岳新麗，湛潤生，牛雅玉，王慧，邢寶龍，馬濤

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所，山西大同 037008；2大同黃花產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，山西大同 037008；3山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009）

0 引言

中國鹽堿地大約有9913 萬hm2，大約占全國可利用土地面積的4.88%[1]。鹽脅迫對植物的生長和產(chǎn)量具有重要的影響[2]，屬非生物脅迫，低濃度鹽脅迫時對植物生長具有抑制作用，高濃度鹽脅迫可使植物死亡[3]。造成植物危害的原因較多，包括營養(yǎng)不良引起的離子毒性、滲透脅迫和離子拮抗作用等[4]。鹽脅迫與滲透調(diào)節(jié)劑（例如甘油、甜菜堿等）、內(nèi)源激素（油菜素甾體、植物生長素等）以及抗氧化酶（過氧化物酶等）等密切相關(guān)[5]。鹽脅迫下對種子萌發(fā)介質(zhì)產(chǎn)生影響，降低了種子吸收水分的能力，減少種子儲備的利用，限制細(xì)胞分裂，影響植物的生長發(fā)育[6-8]。植株在幼苗時期是最敏感的時期，這個時期植株對外界的抵抗力最弱，根系分解吸收養(yǎng)分能力較弱，葉片光合作用效率低，很容易形成死苗或弱苗。因此，種子萌發(fā)和幼苗階段是種子適應(yīng)鹽堿環(huán)境的關(guān)鍵時期。

黃花菜也被稱為金針、檸檬萱草、豬籠草，屬于百合科萱草屬多年生草本植物，根幾乎肉質(zhì)，中下部常有梭形擴(kuò)大[9]。花被淺黃色、橙紅色和深紫色。黃花菜的花蕾呈黃綠色，富含多種維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，未開放表現(xiàn)為均勻修長、肉質(zhì)飽滿且清香撲鼻，營養(yǎng)價值相對比較高，具有多重保健功效[10]。據(jù)研究黃花菜的提取物中含有蒽醌類、黃酮類等成分，具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜安神、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和抗氧化等功效[11-12]。它在早春播種，具有較高的園林綠化價值。大同黃花種植面積位列全國第二，2021年大同市黃花菜種植面積為1.77×104hm2。截至2019 年初，大同市有耕地3.65×105hm2，其中鹽堿耕地4.18×104hm2，占總耕地面積的11%[13]，鹽堿化已經(jīng)成為影響當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要因素。筆者研究NaCl 脅迫對大同黃花菜種子萌發(fā)以及幼苗生長的影響，旨在為當(dāng)?shù)攸S花菜產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2021 年4—6 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所實驗室完成。

1.2 試驗材料

試驗所用黃花菜種子、種苗均為大同黃花，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所提供。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 黃花菜種子萌發(fā)的NaCl 脅迫試驗室溫下將黃花菜種子在無菌水中浸泡24 h，用鑷子在培養(yǎng)皿中小心剝?nèi)シN皮，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗去皮種子3 次，0.1%次氯酸鈉浸泡去皮種子10～12 min，隨后用無菌水浸洗搖晃5 次，每次1 min，最后用無菌濾紙將種子表面的水分吸干[14]，待用。

黃花菜種子在培養(yǎng)皿中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，以蒸餾水處理為對照，5 個NaCl 濃度分別為40、80、120、160、200 mmol/L，對照及NaCl濃度處理均設(shè)3 個重復(fù)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括1/2MS 培養(yǎng)基、瓊脂、蔗糖、酪蛋白，各NaCl 濃度處理添加不同質(zhì)量NaCl，形成不同NaCl 鹽濃度培養(yǎng)基。培養(yǎng)基及試驗用器具滅菌后，在超凈工作臺預(yù)冷、倒平板，待1/2MS培養(yǎng)基凝固并晾干培養(yǎng)皿中水分，每個培養(yǎng)皿接種50 粒黃花菜種子，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每48 h觀察培養(yǎng)皿，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、鹽害指數(shù)。共觀察20 d。

1.3.2 黃花菜種苗期的NaCl 脅迫試驗選取長勢一致的黃花菜種苗90 株，每個花盆等間距種植5 株，共18盆，實驗室內(nèi)自然光照培養(yǎng)。以蒸餾水處理為對照，5個NaCl 濃度分別為40、80、120、160、200 mmol/L，對照及NaCl濃度處理均設(shè)3個重復(fù)。試驗期間，24 h統(tǒng)計一次各處理種苗的高度，隨后澆不同鹽濃度溶液50 mL。20 d后采集黃花菜葉片測定質(zhì)膜透性，以及MDA、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量共5項生理指標(biāo)。

