陳榮鑫 鐘遠聞 孫魯龍 王輝 王伯臣 賈榮儉 趙政陽

摘要：【目的】近年來，蘋果病毒病的發(fā)生日趨嚴重，對產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴重影響，但是其在蘋果新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅上的發(fā)病狀況尚不明確?！痉椒ā吭?021—2022 年采用RT-PCR方法對白水地區(qū)198 份新品種樣品進行病毒病檢測，并對感染蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）植株的果實癥狀進行了調(diào)查和基因克隆、測序?！窘Y(jié)果】檢測結(jié)果顯示白水地區(qū)新品種潛隱性病毒的感病率顯著高于非潛隱性病毒，其中蘋果褪綠葉斑病毒（apple chloroticleaf spot virus，ACLSV）的檢出率最高，達到了91.72%，其次是蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus，ASGV）和蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV），檢出率分別達到了77.16%、37.13%，蘋果壞死花葉病毒（apple necroticmosaic virus，ApNMV）的檢出率為30.31%，蘋果銹果類病毒和蘋果凹果類病毒（apple dimple fruit viroid， ADFVd）的檢出率接近10%；通過對新品種攜帶病毒類型分析發(fā)現(xiàn)，新品種瑞陽整體的檢出率低于瑞雪和瑞香紅，且73.17%植株病毒復(fù)合侵染種類以2～3 種為主，而瑞雪、瑞香紅57.55%、69.39%的植株以3～4 種為主；3 個新品種感染蘋果銹果類病毒后，瑞陽主要表現(xiàn)為“花臉型”，瑞雪、瑞香紅表現(xiàn)為“花臉型”“果面凹凸不平”2 種癥狀；通過對3 個新品種ASSVd分離物進行測序、分析，發(fā)現(xiàn)新品種瑞陽分離物與伊朗蘋果分離物（KM213397.1）同屬一個分支，新品種瑞雪、瑞香紅分離物序列與韓國、加拿大蘋果分離物（AF421195.1、X71599.1）同屬一個分支。【結(jié)論】檢測結(jié)果表明，白水地區(qū)3 個新品種蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒感病率較高，非潛隱性病毒的感病率相對較低，且新品種瑞陽對病毒的敏感性較低；新品種瑞雪、瑞香紅蘋果銹果類病毒分離物屬于同一分支，而它們擁有共同的親本（克氏粉紅×秦富1 號），這從寄主親緣關(guān)系遠近的角度表明ASSVd侵染存在寄主特異性。

關(guān)鍵詞：蘋果新品種；病毒?。籖T-PCR檢測；ASSVd

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）06-1215-11

蘋果（Malus × domestica Borkh.）是我國重要的經(jīng)濟作物，國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2021年全國蘋果種植面積約為208.8萬hm2，總產(chǎn)量約為4 597.34萬t。近年來，我國蘋果產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，苗木流通日益頻繁，加上田間栽培管理粗放，致使病毒病的蔓延加快[1]。其中對我國危害較為嚴重的病毒有6 種，分別是蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus，ASGV）、蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV）、蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）3 種潛隱性病毒和蘋果壞死花葉病毒（applenecrotic mosaic virus，ApNMV）、蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）、蘋果凹果類病毒（apple dimple fruit viroid，ADFVd）3 種非潛隱性病毒[2-3]。潛隱性病毒侵染樹體后不會表現(xiàn)出明顯的癥狀，但會影響苗木的生長發(fā)育，較健康植株相比生長量降低10%～36%，產(chǎn)量減少16%～46%[4]。非潛隱性病毒在侵染樹體后會表現(xiàn)出明顯的癥狀，其中蘋果壞死花葉病毒會引起植株葉片斑駁、黃化、褪綠，導(dǎo)致葉綠素的降解，光合能力下降，嚴重影響植株的產(chǎn)量、果實品質(zhì)[5-6]。蘋果銹果類病毒和蘋果凹果類病毒在枝干和葉片中無明顯癥狀，但蘋果銹果類病毒會使果實表面呈現(xiàn)花臉、銹果、花臉-銹果復(fù)合型、環(huán)斑型和綠點型5 種癥狀，蘋果凹果類病毒使得感病果實表面凹陷，這兩種病毒均會導(dǎo)致果實喪失商品價值，影響蘋果產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展[7-9]。

