陳志峰, 倪 輝, 馮 翯, 陳 嘯 , 蔡麗娟, 孫維紅,3, 鄒雙全

(1.遵義師范學(xué)院,貴州 遵義 563000;2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002;3.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350002;4.福州外語外貿(mào)學(xué)院,福建 福州 350202)

野鴉椿屬(Euscapis)為省沽油科(Staphyleaceae)落葉灌木或小喬木,僅野鴉椿(E.japonica)單個(gè)種[1],主要分布在中國南部、日本和朝鮮,是我國近年來快速發(fā)展的觀賞植物和藥用植物。野鴉椿掛果期長、果色鮮紅、果成熟開裂似展翅蝴蝶,在園林上可盆栽、孤植、列植或片植,在我國福建、江西、貴州等地作為行道樹、觀賞樹、藥用林而被廣泛種植[2]。野鴉椿枝、葉和果均富含酚酸類、黃酮類、總?cè)?、生物堿等成分,可用于治療感冒、頭暈、頭痛等,是我國民間的傳統(tǒng)藥材[1-3]。目前,對野鴉椿的研究主要集中于種質(zhì)資源鑒定、種苗繁育、栽培、化合物分離與鑒定、藥理活性等方面,而忽略了野生資源的保護(hù)[4-5]。了解物種的遺傳變異是制定科學(xué)保護(hù)策略的理論基礎(chǔ)。野鴉椿自然群體主要分布于海拔100～1 200 m的山谷或林緣,因受到人類活動的干擾,導(dǎo)致天然群體面積和分布逐漸縮小,再加上自然更新能力弱,野鴉椿種質(zhì)資源和遺傳變異正在遭受威脅[6]。因此,了解野鴉椿的遺傳變異可為其分類以及種質(zhì)資源利用和制定保護(hù)策略等提供參考。

遺傳變異是物種適應(yīng)和進(jìn)化的基礎(chǔ)[7],也是抵抗環(huán)境變化的重要保障。林木的遺傳多樣性越豐富,則越能適應(yīng)不斷變化的環(huán)境和惡劣條件[8]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是全基因組水平上由單個(gè)核苷酸堿基變異引起的DNA序列多態(tài)性,可以檢測基因組序列中每個(gè)核苷酸的變化[9],具有數(shù)量多、分布廣、代表性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性好等特點(diǎn),是評價(jià)物種遺傳背景最為理想的分子標(biāo)記[10]。特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序技術(shù)(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq)能夠大規(guī)模、快速、有效、準(zhǔn)確地開發(fā)物種中的SNP[11],尤其適用于沒有參考基因組的物種。本研究利用SLAF測序技術(shù)開發(fā)野鴉椿群體的SNP標(biāo)記,旨在從分子水平上揭示其遺傳變異和分化,了解現(xiàn)存野生種群的遺傳背景及其對種群結(jié)構(gòu)的影響,為野鴉椿種群現(xiàn)狀的評價(jià)和科學(xué)管理提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取樣與群體特征

2019年8月—2020年8月,在野鴉椿果期開展野外調(diào)查,收集了自然分布的12個(gè)種源,共94份樣品。2020年4月,采集所有樣品的嫩葉,用體積分?jǐn)?shù)為95%酒精和純水洗凈,經(jīng)液氮處理后,置于-80 ℃冰箱中保存。樣品取樣信息詳見表1。2019—2022年,對全部樣本進(jìn)行物候觀測,詳細(xì)記錄各種源果和葉的表型。

表1 野鴉椿的采樣信息Table 1 Sampling information of E.japonica

1.2 SLAF文庫的構(gòu)建和測序

SLAF測序包括樣品質(zhì)量檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測和文庫測序。使用改良的十六烷基三甲基溴化銨法(acetyltrimethylammonium bromide, CTAB法)提取葉片DNA,以瓊脂糖凝膠電泳檢測和Nano-drop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo,美國)分別檢測DNA的純度和濃度。質(zhì)檢合格的DNA用于SLAF文庫的構(gòu)建。

