盧照, 魏慧欣, 陳霞, 曾紅霞, 丁雨葵, 宋武林,2*

(1.華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心, 武漢 430074; 2.華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 武漢 430074)

1932年,德國(guó)科學(xué)家Knoll和Ruska成功研制出世界上第一臺(tái)透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)。經(jīng)過(guò)近90年的發(fā)展,TEM分辨率已經(jīng)從亞微米量級(jí)提升至原子尺度級(jí)別的亞納米量級(jí)[1],功能也趨于多樣化,現(xiàn)如今廣泛應(yīng)用于材料科學(xué)、生命科學(xué)、物理學(xué)等領(lǐng)域,是當(dāng)今科學(xué)研究不可或缺的表征工具之一。

透射電子顯微鏡是采用波長(zhǎng)很短的電子束透過(guò)樣品成像,由于電子束的穿透能力較弱,因此,對(duì)于TEM樣品的厚度有一定的要求,而且通過(guò)TEM觀察的區(qū)域一定要代表所研究的材料。理想的TEM樣品要求均勻分散或均勻減薄,具有良好的導(dǎo)電性,同時(shí)耐電子束轟擊。TEM樣品制備的方法有很多種[2-6],材料的類型不同,選取的制樣方法就會(huì)有所不同。適合的制樣方法對(duì)透射電鏡的觀察效果有著重要的影響。比如,粉末樣品或者材料分散液采用超聲分散法[7];合金樣品可以選擇單獨(dú)采用或者結(jié)合雙噴電解拋光法、離子減薄法或者聚焦離子束技術(shù)這幾種方法[8-12];對(duì)于一些有機(jī)樣品或者生物樣品,可以選擇超薄切片技術(shù)[13-14]或者負(fù)染法[15]。現(xiàn)結(jié)合近幾年來(lái)的相關(guān)報(bào)道,重點(diǎn)介紹幾種目前適用于TEM樣品的制備方法及技術(shù)。

1 超聲分散法

對(duì)于粉末狀納米材料或納米材料分散液,最常用的制樣方法就是超聲波法[16-20]。超聲波法主要操作步驟如下:取少量樣品放入易揮發(fā)、與樣品不發(fā)生反應(yīng)的溶劑當(dāng)中,用超聲波充分分散后滴至微柵或支持膜上,常溫自然干或紅外燈烘干便可進(jìn)行TEM觀察。根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇合適的溶劑,常用的溶劑有水、乙醇、丙酮、氯仿等。對(duì)于樣品尺寸偏大導(dǎo)致電子束無(wú)法穿透的材料,可以先將試樣放入瑪瑙研缽中研碎再進(jìn)行超聲分散,比如氧化物陶瓷材料。圖1[21]為聚苯乙烯(PS)、表面為十二烷基磺酸鈉的聚苯乙烯(PS/SDS)、聚苯乙烯/聚多巴胺(PS/PDA)

圖1 四種不同納米粒子的TEM照片[21]Fig.1 TEM images of four different kinds of nanoparticles[21]

以及表面為十二烷基磺酸鈉的聚苯乙烯/聚多巴胺(PS/SDS/PDA)納米粒子的TEM結(jié)果,其制樣方法為去離子水超聲分散,再用滴管吸取少量滴置銅網(wǎng)上。圖2[22]是將催化劑研磨后取少許樣品分散在乙醇中,超聲分散2 min后將表面附有碳膜的銅網(wǎng)浸入乙醇分散液中取樣,最后晾干得到的TEM結(jié)果。

圖2 γ-Al2O3固載咪唑?qū)妆交撬猁}離子液體催化劑TEM照片[22]Fig.2 TEM images of [Hmim]TsO/γ-Al2O3 liquid catalyst[22]

