勢，在14:00 時達到最高。軛瓣蘭不同花期香氣成分的變化和雜種卡特蘭‘3G’不同開花階段的揮發(fā)性有機物變化與鼓槌石斛的一致，都是在盛花期揮發(fā)性有機物的相對含量最高，種類最多[52,55]。蝴蝶蘭‘Nobby's Pacific Sunset’在完全盛開的第8天9:00—13:00香味濃度最高，9:00時達到峰值，白天的主要香氣物質為芳樟醇，而在夜間（19:00—次日03:00）α-法尼烯的揮發(fā)量增加，芳樟醇則減少[48]。大葉蝴蝶蘭的主要致香物質芳樟醇在4:00—10:00 內釋放量開始逐步增加，10:00—16:00達到峰值，然后逐漸減少[45]。

2.2 采樣部位

蘭花花器官分為花瓣、萼片、唇瓣和合蕊柱，不同種類的蘭花花朵不同部位的揮發(fā)性有機物釋放量和種類并不相同。檢測發(fā)現(xiàn)雜交蘭‘K18’的花瓣釋放的揮發(fā)性成分種類最多，達21 種，主要成分為β-石竹烯(37.90%)，唇瓣釋放的主要成分為β-羅勒(48.26%)，合蕊柱釋放的揮發(fā)物種類最少，僅13種[26]。黃綠花色的細莖石斛中，同樣是花瓣釋放的揮發(fā)性物質種類最多，達27種[40]。文心蘭‘Rosy Sunset’的花瓣和萼片是花朵揮發(fā)物釋放的主要部位，且芳樟醇是相對含量最高的揮發(fā)物，而唇瓣和合蕊柱的主要揮發(fā)性成分組成與花瓣和萼片并不相同，以苯甲醛、β-月桂烯和β-石竹烯為主，且釋放量較低[35]。顏鳳霞等[28]從西藏虎頭蘭的花瓣、唇瓣和合蕊柱中分別鑒定出72、66和62種化合物，發(fā)現(xiàn)花瓣是西藏虎頭蘭的主要香氣釋放部位。但蕙蘭‘守良梅花’花朵揮發(fā)性有機物卻主要由合蕊柱釋放[63]。

2.3 采樣環(huán)境

進行花朵揮發(fā)物檢測時樣品所處的環(huán)境會影響其揮發(fā)物的釋放，進而影響檢測結果。多種環(huán)境因素中，溫度和光照是影響蘭花揮發(fā)性有機物的主要因素。通常種植在陽光充裕、溫度稍高處的蘭花香味會更濃郁，有學者觀測到大葉蝴蝶蘭在光照充足的上午香味最濃，到下午香味明顯減弱[44]。另外，光質對蘭花花朵揮發(fā)性物質釋放也有一定影響，藍光、遠紅光相較于紅光更能促進單萜物質的積累[45]。高溫同樣會促進文心蘭花朵揮發(fā)物的釋放，香水文心蘭在30℃時能檢測出43種揮發(fā)物，其中羅勒烯、α-蒎烯、芳樟醇相對含量均大于20%，而在10℃時僅能檢測出24 種物質，僅有羅勒烯相對含量大于1.00%[29]。

2.4 檢測技術

在對蘭花花朵的揮發(fā)性有機物進行提取檢測時，最常采用的為固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術。固相微萃取的收集時長和吸附材料等不同，氣相色譜和質譜儀器及操作條件的差異都會導致檢測出來的揮發(fā)性物質成分和含量產(chǎn)生差異。張瑩等[29]和陳藝荃等[30]均采用固相微萃取法對香水文心蘭的花朵揮發(fā)性成分進行檢測，但檢測時所用的吸附柱材料和質譜儀均不相同，檢測出來的主要揮發(fā)性物質也不相同。在蝴蝶蘭‘Nobby’s Pacific Sunse’花香物質檢測中使用了5種不同的固相微萃取吸附柱，包括100 μm PDMS、85 μm 聚丙烯酸酯、65 μm CW/DVB、85 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，結果表明吸附涂層為50/30 μm的DVB/CAR/PDMS吸附柱萃取能力最佳[48]。針對篦葉蘭不同個體的花朵進行揮發(fā)性成分檢測時，采用PDMS涂層的萃取柱萃取15 min，檢測出的揮發(fā)性成分十分單一，主要為2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，在大多數(shù)個體中的占比均超過99%[57]。

3 蘭花花香成分合成及調控相關基因

萜烯類化合物是部分具花香蘭花花朵的主要致香成分。針對蘭花花香揮發(fā)性物質合成與調控相關基因的研究多集中在萜烯類物質代謝途徑中（表2），相對而言苯環(huán)/苯丙烷類和脂肪酸衍生物代謝途徑中相關基因的研究則較少[64,65]。