1.4 試驗方法及數(shù)據(jù)處理

生理指標(biāo)參照李小方、張志良[15]編著教材的試驗方法，膜透性測定采用電導(dǎo)法，脯氨酸含量采用水浴浸提法，丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[16]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法。發(fā)芽試驗相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法參照劉攀[7]的方法進(jìn)行。

數(shù)據(jù)作圖采用Excel 和WPS Office 軟件完成，數(shù)據(jù)方差分析采用SPSS 18 軟件完成，平均數(shù)間的多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度對黃花菜種子萌發(fā)的影響

由表1 可見，經(jīng)過不同濃度NaCl 處理后，黃花種子發(fā)芽率均比對照低，NaCl脅迫對黃花種子萌發(fā)具有明顯的抑制作用。當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到120 mmol/L 時，雖然與對照組相比黃花菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)呈明顯下降趨勢，鹽害指數(shù)呈明顯上升趨勢，但與其他鹽濃度相比黃花菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均有所上升，鹽害指數(shù)也有一定程度的降低。結(jié)果表明，NaCl 脅迫抑制了黃花菜種子的萌發(fā)，但是在鹽濃度在120 mmol/L左右時，NaCl脅迫對黃花菜種子萌發(fā)的抑制作用在一定程度上有所減弱。

表1 不同NaCl濃度下黃花菜種子萌發(fā)情況統(tǒng)計表

2.2 不同NaCl濃度對黃花菜幼苗生長發(fā)育的影響

由圖1看出，對照組種苗前期生長并不是很明顯，從第6 天開始，種苗高度呈現(xiàn)出急劇增長的趨勢。NaCl處理對黃花菜種苗的生長具有一定的抑制作用，但是黃花菜種苗仍然以非常緩慢的趨勢生長，如對照組種苗在試驗期間內(nèi)平均生長了15 cm，而鹽脅迫下的種苗最高只生長了8 cm，最低生長了3 cm。當(dāng)NaCl濃度為120 mmol/L 時，黃花菜種苗的生長發(fā)育較好，生長高度也遠(yuǎn)高于其他鹽濃度下的黃花菜種苗。

圖1 不同NaCl濃度下黃花菜幼苗生長發(fā)育圖

2.3 NaCl脅迫對黃花菜幼苗葉片膜透性、MDA含量的影響

由圖2～3可以看出，與對照相比NaCl處理黃花菜葉片質(zhì)膜透性、MDA 含量顯著增加(P＜0.05)。20 d內(nèi)，隨NaCl 濃度的增加，葉片細(xì)胞膜透性遞增。在10 d 內(nèi)，隨NaCl 濃度增加，各處理MDA 含量呈現(xiàn)遞增的趨勢；10 d 后，40～120 mmol/L 處理MDA 含量呈現(xiàn)上下波動趨勢，160～200 mmol/L 處理隨NaCl 濃度增加MDA 含量呈現(xiàn)遞增的趨勢。試驗期間，160、200 mmol/L NaCl 濃度處理質(zhì)膜透性、MDA 含量增幅明顯，與其余處理形成顯著性差異(P＜0.05)。

圖2 不同NaCl濃度脅迫下黃花菜葉片細(xì)胞膜透性的變化

圖3 不同NaCl濃度脅迫下黃花菜葉片MDA含量的變化

2.4 NaCl脅迫對黃花菜幼苗葉片有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖4 可以看出，與對照相比NaCl 處理黃花菜葉片脯氨酸含量顯著增加(P＜0.05)。不同處理之間，隨NaCl 脅迫濃度增加，葉片脯氨酸含量呈現(xiàn)增加趨勢，差異達(dá)5%顯著水平。各NaCl 脅迫處理，葉片脯氨酸含量在15 d 內(nèi)（含15 d）逐漸增加，15 d 后降低。

圖4 NaCl脅迫下黃花菜葉片脯氨酸含量的變化

由圖5 看出，對照黃花菜葉片可溶性糖含量維持在一個較穩(wěn)定水平。40～120 mmol/L NaCl 濃度處理，葉片可溶性糖含量在5～15 d 增加，15 d 后降低；160 mmol/L 處理，可溶性糖含量10 d 內(nèi)（含10 d）增加，10 d 后降低；200 mmol/L 處理，葉片可溶性糖含量在20 d 內(nèi)整體呈現(xiàn)降低趨勢。整個試驗期間，200 mmol/L NaCl 濃度處理，葉片可溶性糖含量值顯著低于CK和其余NaCl濃度處理(P＜0.05)。