2 雙噴電解拋光法

雙噴電解拋光法主要用于制備金屬和合金薄膜試樣[23-26]。在雙噴電解拋光之前,樣品一般要進(jìn)行預(yù)減薄,其操作流程如下:用精密切割機(jī)或復(fù)式線鋸將塊體試樣切成0.3 mm左右的均勻薄片。接著用砂紙將薄片機(jī)械研磨至100 μm左右的厚度。隨后機(jī)械拋光或使用化學(xué)拋光液將薄片減薄至40 μm左右,最后用沖孔機(jī)沖下Ф3 mm的圓片以備終減薄使用。雙噴電解法是終減薄的其中一種方法,其原理如圖3所示:將拋光好的薄片作為陽(yáng)極,用白金或不銹鋼作為陰極,在陽(yáng)極試樣中心的兩側(cè)噴射電解液進(jìn)行雙噴電解減薄。當(dāng)圓片的中心出現(xiàn)小孔,電解雙噴設(shè)備的光敏元件輸出電訊號(hào),拋光線路電源切斷,電解減薄終止。隨后立即將薄膜放入酒精中漂洗干凈以防形成氧化物類的污染層。張繼明等[27]利用FEI-F30高分辨透射電鏡對(duì)X100高級(jí)管線鋼中的馬奧島(MA)組織進(jìn)行了詳細(xì)研究分析,部分TEM結(jié)果如圖4所示。其樣品的處理方法采用的是雙噴電解減薄法。詳細(xì)步驟如下:利用線切割方法在小尺寸試樣的橫截面上切下0.5 mm厚度薄片,在砂紙上機(jī)械減薄至約50 μm厚度薄片,然后利用Gatan沖樣機(jī)沖下Ф3 mm的圓片。隨后在司特爾Tenupol-5雙噴減薄儀上進(jìn)行電解雙噴減薄,電解液為5%的高氯酸酒精溶液,減薄電壓為20 V,液氮制冷,使電解液的溫度始終保持在-20～-30 ℃。當(dāng)電解雙噴的試樣穿孔后,立即將試樣取出并用酒精沖洗干凈,充分干燥后放入樣品盒中備用。Wang等[28]利用透射電子顯微鏡對(duì)5052鋁合金的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí),對(duì)試樣的處理方法采用的也是雙噴電解法,其電解雙噴的條件如下:機(jī)械預(yù)減薄至50 μm的厚度,隨后進(jìn)行電解雙噴,電解液的組成為30% HNO3+70% CH3OH(體積分?jǐn)?shù)),直流電壓為16～20 V,溫度保持在-20 ℃。其TEM結(jié)果如圖5所示。電解電壓、電流、電解液的成分、溫度是雙噴電解制備TEM薄膜樣品的關(guān)鍵。不同的TEM樣品制備條件都不一樣,如表1所示。

圖3 雙噴電解減薄法的示意圖Fig.3 Schematic illustration of twin-jet electropolishing method

表1 電解雙噴減薄液的成分及減薄條件

TM為孿晶馬氏體;RA為殘留奧氏體圖4 X100管線鋼中馬奧島(MA)精細(xì)結(jié)構(gòu)的TEM分析[27]Fig.4 TEM analysis of fine structure of MA island in the X100 pipeline steel[27]

B為晶向指數(shù);N為應(yīng)力圖5 不同條件下的TEM圖[28]Fig.5 TEM images at different conditions[28]

