徐 達(dá)，王夢欽，董云龍，張云峰,2

（1云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程中心，昆明 650500）

0 引言

獼猴桃也稱奇異果，為獼猴桃科獼猴桃屬的植物果實。全世界共發(fā)現(xiàn)66個種、約118個分類單元，其中中國有62個種，獼猴桃資源極為豐富[1-2]。1904年新西蘭從中國引種獼猴桃，隨后選育出多個優(yōu)良品種（系）。經(jīng)100 多年的發(fā)展，獼猴桃不僅成為目前全世界野生馴化最為成功的水果之一，也成為品種多樣程度高、世界流行水果之一[3-4]?！吨袊J猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告(2020)》的數(shù)據(jù)顯示，獼猴桃的栽培已廣布于世界5大洲23個國家和地區(qū)[5-6]，截至2020年，全球獼猴桃種植面積達(dá)到28 萬hm2，全球獼猴桃產(chǎn)量為451.8 萬t。中國獼猴桃種植面積達(dá)到19.3萬hm2，產(chǎn)量為229.1萬t，無論種植面積還是產(chǎn)量都是穩(wěn)居世界第一。作為雌雄異株植物，獼猴桃的天然授粉坐果率極低，外加雌雄株花期不遇、天氣影響等原因致使僅依靠天然授粉很難獲得高質(zhì)優(yōu)效的栽培效果，人工輔助授粉成為獼猴桃優(yōu)產(chǎn)高效栽培中極為重要技術(shù)手段[7]。山區(qū)栽培獼猴桃，由于栽培面積小、栽培分散，獼猴桃栽培果農(nóng)的花粉或購于電商平臺，或由技術(shù)合作單位供給。而花粉在采集、保存中受多種因素的影響，其活力、萌發(fā)率、授精率都不穩(wěn)定，給果農(nóng)的生產(chǎn)帶來極大風(fēng)險[8-11]。目前對獼猴桃花粉的研究主要集中花粉對果實品質(zhì)影響[12-14]、活力測定及其影響因素[15-17]、花粉培養(yǎng)[18]、花粉散粉規(guī)律[19]、花粉萌發(fā)與外界環(huán)境的關(guān)系[20]等方面。在花粉質(zhì)量控制方面，尤其是對電商平臺所售花粉的質(zhì)量評價及采用何種指標(biāo)有效判定獼猴桃授精情況缺乏研究。本研究以不同電商平臺銷售的獼猴桃花粉為材料，基于正交試驗、響應(yīng)面試驗設(shè)計對TTC 法測定獼猴桃花粉活力的條件進(jìn)行優(yōu)化，對花粉的萌發(fā)率、坐果率與花粉活力間的相關(guān)性做分析，以期為后續(xù)的研究和生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為購于電商平臺的獼猴桃花粉5 份，其中2 份由云南建水良豐農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司所提供，另外3份由實驗室選購。電商平臺銷售的獼猴桃花粉價格不一、評價差異大、選購次數(shù)不同，價格一般在10～30 元/g，選購次數(shù)可從幾次到10 萬次。為此，選購時按好評優(yōu)先及購買次數(shù)優(yōu)先的原則進(jìn)行選購，價格在18～26 元/g；同時記錄好評數(shù)、價格及購買次數(shù)。所有花粉樣品在試驗期間存放于4℃冰箱保存。

1.2 花粉數(shù)量檢驗及TTC染色法活力測定

取10 mg 花粉樣品置于1 mL 蒸餾水中，混合均勻。隨后取1 μL 混合液置于顯微鏡下觀察花粉細(xì)胞數(shù)目及活力檢驗。1 μL花粉懸浮液相當(dāng)于10 μg的購買花粉（其中包括輔料）?；ǚ刍盍Σ捎肨TC 染色法進(jìn)行檢驗，檢驗參照張鴻等[7]的方法。為進(jìn)一步優(yōu)化活力測定，采用正交和響應(yīng)面進(jìn)行設(shè)計。在正交設(shè)計及響應(yīng)面設(shè)計中采用3 因子3 水平設(shè)計，因子包括TTC 濃度(A，0.3%、0.5%、0.7%)、染色溫度(B，20、25、30℃)、染色時間(C，20、25、30 min)。