圖5 NaCl脅迫下黃花菜葉片可溶性糖含量的變化

試驗期間，對照及不同NaCl 濃度處理，黃花菜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中10 d時含量值最高（圖6）。在15、20 d時，葉片可溶性蛋白質(zhì)含量隨NaCl脅迫濃度增加明顯降低，但統(tǒng)計意義上差異不顯著。

圖6 NaCl脅迫下黃花菜葉片可溶性蛋白含量的變化

3 結(jié)論與討論

3.1 NaCl脅迫對黃花菜種子萌發(fā)影響的原因分析

植物耐鹽性早期鑒定、耐鹽品種的早期選擇，主要通過種子的萌發(fā)能力和幼苗的生長勢作出基礎(chǔ)判斷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫對黃花菜種子萌發(fā)有非常大的影響，增大鹽濃度對種子萌發(fā)有顯著的抑制作用，會使發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)降低，鹽害指數(shù)增加，可能是滲透調(diào)節(jié)紊亂使種子吸水能力下降所致[18]。試驗結(jié)果表明，與對照相比，NaCl 脅迫處理在發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)3 個方面均明顯下降且降幅很大，鹽害指數(shù)也明顯增加，表明鹽分脅迫可明顯阻礙黃花菜種子萌發(fā)，鹽濃度越高抑制作用越明顯。離子的滲透作用與毒性作用有關(guān)，且鹽脅迫程度越深，效應(yīng)越明顯[19]。在本研究的NaCl 脅迫范圍內(nèi)，當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到120 mmol/L時，相較于其他高濃度的NaCl脅迫，種子萌發(fā)所受到的抑制相對低，可能是因為這個鹽濃度雖然一定程度上會抑制種子的萌發(fā)，但也會促進(jìn)細(xì)胞膜的滲透調(diào)節(jié)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)小幅度升高，鹽害指數(shù)也會小幅度下降[20]。

3.2 NaCl 脅迫對黃花菜幼苗生長發(fā)育影響的原因分析

相關(guān)研究表明，NaCl脅迫對植物的生長發(fā)育具有很大的影響，可延緩植物的生長，鹽堿度對植物在苗期和營養(yǎng)生長早期較敏感[21-22]。本研究中，與對照組的黃花菜種苗相比，NaCl脅迫組降低了黃花菜種苗的生長高度。NaCl 脅迫組的黃花菜種苗在整個生育期生長幅度很小，后期基本停止生長；而對照組的黃花菜種苗前期種苗生長緩慢，在前中期黃花菜種苗的生長高度比前期有了很大幅度的增長，從中期開始更是有了巨大幅度的增長，在后期黃花菜種苗的高度已經(jīng)遠(yuǎn)超NaCl 脅迫下黃花菜種苗的高度。NaCl 脅迫對幼苗生長的影響，主要是由于植物根系周圍的土壤中土水勢因NaCl濃度增加而降低，使植物根系吸收水的能力降低，從而使植物的生長受到抑制，這與土壤中因鹽濃度增加導(dǎo)致滲透壓增加有關(guān)[7,23]。

NaCl脅迫對植物的生長發(fā)育有不同程度的影響，低濃度的鹽脅迫會阻礙植物的生長發(fā)育，鹽濃度過高甚至可能會導(dǎo)致植物死亡。本研究中，相較于其他NaCl脅迫組，低濃度的2個NaCl脅迫組的黃花菜種苗生長高度遠(yuǎn)超其他高濃度的NaCl脅迫組。在本試驗研究的NaCl 脅迫范圍內(nèi)，當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到120 mmol/L時，黃花菜種苗的生長發(fā)育所受到的抑制相對低于其他高濃度的NaCl 脅迫，原因與120 mmol/L NaCl 濃度脅迫對黃花菜種子萌發(fā)的影響類似。

