葉成 杜艷軍,2 劉欣媛 鄧曉妮 吳文輝

(1湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,湖北 武漢 430061;2針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心)

腎臟與其他臟器協(xié)同維持機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證正常生理功能的運行,是人體的重要器官。然而,隨著時間推移,細胞功能逐漸減退,腎臟不可避免地出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及生理功能退行性改變。其中,纖維化是衰老腎臟最為顯著的病理特征之一,包括腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。同時,腎纖維化是目前已知的各種不同因素導(dǎo)致的慢性腎臟病發(fā)展至終末期腎病的病理特征和必經(jīng)途徑,腎纖維化嚴重程度與腎功能下降之間存在線性關(guān)系,也是一項決定預(yù)后發(fā)展的可靠指標(biāo)〔1〕。

近年來,國內(nèi)外有學(xué)者觀察發(fā)現(xiàn)快速老化(SAMP)8小鼠腎臟在老年期具有典型的纖維化病理表現(xiàn)〔2～4〕,然而Shh信號通路與該品系小鼠腎臟病理改變之間的關(guān)系目前尚未見研究報道。本實驗旨在通過對比同齡抗快速老化(SAMR)1小鼠,觀察快速老化SAMP8小鼠老年期腎臟病理變化及Shh信號通路中Shh、平滑蛋白(Smo)、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物(Gli1)蛋白表達水平。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 6只雄性SAMP8小鼠,6只雄性SAMR1小鼠為對照,均購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部〔實驗動物科學(xué)部,許可證號:SCXK(京)2016-0010〕,月齡為10個月,體質(zhì)量為(35±5)g。均在SPF環(huán)境下喂養(yǎng),溫度為 (22±2)℃,自然光線,自由飲水,普通飼料(非鋁制品的器皿中存放)。整個實驗過程嚴格遵守國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2主要實驗試劑和儀器 Shh一抗(北京博奧森BIOSS,BS-1544R),Smo一抗(武漢三鷹PTG,66851-1-IG),Gli1一抗(北京博奧森BIOSS,BS-1206R),熒光二抗(488山羊抗兔,Jackson111-545-003),熒光二抗(488山羊抗鼠,Jackson111-545-003),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,索萊寶C0060),抗熒光淬滅封片劑(southbiotech0100-100)。

1.3動物取材 麻醉后用脫頸法處死,組織剪沿皮膚及皮下組織各層剖開腹腔,迅速剝離小鼠腎臟組織,用預(yù)冷的PBS清洗后濾紙吸干多余液體,腎臟浸泡于4%多聚甲醛用于蘇木素-伊紅(HE)、馬松(Masson)染色和免疫熒光實驗。

1.4HE染色與Masson染色 切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,HE染色經(jīng)蘇木素染細胞核,伊紅染細胞質(zhì)后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)病理改變;Masson染色經(jīng)蘇木素染色、麗春紅染色、苯胺藍染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織膠原沉積情況。在400倍鏡下每張切片隨機選取10個不同視野,將呈現(xiàn)為藍色區(qū)域的膠原纖維視為陽性目標(biāo),以陽性區(qū)域的面積與整個視野總面積的比值為腎臟纖維化指數(shù)。采用 Image Pro Plus6.0 軟件進行半定量分析。

1.5免疫熒光 切片常規(guī)使用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化;檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH6.0)抗原修復(fù),將玻片置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,5 min/次,吸干,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗4 ℃孵育過夜后置PBS中搖床洗滌3次,5 min/次;吸干,在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬辣根過氧化物酶(HRP)的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50 min,再置于 PBS 中搖床洗滌3次,5 min/次;吸干,滴加DAPI染液,避光室溫孵育10 min;再置于PBS中搖床洗滌3次,5 min/次后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于蔡司倒置顯微鏡下觀察并采集圖片,陽性表達呈綠色,細胞核呈藍色,并采用 Image Pro Plus6.0 軟件進行半定量分析熒光強度。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HE、Masson染色病理表現(xiàn) HE染色觀察小鼠腎臟組織病理學(xué)改變,Masson染色觀察腎臟組織纖維化程度,結(jié)果顯示,SAMR1組腎臟未見明顯異常病理變化,腎小管結(jié)構(gòu)清楚、完整,腎小球結(jié)構(gòu)清晰,形態(tài)規(guī)則,系膜細胞及間質(zhì)無明顯改變,血管周圍間質(zhì)僅見少量炎性細胞浸潤,腎小球基底膜及腎小管間質(zhì)處見少量陽性著染,膠原纖維沉積較少;與SAMR1組比較,SAMP8組腎臟于鏡下可見明顯病理損傷,腎小管上皮細胞水腫、空泡樣變性,小管間質(zhì)處有炎性細胞浸潤;腎小球體積增大、充血,系膜增生,基底膜增厚,血管周圍間質(zhì)有大量炎性細胞浸潤;腎小球及腎小管出現(xiàn)明顯藍色著染,表明膠原沉積較多,纖維化明顯。SAMR1組、SAMP8組腎臟纖維化表達面積占比具有顯著差異〔(15.32±1.32)%、(4.10±1.30)%,P<0.01〕。見圖1、圖2。