表2 部分蘭花揮發(fā)性物質調控因子

萜類合成酶基因(TPS)是萜烯類物質合成途徑中的關鍵基因之一。陳藝荃等[30]在3種文心蘭轉錄組中篩選出了5個TPS基因，其中OnTPS4在3個品種中均高表達，說明OnTPS4在3個品種中對香氣的形成均起到重要作用，而OnTPS3僅在‘黃夢香’中表達量較高，而OnTPS1、OnTPS2、OnTPS5則在香水文心中表達量偏高，是調控香水文心蘭萜類化合物合成的重要基因。TPS基因家族成員DoTPS10和DoGES1基因在鐵皮石斛中分別負責將GPP轉化為芳樟醇和香葉醇，在鐵皮石斛整個開花階段均高表達，并且通過外源施加茉莉酸甲酯(methyljasmonate，MeJA)能夠明顯上調DoTPS10和DoGES1的表達量，從而促進鐵皮石斛花香物質成分中芳樟醇和香葉醇的積累，表明DoTPS10和DoGES1是調控鐵皮石斛花香主要成分芳樟醇和香葉醇的重要基因[66-67]。Chuang 等[7]對熒光蝴蝶蘭的研究發(fā)現(xiàn)PbGDPS可能在調控單萜物質（香葉醇和芳樟醇）的生物合成中起關鍵作用，PbTPS5和PbTPS10的表達量與芳樟醇和香葉醇的產(chǎn)量基本一致。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是萜類物質生物合成MVA途徑中的關鍵酶之一，萼脊蘭中SjHMGR基因在盛花期高表達，在蕾期則幾乎不表達，且在營養(yǎng)器官低表達，而在花瓣、萼片中高表達，說明其與萼脊蘭花香物質合成可能密切相關[68]。

MYB類轉錄因子在花香化合物苯丙素類/苯丙環(huán)類化合物、脂肪酸類衍生物合成中起著重要作用[69]。蘭屬‘Sael Bit’盛花期花朵的主要揮發(fā)性成分為2-甲基丁醛、2-甲基戊醛和Z-2-辛烯醛等苯環(huán)類化合物，CsMYB1可以調節(jié)苯丙素類/苯類化合物的合成，且CsMYB1在其整個開花階段均有表達，其中盛花期表達量最高，且其在花瓣和合蕊柱中的表達量高于萼片[23]。茉莉酸甲酯是蕙蘭的主要致香成分之一，Xu等[70]對其4 個CfMYB基因進行了克隆并轉化煙草，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草茉莉酸甲酯合成途徑中的CfAOC（丙二烯氧化物環(huán)化酶基因）和CfJMT（羧甲基轉移酶基因）的啟動子被激活，茉莉酸甲酯的積累增多，表明CfMYB能夠調控茉莉酸甲酯的合成。

4 問題及展望

隨著生物技術的不斷進步，花卉定向育種取得了顯著成果，花香作為觀賞花卉最重要的觀賞性狀之一，也越來越受到重視。花香除具有吸引昆蟲授粉、抵御病原體和防止有害生物侵害等作用，還廣泛應用于香水、化妝品、醫(yī)藥等領域，具有極高的價值?！疤m為王者香”，作為中國傳統(tǒng)名花，國蘭泛指蘭屬花卉，具備濃郁的芳香，而顏色艷麗、商品化程度極高的熱帶蘭卻基本不具芳香或香味極淡。但不論是對濃郁芬芳的蘭屬，還是對色彩艷麗的蝴蝶蘭屬等蘭科植物的花香相關研究均處于起步階段，遠遠落后于玫瑰、茉莉等物種。因此對蘭科植物花香成分的研究還有待深入。

目前，關于蘭科植物花香成分的研究主要還存在一些問題：（1）關于蘭花花香成分的研究主要集中在單個品種或同屬品種的成分檢測鑒定上，缺乏快捷高效的技術分離蘭花花中各種花香成分。（2）對于蘭科植物花香相關物質的完整合成途徑和轉錄調控均不太清楚，且三大合成途徑中只有萜烯類化合物的合成途徑相關基因有少量研究。（3）調控花香化合物代謝的關鍵基因及調控機制的研究缺乏，導致分子標記輔助育種、轉基因研究及定向改良十分困難，嚴重限制了蘭科植物的進一步高效利用。

針對以上問題，筆者認為有關蘭科植物花香性狀的未來研究方向可以圍繞以下方面進行：（1）可同時對某種或多種香型和無香型蘭花的父母本、姊妹株系花香成分等進行分析鑒定，探究其遺傳規(guī)律和分離規(guī)律等，為香花蘭花的選育提供一定的依據(jù)。（2）可參考其他植物相關萜烯類、苯丙類/苯丙環(huán)類、脂肪酸類化合物的生物合成途徑、轉錄因子及分子調控機制，或基于目前已完成測序的蘭科植物基因組數(shù)據(jù)庫，深入篩選挖掘花香相關基因，完善蘭科植物相關花香化合物的合成代謝途徑，為香花育種提供完整的理論支持。（3）可利用瞬時轉染和穩(wěn)定轉染等載體介導技術將香花基因轉入無香蘭花品種，從而達到無香優(yōu)良品種定向改良為香花品種，有香品種定向改良有效或高價值成分含量進一步提高，這將是今后的研究重點和目標。