摘要：

為了篩選能夠生物轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯的微生物，將7株假臭草內(nèi)生真菌作為生物催化劑，在30 ℃，150 r·min-1下發(fā)酵6 d后，添加體積分?jǐn)?shù)為0.5%的（+）-檸檬烯繼續(xù)轉(zhuǎn)化4 d，并采用薄層層析、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振技術(shù)分析產(chǎn)物.結(jié)果表明：各真菌生物轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯的主要產(chǎn)物為（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇、環(huán)氧檸檬烯、（1S，2R，4R）-檸檬烯-1，2-二醇等；菌株Alternaria Nees PS08生成唯一產(chǎn)物（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇，質(zhì)量濃度達(dá)到（2.46±0.16） g·L-1.

關(guān)鍵詞：

（+）-檸檬烯； 假臭草； 植物內(nèi)生真菌； （1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇

中圖分類號(hào)： Q 53文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A?? 文章編號(hào)： 1000-5013（2023）04-0495-07

Analysis of Biotransformation Products of （+）-Limonene by Plant Endophytic Fungi From Praxelis clematidea

YANG Daomao

（College of Chemical Engineering， Huaqiao University， Xiamen 361021， China）

Abstract：

In order to screen microorganisms of biotransformation of （+）-limonene， seven endophytic fungi from Praxelis clematidea were used as biocatalysts. After 6 days of fermentation under 30 ℃ and 150 r · min-1， 0.5% volume fraction of （+）-limonene was added for further 4 days， the products were analyzed by Thin Layer Chromatography， Gas Chromatography-Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance technology. The results showed that the main products of biotransformation of （+）-limonene by various fungi were （1S，2S，4R）-limonene-1，2-diol， limonene epoxide， （1S，2R，4R）-limonene-1，2-diol， etc.. The strain Alternaria Nees PS08 produced only product （1S，2S，4R）-limonene-1，2-diol， and its mass concentration reached （2.46±0.16） g·L-1.

Keywords： （+）-limonene； Praxelis clematidea； plant endophytic fungi； （1S，2S，4R）-limonene-1，2-diol

（+）-檸檬烯為檸檬精油的主要成分，屬于柑橘加工過程中的副產(chǎn)物.由于結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)格低廉，有多個(gè)可以催化的位點(diǎn)［1］，（+）-檸檬烯一直是理想的生物轉(zhuǎn)化底物模型.能轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯的微生物種類多樣，如假單胞屬細(xì)菌（Pseudomonas sp.）［2-3］，尖孢鐮刀菌152b［4］、指狀青霉菌［5-6］、黑曲霉［7］、解脂耶氏酵母［8-9］.雖然在生物催化劑的篩選領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)展，但微生物的低轉(zhuǎn)化效率［10］和巨大的篩選工作量嚴(yán)重影響生物轉(zhuǎn)化的推廣與應(yīng)用，如ROTTAVA等［11］從405株菌株中只發(fā)現(xiàn)８株菌株能夠轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯.針對(duì)該問題，有學(xué)者指出植物內(nèi)生真菌是一個(gè)很有發(fā)展前景的篩選來源.植物內(nèi)生真菌因?yàn)樾枰c宿主植物一起共進(jìn)化來適應(yīng)環(huán)境的變化，使其可能會(huì)產(chǎn)生豐富的酶來適應(yīng)宿主［12］，如海藻來源內(nèi)生真菌Botryosphaeria sp.［13］能將外消旋樟腦轉(zhuǎn)化為6-endo-羥基樟腦、6-exo-羥基樟腦等產(chǎn)物，火炬松來源內(nèi)生真菌Phomopsis sp.能轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯合成香芹酮和檸檬烯-1，2-二醇，如果底物為柑橘皮提取物，則生成單一產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇［14］，內(nèi)生真菌Aspergillus fumigatus ［15］能轉(zhuǎn)化硫利達(dá)嗪.因此，利用植物內(nèi)生真菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是可行的［16］.

假臭草（Praxelis clematidea （Griseb.） R. M. King & H. Rob.）屬于菊科植物，原產(chǎn)南美，現(xiàn)入侵亞洲和大洋州等地.由于假臭草對(duì)土壤肥力吸收力強(qiáng)，嚴(yán)重影響果樹的生長，此外，它能分泌一種有毒的惡臭味，影響家畜覓食，屬于入侵植物.研究發(fā)現(xiàn)假臭草花精油對(duì)柑橘木虱具有驅(qū)避和致死活性［17］，且其總黃酮類化合物對(duì)金黃葡萄球菌有抑菌活性［18］.

目前，尚未見到假臭草內(nèi)生真菌用于生物轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯的相關(guān)報(bào)道.基于此，本文以分離自假臭草內(nèi)生真菌為生物轉(zhuǎn)化劑，考察其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物.