蘋果銹果類病毒屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（Pospivioidae）蘋果銹果類病毒屬（Apscaviroid），是日本學者Hashimoto 等[10]首次發(fā)現(xiàn)的。近年來，多位學者對蘋果銹果類病毒是否存在地區(qū)?；院图闹鲗；赃M行了研究，結(jié)果均表明該病毒侵染不存在明顯的地區(qū)?；裕嬖诩闹魈禺愋訹11-13]；邢飛等[14]對感染蘋果銹果類病毒的中秋王和寒富的序列進行測定發(fā)現(xiàn)兩者的主流序列完全一致，但兩者表現(xiàn)癥狀不同，說明寒富對蘋果銹果類病毒的抗性較強。蘋果新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅是西北農(nóng)林科技大學趙政陽團隊培育的優(yōu)質(zhì)晚熟新品種。瑞陽是由秦冠和長富2 號雜交選育而成的紅色品種[15]。瑞雪、瑞香紅的親本均為秦富1 號和克氏粉紅[16-17]。目前，隨著矮化栽培以及高接換頭技術(shù)的推廣，新品種栽培面積在不斷擴大，但是對新品種病毒病的發(fā)生、分布狀況尚不明確。因此，筆者所在課題組對渭南市白水縣栽植的新品種病毒病發(fā)生狀況進行了系統(tǒng)調(diào)查，采用RT-PCR方法檢測了198 份樣品6 種病毒的感染情況，旨在探究新品種病毒病的危害程度。此外，對感染蘋果銹果類病毒的新品種樣品進行基因組序列分析，明確蘋果銹果類病毒在新品種上的變異情況，為新品種病毒病的檢測及無病毒苗木的推廣提供有效的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2021—2022 年4—10 月在陜西省渭南市白水縣種植新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅的果園（表1）采用五點采樣法，采集了198 份葉片樣品，放入5 mL凍存管，用4 ℃保溫箱帶回實驗室，后用液氮速凍，放于-80 ℃冰箱進行保存、備用；蘋果莖溝病毒、蘋果莖痘病毒、蘋果褪綠葉斑病毒的陽性對照為實驗室保存的攜帶有3 種病毒的組培苗，蘋果銹果類病毒、蘋果凹果類病毒、蘋果壞死花葉病毒的陽性對照為質(zhì)粒，陰性對照均為實驗室保存的脫毒苗；對蘋果銹果類病毒序列分析的樣品為上述檢測出的陽性樣品；測定果實品質(zhì)指標的試驗材料來源于白水蘋果試驗站的瑞雪，經(jīng)病毒檢測，所有植株均為復(fù)合侵染的植株，但不感染蘋果凹果類病毒，健康果實為不攜帶蘋果銹果類病毒的3 棵植株，“花臉型”和“果面凹凸不平”的是攜帶了蘋果銹果類病毒的植株各3 株，在果實采收期，采收每棵果樹樹冠外圍果實各10個，進行果實品質(zhì)測定。

1.2 植物總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄

采用CTAB 法提取植物總RNA[18]。取0.5 g 樣品，在液氮下研磨成粉末狀，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA完整性和純度后，使用EasyScript? One- Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于病毒檢測。

1.3 病毒檢測

RT-PCR 病毒檢測反應(yīng)體系為25 μL，2×Es TaqMastermix（Dye）（北京康為生物科技有限公司）12.5 μL，上下游引物10 μmol ·L-1各1 μL，cDNA 為1 μL，無菌ddH2O 9.5 μL；PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變形94 ℃，2 min；變形94 ℃，30 s；退火溫度，30 s；延伸72 ℃，30 s；35 個循環(huán)；終延伸72 ℃，10 min。病毒檢測所用的引物均參照已經(jīng)發(fā)表的序列[19-24]，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列、擴增的目標片段、退火溫度如表2 所示。