3 離子減薄法

離子減薄法可用于陶瓷材料、合金、復(fù)合材料、多相半導(dǎo)體以及截面樣品的TEM樣品制備[45-50]。使用離子減薄方法制備TEM樣品之前,同樣需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)減薄,一般采用機(jī)械研磨的方法或金剛石切割器將試樣減薄為100 μm厚度的薄片,隨后用沖孔機(jī)沖下Ф3 mm的圓片,對(duì)于陶瓷等脆性材料,需要用Ф3 mm的金屬環(huán)補(bǔ)強(qiáng)。再用凹坑機(jī)在圓片中央部位磨出一個(gè)凹坑以備離子減薄使用。離子減薄主要是利用高能惰性氣體離子(通常使用的是Ar離子)轟擊試樣表面,使表面的原子濺射出來(lái),其原理圖如圖6所示,試樣在一特殊架上旋轉(zhuǎn),離子束在樣品的兩側(cè)以一定的傾角(5°～30°)轟擊樣品相反的兩個(gè)面。開(kāi)始時(shí)一般選擇快速減薄,設(shè)定高入射角的離子束。隨著樣品減薄特別是接近穿孔或已穿孔,離子束入射角要減小,以減少試樣表面損傷。所有材料在減薄過(guò)程中,最好使用液氮制冷以避免離子損傷產(chǎn)生的空穴引起擴(kuò)散性的改變。樣品預(yù)減薄的厚度、離子束的入射角、電壓、束流大小等都會(huì)影響試樣的減薄效果,不同的樣品,工藝參數(shù)就會(huì)有所區(qū)別。江鵬等[51]研究的Al-5Ti-1B合金采用的制樣方法就是離子減薄法,先通過(guò)機(jī)械減薄的方法將試樣減薄至80 μm的厚度,然后用Gatan的691離子減薄儀進(jìn)一步減薄,初始條件為離子束射角8°,電壓4.4 kV,電流0.02 mA。當(dāng)試樣中心出現(xiàn)微孔時(shí),將入射角降低至6°,繼續(xù)減薄20 min。樣品制備完畢后,用場(chǎng)發(fā)射透射電鏡Tecnai F30對(duì)其薄區(qū)進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖7所示。Hamu等[48]研究的AZ31鎂合金也是采用離子減薄法制備的TEM樣品,其制備過(guò)程如下:先從樣品中心切下直徑6 mm,厚度0.2 mm的薄片,然后機(jī)械拋光并沖下Ф3 mm的圓片,再在圓片中央部位磨出一個(gè)約為10 μm的凹坑,最后使用Gatan的691離子減薄儀進(jìn)行減薄,電壓設(shè)定在5.0 kV,入射角為6°～4°。制備好的薄膜樣品使用透射電子顯微鏡JEOL 2010進(jìn)行觀察,其結(jié)果如圖8所示。

圖6 離子減薄法的示意圖Fig.6 Schematic illustration of ion milling method

圖7 TiB的TEM明場(chǎng)相及其SAED花樣[51]Fig.7 TEM bright field image of TiB and its SAED pattern[51]

圖8 AZ31合金的TEM圖片[48]Fig.8 TEM image of the cast AZ31 alloy[48]

4 聚焦離子束技術(shù)(FIB)

聚焦離子束技術(shù)適用范圍相當(dāng)廣泛,大多數(shù)塊體材料的TEM樣品都可以采用聚焦離子束(focused ion beam, FIB)技術(shù),與傳統(tǒng)的電解雙噴和離子減薄等制樣方法相比,該技術(shù)具有精度高、速度快、成功率高等特點(diǎn),特別是可以制備出具有特定微觀區(qū)域的TEM樣品[52-58]。該技術(shù)由聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM雙束系統(tǒng))來(lái)完成,其工作原理如圖9所示。電子束垂直安裝,離子束與電子束成一定的夾角安裝,通常稱電子束和離子束焦平面的交點(diǎn)為共心高度位置,在使用過(guò)程中樣品處于共心高度的位置即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)離子束加工和電子束成像,并可以通過(guò)樣品臺(tái)的傾轉(zhuǎn)使樣品表面與電子束或離子束垂直。目前最常用的離子源為液態(tài)金屬Ga離子源,它具有低熔點(diǎn),低蒸氣壓,良好抗氧化性,且束流范圍大,束斑尺寸小等特性。

圖9 FIB-SEM 雙束系統(tǒng)示意圖Fig.9 Schematic illustration of FIB-SEM dual-beam system

付琴琴等[59]對(duì)FIB-SEM雙束技術(shù)做了簡(jiǎn)要介紹和典型的應(yīng)用展示,其中包括透射電鏡樣品的制備。透射電鏡樣品的制備可以分為非提取法和提取法兩種。非提取法是針對(duì)已經(jīng)預(yù)減薄的樣品,只需在其上面對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)一步定點(diǎn)FIB加工即可制得TEM樣品,如圖10所示。提取法是采用能夠提高樣品自支撐性的H形或X形方法對(duì)樣品進(jìn)行整體減薄,圖11即為H形減薄方法制備的TEM樣品。Sun等[57]利用透射電子顯微鏡觀察7150鋁合金微觀結(jié)構(gòu)以探究其腐蝕性能,其TEM薄膜樣品就是使用FEI公司Helios系列FIB-SEM雙束系統(tǒng)制得。制備過(guò)程和制備條件如下:首先在感興趣的區(qū)域表面鍍上一層Pt(保護(hù)層),然后提取樣品,最后通過(guò)離子束進(jìn)行減薄。為了減小離子束造成的損傷,減薄條件設(shè)定為電壓2 kV,電流23 pA。圖12(a)為7150鋁合金薄膜提取的位置圖,圖12(b)和圖12(c)為感興趣區(qū)域的STEM-HAADF圖。