利用選定的RsaⅠ+HaeⅢ對檢測合格的每個(gè)樣品DNA進(jìn)行酶切;對得到的酶切片段進(jìn)行3′端加多聚腺苷酸[polyadenylic acid, poly(A)]處理、連接Dual-index測序接頭、PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠,選取314～364 bp的目標(biāo)序列定義為野鴉椿的SLAF標(biāo)簽。文庫質(zhì)檢合格后在華大基因Illumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行測序,下機(jī)的原始數(shù)據(jù)用于開發(fā)SLAF標(biāo)簽和SNP分子標(biāo)記。

1.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)和變異分析

使用MEGA X軟件中的鄰接法(neighbor-joining method, NJ),采用p-distance模型,bootstrap重復(fù)1 000次,以省沽油(Staphyleabumalda)作為外類群,構(gòu)建進(jìn)化樹;利用Admixture(V1.3.0,http//software.genetics.ucla.edu/admixture/index.html)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析,假設(shè)樣本的分群數(shù)(K值)為1～10,當(dāng)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率(cross-validation errors, CV)最小時(shí)為最佳分類群數(shù)。EIGENSOFT(V7.2.1,https://www.hsph.harvard.edu/alkes-price/software/)用于主成分分析。利用GenAlEx 6.5軟件計(jì)算各群體和每對引物的觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、Nei′s多樣性指數(shù)(Nei′s gene diversity,H)、香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon′s information index,I)、多態(tài)性信息含量(polymorphic information content, PIC)、遺傳分化指數(shù)(fixation index,FST)等遺傳多樣性參數(shù)。由于浙江省溫州岱嶺(WZ)和福建省漳州南靖(NJ)、福州閩清(MQ)、龍巖連城(LY)等地采集到的野生野鴉椿個(gè)體數(shù)量過少,不進(jìn)行遺傳參數(shù)估算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLAF標(biāo)簽和SNP開發(fā)

對測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,共獲得329.73 Mb 干凈數(shù)據(jù),平均測序深度為16.00×,Q30的平均質(zhì)量為92.80%,表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好,可用于SLAF標(biāo)簽的開發(fā)。對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,序列相似的定義為同一個(gè)SLAF標(biāo)簽。在此基礎(chǔ)上,篩選樣本間存在差異的SLAF標(biāo)簽為多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽,以深度最高的多態(tài)性SLAF標(biāo)簽作為參考序列進(jìn)而開發(fā)全基因組范圍的SNP標(biāo)記。根據(jù)次要等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于0.05和完整性大于0.8的原則,篩選出高質(zhì)量的SNP標(biāo)記。本研究中,基于SLAF測序共獲得19 111 187個(gè)SLAF標(biāo)簽,每個(gè)樣品平均獲得607 458個(gè)多態(tài)SLAF標(biāo)簽和238 850個(gè)高質(zhì)量的特異性SNP,可用于野鴉椿遺傳變異和分化的分析(表2)。

表2 野鴉椿群體的SLAF標(biāo)簽統(tǒng)計(jì)1)Table 2 Statistics of SLAF tags for different populations of E.japonica

2.2 群體變異

由表3可知,在物種水平上,野鴉椿的H和I分別為0.373 4和0.546 8,Ho(0.069 2)小于He(0.371 2)。群體間的H和I分別在0.201 2(JX)～0.449 7(TN)和0.334 2(JX)～0.607 8(TN)之間,除了JO群體,其他群體的Ho均小于He(表3)。此外,分子方差分析表明,種群間的遺傳變異占總變異的40.36%(P≤0.001),而群體內(nèi)的遺傳變異僅占總變異的27.65%(P≤0.001)(表4)。

表3 野鴉椿群體的遺傳多樣性指數(shù)分析1)Table 3 Analysis on genetic diversity index of different E.japonica populations

表4 分子方差分析Table 4 Analysis of molecular variance

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)