檢出率（%）=檢出樣本數(shù)/樣本總數(shù)×100。

復(fù)合侵染率（%）=感染N種病毒的植株數(shù)/總樣本數(shù)×100。

1.4 果實品質(zhì)測定方法

單果質(zhì)量利用電子稱重器測量，縱徑、橫徑采用游標卡尺進行測定，可溶性固形物含量利用ATAGO（PAL-1）手持數(shù)顯折光儀測定，可滴定酸含量利用GMK-835F 型酸度計測定，固酸比為可溶性固形物含量/可滴定酸含量，硬度采用FTA GS-15 型水果質(zhì)地分析儀隨機在果實中部選取3 個點，削除果皮進行測定，色澤參數(shù)（L*表示果實光澤明亮程度、a*表示果實底色的紅綠程度、b*表示果實面色的黃藍程度）采用Minolta CR-400 型色差計在果實表面的赤道部位隨機選取5 個點進行測定，所有數(shù)據(jù)求平均值后使用。

1.5 PCR產(chǎn)物的回收、測序

取蘋果銹果類病毒的陽性樣本進行基因克隆，將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物點于1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果，再將擴增出的目標片段切下，放入提前準備好的1.5 mL離心管，按PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]說明書進行產(chǎn)物回收，后將回收得到的片段與pMD19-T 載體進行連接，熱擊轉(zhuǎn)化入DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞（北京擎科生物科技有限公司），最后將篩選后得到的陽性克隆，交送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)分析、作圖，使用IBMSPSS Statistics 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行多重差異顯著性分析，測序結(jié)果采用NCBI 中Blast 進行相似性查找，使用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，利用DNAMAN軟件進行序列相似性比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果新品種病毒病發(fā)生狀況

如圖1 所示，通過對蘋果新品種病毒病發(fā)生情況的調(diào)查分析，表明白水地區(qū)新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅均受到6 種病毒病的侵染，且潛隱性病毒的檢出率明顯高于非潛隱性病毒。在3 種潛隱性病毒中，蘋果褪綠葉斑病毒的發(fā)病狀況最為嚴重，檢出率達到了91.72%，其次是蘋果莖溝病毒，檢出率為77.16% ，蘋果莖痘病毒的檢出率相對較低，為37.13%，3 種非潛隱性病毒中，蘋果壞死花葉病毒的檢出率較高，檢出率達到了30.31%，蘋果銹果類病毒和蘋果凹果類病毒的檢出率相對較低，均不到10%（圖2）。

2.2 蘋果新品種攜帶病毒類型

調(diào)查結(jié)果顯示，蘋果新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅潛隱性病毒的檢出率遠遠高于非潛隱性病毒，且均為蘋果褪綠葉斑病毒的檢出率最高，蘋果銹果類病毒和蘋果凹果類病毒的檢出率最低，這與上述結(jié)果基本一致。如圖3 所示，在3 個新品種中，瑞陽蘋果莖痘病毒和蘋果壞死花葉病毒的檢出率低于瑞雪和瑞香紅，分別為14.63%、17.07%；瑞雪蘋果壞死花葉病毒、蘋果銹果類病毒、蘋果凹果類病毒的檢出率均高于瑞陽、瑞香紅，其中蘋果壞死花葉病毒的檢出率分別是瑞陽、瑞香紅的2.65 倍、1.58 倍；瑞香紅蘋果莖痘病毒、蘋果褪綠葉斑病毒的檢出率最高，其中蘋果莖痘病毒的檢出率是瑞陽的4.74 倍，瑞雪的2.54倍，蘋果銹果類病毒、蘋果凹果類病毒的檢出率在3 個新品種中最低。在蘋果新品種病毒病復(fù)合侵染狀況中，瑞陽73.17%植株被2～3 種病毒復(fù)合侵染，而瑞雪、瑞香紅57.55%、69.39%的植株被3～4 種病毒復(fù)合侵染；此外，雖然3 個新品種均未檢出被6 種病毒復(fù)合侵染的植株，但不攜帶病毒的植株占比也較少（圖4）。

2.3 蘋果銹果類病毒在新品種上的表現(xiàn)