圖1 兩組腎臟組織(HE染色,×400)

圖2 兩組腎臟組織(Masson染色,×400)

2.2一般情況 SAMR1組生長狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,食欲旺盛,毛發(fā)光亮,二便正常;SAMP8組精神萎靡,活動能力降低,食量減少,毛發(fā)無光澤且有部分脫落,大小便減少。解剖后對腎臟組織進行觀察可見SAMR1組腎臟大小正常,色暗紅質(zhì)軟;而SAMP8組腎臟稍腫脹增大,呈暗褐色,質(zhì)地偏硬。

2.3Shh、Smo、Gli1的免疫熒光表達 Shh、Smo、Gli1蛋白的表達主要集中在腎小管,在腎小球中鮮有表達。SAMP8組腎小管中Shh、Smo、Gli1蛋白表達明顯高于SAMR1組(P<0.01)。見表1、圖3。

表1 兩組Shh、Smo、Gli1蛋白表達

圖3 兩組腎臟組織Shh、Smo、Gli1免疫熒光表達(×400)

3 討 論

SAM小鼠于20世紀70年代初由日本京都大學(xué)竹田俊男教授開發(fā)并沿用至今,該種類小鼠平均生存年限為12～13個月,相較于其他一般小鼠縮短了2～3倍,同時因其具有與人類老化性疾病所相似的相關(guān)衰老病理表現(xiàn),而成為目前最廣泛運用于研究衰老的哺乳類動物模型。SAMP8小鼠作為SAM小鼠中的一個品系,經(jīng)過研究證實其短壽,學(xué)習(xí)和記憶能力缺損,免疫反應(yīng)低下且隨年齡增長而加速衰退等特點〔5,6〕。

腎臟是受損傷、衰老等因素影響時變化較為明顯的器官。在年齡增長過程中,腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化是伴隨著衰老所產(chǎn)生的特征性變化,腎臟結(jié)構(gòu)與血流動力學(xué)發(fā)生改變導(dǎo)致腎臟功能進行性惡化甚至喪失〔7～9〕。因此,調(diào)控腎纖維化的相關(guān)信號通路受到高度關(guān)注,包括Shh、Wnt/β-catenin、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad、m-TOR、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)-1/2、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、肝細胞生長因子(HGF)/c-met等信號通路〔10～12〕。其中,Shh信號通路主要是由分泌型糖蛋白配體、跨膜蛋白受體復(fù)合物Ptch和Smo及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白組成。在胚胎期,該通路高度活化,調(diào)控著細胞的增殖、分化,參與腎臟組織的形成,維持機體的穩(wěn)態(tài);在成體期,該通路高度保守,鮮有表達。然而,當(dāng)Shh信號通路異常激活會引發(fā)腎臟纖維化、腫瘤等發(fā)育異常。有研究發(fā)現(xiàn)Shh信號通路不僅能通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)機制聯(lián)系串話Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad等常見通路,共同影響腎纖維化的進展,還能直接靶向作用于肌成纖維細胞的活化、增殖與轉(zhuǎn)化〔13〕。本實驗結(jié)果表明Shh信號通路的異常激活參與了腎纖維化過程。

綜上,Shh信號通路與腎纖維化密切相關(guān)的聯(lián)系在SAMP8衰老小鼠中有明顯表現(xiàn),然而對于抑制Shh信號通路與改善腎纖維化仍需深入研究,以期更好地指導(dǎo)衰老相關(guān)的腎纖維化臨床治療。