基于SNP構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明,以省沽油科的省沽油(SXY)為外類群,所有野鴉椿樣品分為兩大類。聚類Ⅰ包含36個(gè)樣本,主要來自ZY、WZ、MQ、YA、LY等群體以及DH9～DH11、TN6～TN10、JS10(圖1A);其余JX、JO、QL、NJ等群體以及DH1～DH8、TN1～TN5、JS1～JS9則為聚類Ⅱ。結(jié)合2019—2022年的物候和表型觀察,發(fā)現(xiàn)聚類Ⅰ為落葉類,花期4—5月,果實(shí)期7—10月,6月果皮變色,7月果皮全紅,10—11月開始落葉掉果;葉紙質(zhì)或厚紙質(zhì),葉緣具細(xì)鋸齒,果軟革質(zhì),果表皮肋脈明顯(圖1E、1F、1G)。而聚類Ⅱ?yàn)槌＞G類,花期5—6月,果實(shí)期9—3月,8月果皮變色,9月果皮全紅,果實(shí)可在枝頭宿存直到次年3月;葉膜質(zhì),葉緣具鈍鋸齒,果革質(zhì),果表皮肋脈不明顯(圖1B、1C、1D)。

使用Admixture軟件構(gòu)建了野鴉椿種群的群體結(jié)構(gòu)(圖2)。從圖2B可見,當(dāng)K=2～6時(shí),可以明顯地看到落葉類和常綠類群體之間幾乎不存在基因交流,當(dāng)K=7～10時(shí),落葉類和常綠類群體之間存在少量的基因漸滲。但在圖2A中,K=3時(shí),交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最低,意味所有群體的最優(yōu)分類為3組,第1組和第2組樣本為常綠類,第1組樣本(綠色)共有42個(gè),主要來自福建省的群體,如JO、QL、JS和NJ等群體;第2組樣本(黃色)有16個(gè),主要來自江西省JX群體;第3組(灰色)為落葉類,包含36個(gè)樣本,且這些樣品與系統(tǒng)發(fā)育樹中聚類Ⅰ的樣本一致(圖2B)。

A.群體結(jié)構(gòu)點(diǎn)圖;B.種群遺傳的聚類圖。圖2 野鴉椿的遺傳聚類Figure 2 Genetic clustering analysis of E.japonica

主成分(PCA)分析發(fā)現(xiàn),省沽油(SXY)與野鴉椿明顯分開,野鴉椿所有樣品主要分為3類,與群體結(jié)構(gòu)的結(jié)果完全相同。A組中的樣本與系統(tǒng)發(fā)育樹中聚類Ⅰ和群體結(jié)構(gòu)中第3組的一樣;B組和C組中的樣本分別與群體結(jié)構(gòu)中第2組和第1組的一致。由此可見,A組是落葉類,B組和C組是常綠類(圖3)。

圖3 基于SNP位點(diǎn)的主成分分析Figure 3 Principal component analysis based on SNP sites

2.4 遺傳分化

FST是衡量群體間分化程度的一個(gè)指標(biāo)。Wright[12]認(rèn)為,FST為0～0.05,群體間遺傳分化很小,可以不考慮;FST為0.05～0.15,群體間存在中等程度的遺傳分化;FST為0.15～0.25,群體間遺傳分化較大;FST為0.25以上,群體間有很大的遺傳分化。分析各個(gè)群體的FST值發(fā)現(xiàn),本研究群體間存在很大遺傳分化的群體有TN(0.79)、DH(0.76)、JS(0.53)、JX(0.44);群體間存在中等程度遺傳分化的群體有ZY(0.08)、QL(0.05)群體;YA(0.01)、JO(0.02)群體的分化程度小(表5)。另外,綜合表型觀察、系統(tǒng)發(fā)育樹、PCA和群體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果,對野鴉椿落葉類和常綠類的樣品進(jìn)行FST值分析發(fā)現(xiàn),落葉樹和常綠樹的FST值分別為0.28和0.36。

表5 各個(gè)群體的遺傳分化指數(shù)分析1)Table 5 Genetic differentiation index of each population