1.3 離體萌發(fā)培養(yǎng)液的優(yōu)化

在蒸餾水中分別配制蔗糖溶液為5%、10%、15%、20%和硼酸溶液為0.1%、0.15%、0.2%的組合萌發(fā)液。將稀釋不同倍數(shù)的花粉置于花粉萌發(fā)液中，隨后在溫度為(25±2)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察，以花粉管長度大于花粉直徑作為花粉萌發(fā)的判定標(biāo)準(zhǔn)[21]。

1.4 授粉試驗

采用臣風(fēng)果樹電動授粉機(jī)進(jìn)行授粉。選擇天氣晴朗的8:00—10:00 進(jìn)行授粉。授粉在云南建水良豐農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司的獼猴桃栽培基地進(jìn)行，按說明書將混有輔料的獼猴桃花粉加入授粉器，以點(diǎn)授法對雌花花柱授粉，做好標(biāo)記，授粉只進(jìn)行1 次，后期以坐果數(shù)統(tǒng)計坐果率[式(1)]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel、SPSS 26.0 和Design Expert 8.0.6 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行描述統(tǒng)計、差異顯著性檢驗，對花粉活力進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色花粉活力的正交試驗結(jié)果

從5份花粉中選取2 份由云南建水良豐農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司所提供的獼猴桃花粉，對其進(jìn)行花粉數(shù)量、萌發(fā)率、花粉活力進(jìn)行測定，花粉活力的測定條件為TTC濃度0.7%、染色溫度25℃、染色時間30 min。表1的結(jié)果表明，2批獼猴桃花粉在花粉數(shù)量、萌發(fā)率及花粉活力均存在顯著性差異。為優(yōu)化花粉活力的檢驗條件，進(jìn)行正交設(shè)計試驗（表2）。表2顯示TTC濃度、染色溫度、染色時間分別為0.7%、30℃、30 min（處理7）的花粉活力最高(97%)，而TTC 濃度、染色溫度、染色時間分別為0.3%、20℃、20 min（處理1）的花粉活力最低(22%)。方差分析（表3）顯示，TTC濃度、染色溫度、染色時間的P值分別為0.021、0.033、0.026，所有P值均小于0.05，表明這些因素對TTC檢驗花粉活力均有顯著性影響。在15%蔗糖、0.15%硼酸、培養(yǎng)時間24 h下進(jìn)行花粉萌發(fā)檢驗（圖1），結(jié)果顯示2批花粉的萌發(fā)率也存在差異，在5、10、24 h的萌發(fā)率均存在顯著性差異，且花粉數(shù)量多的樣品萌發(fā)率并不高。

表1 花粉數(shù)量、花粉活力及萌發(fā)率

表2 3因素3水平設(shè)計下的獼猴桃花粉活力

表3 正交設(shè)計下獼猴桃花粉活力的方差分析

圖1 不同來源花粉數(shù)量、TTC染色及萌發(fā)率

2.2 TTC染色花粉活力響應(yīng)面優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化TTC染色花粉活力檢驗的條件，基于Design Expert 進(jìn)行試驗設(shè)計，結(jié)果見表4。對響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析（表5），模型F＝5.75，且P≤0.05，表明模型差異顯著。校正決定系數(shù)R2=0.7278，相關(guān)系數(shù)R2=0.8809，表明該模型的擬合度較好，可用于花粉生活力的檢驗。模型的變異系數(shù)為9.6%(＜10%)，表明模型穩(wěn)定性良好，試驗操作可靠。模型的信噪比為7.834(＞4)，表明該模型能真實地反映試驗結(jié)果。同時發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)面法測定獼猴桃花粉生活力TTC法測定的最佳條件為TTC 濃度0.7%、染色溫度30℃、染色時間25 min，結(jié)果與正交試驗一致。經(jīng)回歸分析得回歸方程，如式(2)。