3.3 NaCl脅迫對黃花菜幼苗葉片膜透性、MDA含量影響的原因分析

鹽脅迫使得植株受到離子毒害、過氧化傷害、礦質(zhì)營養(yǎng)缺乏等影響，同時會導(dǎo)致植株體內(nèi)水分虧缺，產(chǎn)生滲透脅迫。當(dāng)植物組織遭受鹽脅迫影響時，常能傷害細(xì)胞原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)而引起透性增大，使細(xì)胞內(nèi)含物不同程度的外滲，使外液的電導(dǎo)度增大。透性變化愈大，植物組織受傷愈重，抗性愈弱。植物在鹽脅迫下，會產(chǎn)生膜脂過氧化作用，膜脂過氧化的最終產(chǎn)物是MDA，MDA 含量可表明植物鹽脅迫受傷的程度。MDA 可與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，改變分子構(gòu)型，對蛋白質(zhì)的合成具有抑制作用。因此，MDA 的積累可對細(xì)胞和膜造成傷害[24-25]。本研究中，對照質(zhì)膜透性、MDA 含量在20 d 內(nèi)維持在一個穩(wěn)定水平，NaCl 處理質(zhì)膜透性、MDA 含量隨著NaCl 脅迫濃度的提高而增加，其中160、200 mmol/L處理質(zhì)膜透性、MDA含量顯著高于40、80、120 mmol/L處理，同時在20 d內(nèi)處于一直增加的趨勢。說明160、200 mmol/L濃度NaCl 脅迫處理可能已經(jīng)造成細(xì)胞內(nèi)含物外滲，發(fā)生膜脂過氧化作用，植物組織受傷嚴(yán)重。同時，隨著時間的延長，傷害逐漸加重。

3.4 NaCl脅迫對黃花菜幼苗葉片有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量影響的原因分析

研究表明，滲透脅迫是NaCl脅迫對黃花菜造成傷害的重要原因之一，隨著NaCl 處理濃度越來越高，植物細(xì)胞外Na+、Cl-濃度逐漸增加，細(xì)胞外界滲透勢降低，細(xì)胞面臨生理干旱脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞吸水困難甚至失水[26]。前人研究表明，滲透脅迫可通過2 種方式來緩解植物細(xì)胞，一是細(xì)胞通過從外界吸收K+、Na+等離子，二是細(xì)胞可通過自身合成可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖等，共同維持細(xì)胞水分充盈[27-28]。本研究中，20 d 內(nèi)對照處理黃花菜葉片脯氨酸含量較穩(wěn)定，隨NaCl 處理濃度的增加脯氨酸含量顯著增加。不同時間點，15 d內(nèi)各NaCl脅迫處理黃花菜葉片脯氨酸含量逐漸增加，15～20 d 不同處理脯氨酸含量降低。在各NaCl脅迫下，細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量的迅速增加是植物適應(yīng)鹽漬環(huán)境的顯著特征之一。

試驗中除200 mmol/L NaCl 脅迫處理黃花菜葉片可溶性糖含量在20 d內(nèi)逐漸降低外，其余處理葉片可溶性糖含量在15 d內(nèi)增加，15～20 d降低。可溶性糖是很多非鹽生植物的主要滲透調(diào)節(jié)劑，同時可溶性糖是細(xì)胞內(nèi)合成有機(jī)物質(zhì)的碳架和能量來源。在植物細(xì)胞受到脅迫時，短期內(nèi)細(xì)胞自身通過合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，表現(xiàn)出短期內(nèi)可溶性糖含量增加；后期可溶性糖含量降低，與長期NaCl脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物外滲有關(guān)。黃花菜葉片經(jīng)過不同濃度NaCl脅迫處理后，葉片可溶性蛋白含量同樣也是先增加后降低。

綜上所述，由NaCl 脅迫黃花菜種子萌發(fā)的試驗得出，當(dāng)NaCl 濃度增加時，黃花菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均有所下降，而鹽害指數(shù)逐漸升高，其中120 mmol/L NaCl 濃度處理種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均有所上升，鹽害指數(shù)也有一定程度的下降。黃花菜種苗期生長發(fā)育及生理指標(biāo)受NaCl 脅迫影響的試驗，NaCl 脅迫對黃花菜種苗的生長發(fā)育具有一定的抑制作用。隨NaCl 脅迫濃度增加，黃花菜種苗葉片細(xì)胞膜透性、MDA 含量呈現(xiàn)遞增的趨勢，其中160、200 mmol/L NaCl濃度處理增幅尤其明顯，并且這種對植物構(gòu)成的脅迫傷害隨時間的延長逐漸增加。20 d內(nèi)，黃花菜葉片游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量值整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，說明黃花菜在受到NaCl脅迫初期，游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)能夠緩解滲透脅迫的傷害，其中游離脯氨酸在黃花菜NaCl脅迫代謝中發(fā)揮了尤為重要的作用。試驗研究了NaCl脅迫對黃花菜幼苗葉片細(xì)胞膜透性、膜脂過氧化，以及細(xì)胞內(nèi)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化的影響，但是關(guān)于黃花菜鹽脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控方面信息沒有涉及，今后需加強(qiáng)這一方面的研究。