3 討論

利用簡化基因組測序技術(shù)SLAF-seq,獲取大量多態(tài)性SLAF標(biāo)簽,進(jìn)而開發(fā)特異性的SNP標(biāo)記,被廣泛應(yīng)用于遺傳進(jìn)化分析[13]、GWAS關(guān)聯(lián)分析[14]、遺傳圖譜構(gòu)建[15]。本研究對野鴉椿自然分布區(qū)12個(gè)種源共94個(gè)樣品進(jìn)行SLAF測序,每個(gè)樣品平均獲得了238 850個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記,與櫟樹(Quercusshumardii)群體(200 735)、古茶樹(Camelliasinensis)群體(283 376)的平均SNP標(biāo)記相近[16-17]?；诟哔|(zhì)量的SNP進(jìn)行了野鴉椿遺傳變異分析發(fā)現(xiàn),野鴉椿在物種水平上的Nei′s遺傳多樣性(H)和Shannon多樣性指數(shù)(I)分別為0.373 4和0.546 8,比野生省沽油群體的遺傳多樣性指數(shù)(H=0.265 3,I=0.411 8[18];H=0.219 0,I=0.349 3)[19]高,但這并不能說明野鴉椿與同科的樹種相比在物種水平上的遺傳多樣性更為豐富。因?yàn)楸狙芯恐幸傍f椿的觀測雜合度(0.069 2)遠(yuǎn)小于期望雜合度(0.371 2),這意味著野鴉椿中雜合子缺失,群體遺傳多樣性水平較低。

據(jù)《Flora of China》[1]記載,野鴉椿屬僅1種落葉灌木或小喬木樹種,即野鴉椿。通過對12個(gè)群體長達(dá)3 a的物候觀察發(fā)現(xiàn),野鴉椿群體主要有落葉類和常綠類兩大類型,且它們的物候、葉和果的表型差異明顯。本研究中,系統(tǒng)發(fā)育分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析和主成分分析結(jié)果基本一致,將所有野鴉椿樣品主要分為落葉類和常綠類。地理隔離、棲息地破碎化、基因交流不頻繁可以改變物種進(jìn)化模式的方向,影響其遺傳變異,導(dǎo)致種群內(nèi)的遺傳多樣性低以及不同種群之間的分化程度高[20-24]。對大多數(shù)木本植物而言,群體內(nèi)的遺傳變異比群體間的遺傳變異豐富[20],而本研究中野鴉椿的群體間遺傳變異(40.36%)比群體內(nèi)的豐富(21.99%),且野鴉椿顯著分化為落葉類和常綠類,這暗示了在長期進(jìn)化過程中某些因素推動了野鴉椿的分化。

地理隔離使得同一物種因地理障礙難以發(fā)生基因交流,導(dǎo)致生殖隔離,形成獨(dú)立的種群[21]。生境破碎化會導(dǎo)致遺傳侵蝕、遺傳漂變和近交,引起雜合度降低,使個(gè)體適應(yīng)性下降,最終抑制種群的持續(xù)[21,24]。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn),NJ、LY、MQ、WZ等群體位于自然村落,受到人類活動的干擾,其群體數(shù)量小;貴州省的ZY群體、浙江省的WZ群體和江西省的JX群體與福建省內(nèi)的群體地理相隔遠(yuǎn),群體間難以發(fā)生基因交流。野鴉椿為兼性異交,蜜蜂為主要傳粉者[25],但野外觀測發(fā)現(xiàn),即使在同一群體內(nèi)落葉類和常綠類野鴉椿的花期至少相差1個(gè)月,導(dǎo)致落葉類和常綠類之間不可能存在基因交流;遺傳結(jié)構(gòu)分析也證實(shí)落葉類和常綠類間幾乎沒有基因滲透。TN、DH、JS等群體的FST值較高,說明了落葉類和常綠類的同時(shí)存在是野鴉椿群體高度分化的結(jié)果。綜上分析,本研究推測地理隔離、棲息地破碎化、基因交流受阻或缺乏是野鴉椿群體內(nèi)遺傳多樣性低、群體間分化程度高的原因。

4 結(jié)論

本研究觀測了自然分布區(qū)12個(gè)野鴉椿種源的物候、花和果的表型;并首次利用SLAF-seq對這些野生種質(zhì)進(jìn)行測序,挖掘了238 850個(gè)高質(zhì)量的多態(tài)性SNP位點(diǎn),從分子層面分析了野鴉椿的遺傳變異和分化。野鴉椿群體內(nèi)遺傳多樣性低、群體間遺傳分化程度高。多種分析方法表明,單種屬野鴉椿已經(jīng)分化為落葉類和常綠類。落葉類的葉紙質(zhì)或厚紙質(zhì)、葉緣具細(xì)鋸齒,果軟革質(zhì)、果表皮肋脈明顯;而常綠類的葉膜質(zhì)、葉緣具鈍鋸齒,果革質(zhì)、果表皮肋脈不明顯。