如圖5 所示，新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅的健康果實表面光滑、著色均勻（A1、B1、C1），而瑞陽感染蘋果銹果類病毒后主要表現(xiàn)為“花臉型”癥狀，果實完成著色后，表面為斑點式的紅黃相間（A2、A3）；新品種瑞雪、瑞香紅感病后有兩種主要表現(xiàn)類型，一種是“果面凹凸不平”，其中瑞雪果實在果面癥狀較為明顯，果梗、果洼處無明顯癥狀，瑞香紅果實果面、果梗處癥狀較為明顯，褶皺嚴重，果洼處無明顯癥狀（B2、C2）；另一種是“花臉型”，瑞雪為黃綠色果實，感染病毒后，在果實陽面呈現(xiàn)紅綠相間的花臉癥狀，果實陰面無花臉狀或癥狀較輕，瑞香紅果實為鮮紅色，感病果實“花臉型”的在陽面果實呈現(xiàn)紅黃相間，陰面無癥狀或癥狀較輕（B3、C3）。因瑞雪為黃綠色果實，感染病毒后無論是“花臉型”，還是“果面凹凸不平”，表現(xiàn)癥狀極為明顯，所以對瑞雪表現(xiàn)“花臉型”“果面凹凸不平”及“健康果實”生理指標進行測定（表3）。結(jié)果表明感染蘋果銹果類病毒后，與健康果實相比較，“花臉型”“果面凹凸不平”的果實單果質(zhì)量下降了127.72～144.33 g，果實縱徑減小了148.56～158.07 mm、橫徑減小了104.91～113.04 mm，影響了產(chǎn)量；果實色澤上L*、b*值不存在顯著差異，但因“花臉型”果實感染病毒后果實呈現(xiàn)一定的紅色，使得a*值增大，但“果面凹凸不平”果實a*值減小，嚴重影響了果實的外在品質(zhì)；同時兩種癥狀果實的硬度增加了0.9～1.02 kg·cm-2，固酸比增加了5.59～20.05，影響果實的口感和內(nèi)在品質(zhì)；尤其以“花臉型”對產(chǎn)量、內(nèi)外在品質(zhì)影響更為嚴重。

2.4 蘋果銹果類病毒序列分析及比對

新品種瑞陽、瑞雪和瑞香紅感病樣本基因克隆結(jié)果如圖6 所示，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化每個品種均獲得了8條序列。通過MEGA7.0 軟件構(gòu)建鄰接法（neighborjoiningmethod，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。由進化樹可以看出現(xiàn)有分離物可分為2 組，白水地區(qū)新品種感染的蘋果銹果類病毒基因組序列和新疆蘋果（MN598204.1、MN598215.1）的相似性較高，其中瑞雪、瑞香紅和新疆蘋果（MN598204.1）的親緣關(guān)系近，與韓國、加拿大蘋果分離物（AF421195.1、X71599.1）同屬于Ⅰ 組；瑞陽與新疆蘋果（MN598215.1）相似性最高，與伊朗蘋果分離物（KM213397.1）同屬于Ⅱ組（圖7）。

如圖8 所示，測序結(jié)果表明新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅感染的蘋果銹果類病毒序列長度分別為332、329、329 nt，與NCBI 中發(fā)布的序列MN598204.1、MN598215.1 進行比對，發(fā)現(xiàn)其同源性均超過99%。通過DNAMAN軟件比對發(fā)現(xiàn)，瑞陽分離物序列與MN598215.1 相似性達到99.4%，瑞雪、瑞香紅分離物序列與MN598204.1 相似性分別達到了99.4%、98.4%；其中，瑞陽分離物序列與新疆蘋果分離物（MN598215.1）相比為103 位、328 位的G堿基突變?yōu)锳堿基，瑞雪與MN598204.1 序列相比在122 位發(fā)生了堿基缺失，135 位堿基由T突變?yōu)镃，瑞香紅與MN598204.1 序列相比228 位發(fā)生了堿基缺失，164 位堿基由T突變?yōu)镃，204 位堿基由A突變?yōu)門，329、330 位堿基由GG突變?yōu)門C。