圖10 非提取法制備 TEM 樣品[59]Fig.10 A typical TEM sample prepared through non-lift-out method[59]

圖11 H形減薄樣品[59]Fig.11 A sample thinned through H-type technology[59]

圖12 7150鋁合金的微觀結(jié)構(gòu)[57]Fig.12 Microstructures of 7150 Al alloy [57]

5 超薄切片技術(shù)

超薄切片技術(shù)多適用于制備生物樣品、聚合物樣品以及比較軟的無(wú)機(jī)材料的TEM樣品[60-65]。生物樣品的制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜,大致可以分為以下幾個(gè)步驟:取材、固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、修整定位和超薄切片。為了能夠觀察到接近生活狀態(tài)時(shí)的生物組織或細(xì)胞,要求取材速度越快越好。取完后立即使用固定劑固定,時(shí)間間隔越短越好,常用固定劑有四氧化鋨固定液、戊二醛固定液和多聚甲醛固定液。為了去除殘留的固定液,然后需要使用緩沖液對(duì)其進(jìn)行漂洗,常用漂洗液為0.1 mol/L的磷酸緩沖液。由于大多數(shù)的包埋劑不溶于水,漂洗后的組織塊,應(yīng)使用脫水劑去除組織中的游離水,有利于包埋劑均勻滲入組織塊內(nèi),常用的脫水劑有乙醇和丙酮。隨后選擇合適的包埋劑對(duì)其進(jìn)行包埋使之具有良好的硬度和切割性能。也可以使用脫水劑來(lái)稀釋包埋劑,以實(shí)現(xiàn)包埋劑取代脫水劑,這個(gè)過(guò)程就是滲透。包埋處理一般使用的是丙烯基類的樹(shù)脂或環(huán)氧類的樹(shù)脂。將包埋塊修塊定位好后就可以超薄切片了,此步驟需要使用到超薄切片機(jī),其原理如圖13所示。超薄切片機(jī)通過(guò)上下移動(dòng)固定試樣的臂,使樣品通過(guò)金剛石刀進(jìn)行切片,樣品每上下運(yùn)動(dòng)一次就自動(dòng)向前進(jìn)一點(diǎn)。通常,水槽中裝滿水,連續(xù)切出的薄片都漂浮在水面上,最后用銅網(wǎng)撈出。Yamaoka等[63]采用TEM研究紅色亞棲熱菌H328的特征。其樣品制備過(guò)程如下:提取,戊二醛固定液和磷酸鉀緩沖液固定,不同濃度的乙醇溶液脫水,正丁基縮水甘油醚和812環(huán)氧樹(shù)脂混合物浸潤(rùn),隨后轉(zhuǎn)移至純812環(huán)氧樹(shù)脂包埋,再用金剛石刀切片(70 nm厚度),醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,最后用TEM觀察其形貌,結(jié)果如圖14所示。

圖13 超薄切片的示意圖Fig.13 Schematic illustration of ultrathin slicing method

圖14 紅色亞棲熱菌H328超薄切片的TEM圖[63]Fig.14 TEM images of ultrathin sections of Meiothermus ruber H328[63]

采用超薄切片技術(shù)制樣的聚合物樣品和無(wú)機(jī)樣品的操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單一些,一般情況下只需要通過(guò)包埋、修整定位和超薄切片就可以完成前期制樣工作。Yang等[66]在研究嵌段共聚物微球時(shí),為了清楚地觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu),先將樣品包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中,然后固化,隨后用在萊卡超薄切片機(jī)(UCT-GA-D/E-1/00, Germany)上用金剛石刀進(jìn)行切片,其厚度控制在100 nm左右,再用300目的銅網(wǎng)撈出。最后用碘蒸氣染色1 h以增加樣品襯度。制備好的樣品用透射電子顯微鏡觀察,其結(jié)果如圖15所示。

圖15 PS133K-b-P2VP132K 微球橫截面切片的TEM圖[66]Fig.15 TEM images of the cross-sectional slices of PS133K-b-P2VP132K microspheres[66]