表4 獼猴桃花粉活力檢驗的響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果

表5 獼猴桃花粉活力測定響應(yīng)面試驗方差分析

式中，A、B、C分別為TTC濃度、染色時間、染色溫度。

依回歸模型分析，經(jīng)Design-Expert V8.0.6.1 軟件對TTC濃度、染色時間及染色溫度3個因素進(jìn)行分析，得到對應(yīng)的等高線圖及響應(yīng)曲面圖（圖2）。在Design-Expert 軟件分析中，等高線的形態(tài)可直觀反映出因素間交互作用的大小，圓形表示交互作用小，橢圓形則相反[21]，而響應(yīng)面的坡度變化則可反映出各因素對響應(yīng)值的影響力，坡度越緩表明影響越小[22]。從圖2 可看出，TTC 濃度、染色時間及染色溫度三者間的互作較為復(fù)雜，染色溫度與TTC濃度的交互作用對響應(yīng)值影響最大，響應(yīng)面的傾斜度最高，其次是染色時間與TTC濃度，最后是染色溫度與染色時間。

圖2 TTC濃度、染色時間、染色時間之間的互作

2.3 花粉離體萌發(fā)、授粉及其與活性的相關(guān)性

為驗證花粉活力與花粉離體萌發(fā)、授粉間相關(guān)性，選擇蔗糖、硼酸溶液對獼猴桃花粉進(jìn)行離體萌發(fā)，蔗糖濃度設(shè)定為5%、10%、15%、20%，硼酸濃度為0.1%、0.15%、0.2%，花粉選擇活力較高的B公司。結(jié)果見圖3。蔗糖濃度和硼酸濃度分別為15%、20%，0.15%、0.2%時，獼猴桃的花粉萌發(fā)較高，其中15%蔗糖條件下萌發(fā)率最高，但在硼酸濃度分別為15%、20%條件下，其萌發(fā)率并無顯著性差異。因此，可將15%蔗糖、15%硼酸作為獼猴桃花粉的最佳萌發(fā)條件。表6 顯示，5 批花粉雖在花粉數(shù)量上差異不顯著，但花粉活力、萌發(fā)率、坐果率均表現(xiàn)出顯著性差異。尤其是坐果率的差異會嚴(yán)重影響到獼猴桃的產(chǎn)量。對花粉活力、萌發(fā)率和坐果率之間相關(guān)性進(jìn)行計算，得出花粉活力和萌發(fā)率相關(guān)系數(shù)為0.667，萌發(fā)率和坐果率相關(guān)系數(shù)為0.928，花粉活力和坐果率相關(guān)系數(shù)為0.843。因此，坐果率在很大程度上取決于萌發(fā)率（表7）。研究表明，利用獼猴桃花粉萌發(fā)率顯示其花粉活力更為合理，萌發(fā)率的測定雖不復(fù)雜，但測定時間相對長。同時，將前期電商平臺采購時的好評、拼購次數(shù)及價格進(jìn)行排位（表6），發(fā)現(xiàn)已拼次數(shù)多、好評排位靠前的花粉，其萌發(fā)率、坐果率也較高。因此，在電商平臺選購獼猴桃花粉可首先考慮購買次數(shù)多、好評優(yōu)先的產(chǎn)物，其次才考慮價格。