3 討論

蘋果病毒病在我國蘋果栽培區(qū)域內(nèi)廣泛發(fā)生，因其主要通過嫁接的方式進行傳播，且目前尚無有效的藥劑來防止病毒病，這嚴重地影響了蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[25]。目前，國內(nèi)已有多位學者對我國蘋果主產(chǎn)區(qū)病毒病的分布進行過研究，總體結(jié)果表明，我國栽培品種普遍都攜帶有病毒病，且復(fù)合侵染現(xiàn)象明顯，其中潛隱性病毒發(fā)病率較高，部分地區(qū)復(fù)合侵染率超過90%，蘋果銹果類病毒和蘋果凹果類病毒的發(fā)病率雖然較低，但是有逐年增加的趨勢[1，7，26]。因此新品種在進行推廣的過程中要注意病毒病的防控。筆者在本研究中采用RT-PCR方法對白水地區(qū)新品種6 種病毒病的發(fā)生狀況進行了調(diào)查，初步明確白水地區(qū)的新品種主要被3 種潛隱性病毒侵染，而3 種非潛性病毒的感病率相對較低。目前，高接換頭是一項解決果園老化、品種單一問題的技術(shù)[27]。白水地區(qū)3 個新品種的更新也主要采用高接換頭的方式，而新品種瑞陽整體的病毒檢出率、被病毒復(fù)合侵染的種類均低于瑞雪和瑞香紅，這表明瑞陽更不易被病毒感染。

蘋果銹果類病毒作為非潛隱性病毒的一種，主要侵染的寄主有蘋果、梨、櫻桃、杏等，梨樹是其不顯癥寄主，蘋果和梨混栽的果園蘋果銹果類病毒發(fā)病率高[28]。蘋果銹果類病毒一旦侵染樹體，嚴重影響果實的商品價值，對蘋果產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的危害極大。近年來蘋果銹果類病毒在我國的發(fā)生率不斷增加，孫玚等[29]對云南省3 個蘋果產(chǎn)區(qū)蘋果主要病毒與類病毒調(diào)查檢測結(jié)果顯示蘋果銹果類病毒檢出率在18.57%～61.54%；陳冉冉等[30]對我國6 個蘋果產(chǎn)區(qū)疑似感染蘋果銹果類病毒的35 份樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)88.9%～100%的樣本為陽性；曾棋等[31]對北京地區(qū)梨樹病毒病的調(diào)查結(jié)果顯示，蘋果銹果類病毒的感病率達到54.8%。在本研究中，新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅在感染蘋果銹果類病毒后，果實表面會出現(xiàn)花臉、凹凸不平的癥狀，雖然目前新品種蘋果銹果類病毒的感病率不足10%，但是由于其對果實的內(nèi)外在品質(zhì)危害極大，因此要采用嚴格的防控措施，避免其大面積蔓延，影響新品種的持續(xù)健康發(fā)展。前人對蘋果銹果類病毒的測序結(jié)果表明，蘋果銹果類病毒侵染寄主存在一定的寄主特異性[30，32]。對新品種瑞陽、瑞雪、瑞香紅感染蘋果銹果類病毒的樣本進行克隆、測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞陽分離物與MN598215.1 序列相似率高達99.4%，瑞雪、瑞香紅分離物與MN598204.1 相似率分別達到了99.4%、98.49%；系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，瑞雪、瑞香紅的分離物在同一個分支，而瑞陽分離物與伊朗蘋果分離物同屬一個分支。瑞雪和瑞香紅擁有共同的親本：克氏粉紅和秦富1 號，是姊妹系品種，其親緣關(guān)系較近，這可能也是其感染的蘋果銹果類病毒分離物相似性較高的原因，進一步表明蘋果銹果類病毒侵染存在一定的寄主特異性。

近年來，蘋果病毒病的發(fā)生范圍與發(fā)病程度在逐步地增加，減慢了我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展步伐。雖然在植株感病后可以通過拔除病樹、加強肥水管理提高樹勢、注意修剪等方式緩解病毒病的危害與發(fā)展，但是從長遠來看，蘋果新品種在未來的發(fā)展、推廣中，建立無病毒苗木繁育基地、發(fā)展無病毒苗木才是解決這一問題的有效方式。

4 結(jié)論

白水地區(qū)3 個新品種主要被潛隱型病毒蘋果褪綠葉斑病毒和蘋果莖溝病毒侵染，非潛隱型病毒侵染率較低，且新品種瑞陽對病毒侵染敏感性低；感染蘋果銹果類病毒的樣本測序結(jié)果從寄主親緣關(guān)系的遠近，進一步證明蘋果銹果類病毒侵染存在寄主特異性。

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