6 負(fù)染法

負(fù)染法主要用于制備病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、生物大分子等TEM樣品[67-71]。負(fù)染色又稱為陰性反差染色,它主要是利用密度反差和靜電場(chǎng)反差來(lái)提高樣品的分辨力。生物樣品的負(fù)染過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便,先將樣品制成懸浮液,隨后采用懸滴法將其附著于載網(wǎng)上。具體方法如下:將懸浮液用毛細(xì)吸管或移液槍滴一滴附著于載網(wǎng)上,呈液珠狀。靜置數(shù)分鐘再用濾紙的邊角在液珠的邊緣吸走多余的液體。然后滴上一種合適濃度的染液靜置數(shù)分鐘,樣品不同染色時(shí)間差異很大。待染色結(jié)束自然風(fēng)干后便可用透射電子顯微鏡觀察。一般可選擇的染色液有磷鎢酸溶液、磷鎢酸鹽溶液和醋酸鈾水溶液等。徐健[72]采用TEM觀察丙烯酸酯乳液的微觀結(jié)構(gòu)之前,先將樣品稀釋150倍,再用磷鎢酸進(jìn)行染色,其TEM結(jié)果如圖16所示,可以清晰地觀察到樣品為具有核殼結(jié)構(gòu)的規(guī)整球形,內(nèi)層白色為核層,外層灰色為殼層。Sahiro等[73]研究表明Preyssler型磷鎢酸鉀(K(15-n)[P5W30O110Mn+],M=Na+,Ca2+,Ce3+,Eu3+,Bi3+,Y3+)對(duì)病毒類樣品是一種具有高性能的陰性染色試劑。圖17所示為負(fù)染法的操作流程,先將病毒吸附于碳膜上,然后滴加含重金屬元素的染色劑,過(guò)一定時(shí)間移走多余的染色液,自然干以后就能用于電鏡觀察。圖18為T4噬菌體的TEM圖,使用的是一種Preyssler型Eu3+包裹的K12[P5W30O110Eu(H2O)]染色劑,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的水溶液。

圖16 MAA6乳膠粒的TEM圖[72]Fig.16 TEM images of MAA6 emulsion particles [72]

圖17 負(fù)染法[73]Fig.17 Negative staining method[73]

圖18 T4噬菌體的TEM圖[73]Fig.18 Transmission electron microscopy (TEM) images of T4 phages[73]

7 總結(jié)與展望

透射電子顯微鏡是一種研究物質(zhì)微觀形貌、顯微結(jié)構(gòu)以及微觀成分的高端儀器,可以實(shí)現(xiàn)在原子尺度上對(duì)“加工處理-結(jié)構(gòu)-性質(zhì)”的關(guān)聯(lián)性研究。因此,透射電子顯微分析技術(shù)是科學(xué)研究過(guò)程中不可缺少的表征手段。然而,能否制備好透射電子顯微鏡樣品是利用好該儀器的關(guān)鍵因素。對(duì)于不同類型的透射電子顯微鏡樣品,應(yīng)該采取不同的制樣方法。這些方法可以總結(jié)為:超聲分散法、雙噴電解拋光法、離子減薄法、聚焦離子束技術(shù)、超薄切片技術(shù)以及負(fù)染法。對(duì)于粉末樣品及大多數(shù)懸浮液,一般可以采用超聲分散法制樣;對(duì)于金屬、陶瓷等塊狀樣品,可以采用雙噴電解拋光法、離子減薄法或者聚焦離子束技術(shù)中的一種或者幾種結(jié)合的方式進(jìn)行制樣;對(duì)于一些特殊的有機(jī)薄膜樣品以及生物試樣等樣品,可以采用超薄切片技術(shù);只包含輕元素的生物樣品則需采用負(fù)染法制樣。不同樣品的制樣不僅僅選擇的制樣方法會(huì)有所不同,而且工藝參數(shù)也會(huì)不同。選擇合適的制樣方法及最佳參數(shù)將會(huì)大大提高透射電子顯微鏡的表征效果,更有利于推進(jìn)科研工作。無(wú)損、高精度、高效率、自動(dòng)化的制樣技術(shù)將是未來(lái)透射電子顯微鏡制樣設(shè)備發(fā)展的主要方向。