圖3 硼酸及蔗糖濃度對花粉萌發(fā)率的影響

表6 不同來源花粉的活力比較及萌發(fā)率差異

表7 花粉活力、萌發(fā)率、坐果率的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

TTC 染色是檢測種子活力、花粉活力的常用技術(shù)，其原理在于TTC可與活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶產(chǎn)生紅色，從而以色澤判斷細(xì)胞的活力[23-26]。有研究表明溫度對植物花粉的萌發(fā)具有重要的影響[10]，因此以此設(shè)計正交試驗。張鴻等[7]采用TTC 法和I2-IK 法測定花粉活力，認(rèn)為TTC 和I2-IK 不適用于獼猴桃花粉活力的測定，并認(rèn)為其原因在于獼猴桃花粉內(nèi)的琥珀酸脫氫酶和淀粉含量較低，不能被染成相應(yīng)的顏色。本試驗的5 個樣品中，采用TTC 測定法所測定的花粉活力在(45±6)%～(90.1±9)%，所有樣品都能染色，與張鴻等的結(jié)論不一致，因此TTC是否可用于獼猴桃花粉活力的檢驗也許與品種差異有關(guān)。Zhu等[27]、劉成琴等[28]報道TTC 對部分植物的花粉染色效果差的原因是花粉壁太厚，染色液無法滲透，而非脫氫酶活性太低。下一步將對不同獼猴桃品種的花粉進(jìn)行琥珀酸脫氫酶測定，或通過測定不同獼猴桃品種花粉璧的厚度及其對染料的透性進(jìn)行補(bǔ)充。本試驗中，萌發(fā)率與坐果率的相關(guān)性較高(0.928)，與張鴻等的結(jié)果相吻合。從本試驗所測的5 份購于網(wǎng)絡(luò)平臺的獼猴桃花粉數(shù)據(jù)來看，雖購于不同平臺的獼猴桃花粉，花粉數(shù)量上差異不大，但在花粉活力、萌發(fā)率、坐果率均存在較大差異。干燥方法[11]、貯藏溫度[29]、花粉來源[30]、脫藥時間[10]都會影響獼猴桃花粉活力。因此，在互聯(lián)網(wǎng)背景下，涉及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)加強(qiáng)管理，建議相關(guān)部分制定法規(guī)保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的利益。

花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)法是檢驗花粉生活力最直接、有效的方法，離體萌發(fā)培養(yǎng)基配制主要由蔗糖、硼等營養(yǎng)成分組成。蔗糖普遍存在于植物體中，不同植物花粉萌發(fā)的最佳糖濃度差異大[31]。蔗糖能夠促進(jìn)植物花粉萌發(fā)和花粉管的生長，并在外部環(huán)境中保持滲透壓的平衡和穩(wěn)定。在本研究中，15%蔗糖是花粉萌發(fā)和花粉管伸長的最適濃度，這與張鴻等的研究結(jié)果有差異。一方面可能與品種相關(guān)，另一方面與試驗設(shè)計的梯度有關(guān)，在張鴻等的試驗中，其蔗糖濃度從10%直接升到了20%，無15%濃度的設(shè)置。硼是影響植物花粉萌發(fā)率高低的重要因素，硼離子能和蔗糖形成絡(luò)合物，增強(qiáng)糖分的吸收與代謝，極大地促進(jìn)植物花粉萌發(fā)[32-33]，從試驗結(jié)果可以看出，低濃度的硼酸可能會影響花粉萌發(fā)的生長，但硼酸濃度過高也可能產(chǎn)生較高的滲透壓，從而影響花粉萌發(fā)的生長。本試驗中硼的最佳濃度為0.15%，在張鴻等的試驗中，硼的最佳濃度為0.1%，其硼設(shè)置的也是從0.1%直接升到了0.2%，無0.15%濃度的設(shè)置。張偉等[34]在三角梅花粉萌中發(fā)現(xiàn)，不添加蔗糖或硼酸時，花粉萌發(fā)和花粉管生長極少，添加適宜硼酸和蔗糖可顯著提高花粉萌發(fā)和花粉管伸長，表明萌發(fā)需要蔗糖和硼酸共同作用。Xiong等[35]對斐濟(jì)果的研究表明Ca2+濃度是影響花粉萌發(fā)的次要因素和花粉管生長的主要因素。Ca2+對獼猴桃花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響需做進(jìn)一步研究。從本試驗看，萌發(fā)率均小于坐果率，其原因是否與授粉量相關(guān)也需要進(jìn)一步研究。