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

（+）-檸檬烯（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；石油醚（60～90 ℃）、無水乙醇、乙酸乙酯（上海市國藥試劑有限公司）；（1S，2S，4R）-（+）-二戊烯-1，2-二醇（（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇，CAS號(hào)：38630-75-0，美國Sigma-Aldrich公司）；氘代甲醇（廣東省廣州賽迪菲生物科技有限公司）.以上試劑均為分析純.0.22 μm濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；100目硅膠、GF254型薄層層析硅膠板（50 mm×200 mm，山東省青島海洋化工廠分廠）.

ZQZY-75CN型振蕩培養(yǎng)箱（上海支楚儀器有限公司）；XH-C型旋渦混合器（江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠）；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái)（江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；H1650型醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Agilent 8860 GC System-5977B型氣質(zhì)聯(lián)用儀器（帶G4513A自動(dòng)進(jìn)樣器，美國安捷倫科技有限公司）；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；Bruker-500 MHz型核磁共振譜儀（瑞士布魯克公司，由華僑大學(xué)分析測試中心提供）.

1.2 微生物與培養(yǎng)基

7株植物內(nèi)生真菌（Alternaria Nees PS01，Alternaria Nees PS06，Alternaria Nees PS07，Alternaria Nees PS09，Alternaria Nees PS10，Alternaria Nees PS18，Diaporthe amygdali PS08）由華僑大學(xué)化工學(xué)院王奇志博士饋贈(zèng).

培養(yǎng)基均采用沙保氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，葡萄糖40 g·L-1（pH值為4.0～6.0）.

1.3 檢測方法

薄層層析（TLC）方法：展開劑為V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=7∶3，顯色劑采用體積分?jǐn)?shù)為1%的香草醛濃硫酸溶液.

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）：Agilent HP-5 ms型色譜柱（30 m×250 μm ×0.25 μm），載氣為氦氣，進(jìn)樣量為1 μL.溫度程序：60 ℃保持1 min，20 ℃·min-1升溫到300 ℃，保持13 min.MS離子源溫度為230 ℃，MS四極桿溫度為150 ℃，質(zhì)譜掃描范圍（m/z）為60～800.

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 菌株活化與發(fā)酵

各測試菌株接種于裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后，存于4 ℃冰箱中備用.

每株菌挑取一接種環(huán)菌絲接種于裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在28 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)6 d.

2.2 生物轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯及產(chǎn)物分析

生物轉(zhuǎn)化流程參考海洋真菌的生物轉(zhuǎn)化流程并做細(xì)微調(diào)整［19］，具體流程為：在每株菌培養(yǎng)了6 d的100 mL發(fā)酵液中，加入1 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌的（+）-檸檬烯-乙醇溶液（檸檬烯溶于等體積乙醇，檸檬烯的最終體積分?jǐn)?shù)為0.5%），在28 ℃，150 r·min-1條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d.

轉(zhuǎn)化結(jié)束，發(fā)酵液用布氏漏斗過濾后，取3 mL濾液轉(zhuǎn)移到150 mm×15 mm的試管中，用等體積乙酸乙酯萃?。蝗缓?，將萃取相轉(zhuǎn)移到干燥的150 mm×15 mm的試管中，并用無水硫酸鈉脫水；最后，取萃取相進(jìn)行TLC和GC-MS檢測.

2.3 菌株P(guān)S18轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

鑒于TLC檢測結(jié)果，選取包含2個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的菌株P(guān)S18，按照節(jié)2.2的生物轉(zhuǎn)化流程制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)物.具體流程為：配制2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝于25瓶250 mL錐形瓶中.后續(xù)的發(fā)酵與轉(zhuǎn)化步驟參考節(jié)2.1，2.2.轉(zhuǎn)化結(jié)束，將發(fā)酵液用布氏漏斗過濾，等體積乙酸乙酯萃取濾液2次后，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃，真空度-0.1 MPa下蒸發(fā)有機(jī)溶劑，最終獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3.33 g.

取少量乙酸乙酯完全溶解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物后，用100目硅膠拌樣陰干，隨后采用干法上玻璃色譜柱（300 mm×25 mm），洗脫劑體系采用V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）為14∶2～14∶4

進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度洗脫體積為200 mL以上，并用TLC跟蹤洗脫結(jié)果.最終獲得化合物PS18-1（1.56 g），PS18-2（0.87 g），用氘代甲醇溶解后進(jìn)行核磁共振檢測.

2.4 各菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度檢測

建立檸檬烯-1，2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線.實(shí)驗(yàn)步驟為：用乙酸乙酯溶解標(biāo)準(zhǔn)品并配制8.600 0 g·L-1母液，采用逐步稀釋的方法，將母液稀釋成不同質(zhì)量濃度，隨后采用節(jié)1.3的方法獲得檸檬烯-1，2-二醇的峰面積-質(zhì)量濃度的關(guān)系圖.

挑取各菌株的菌絲接種于裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，每株菌重復(fù)3次，后續(xù)發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化步驟參考節(jié)2.1，2.2.最后，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的平均質(zhì)量濃度.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 各菌萃取液TLC分析

將各真菌的萃取相進(jìn)行TLC檢測，結(jié)果如圖1所示.

由圖1可知：菌株P(guān)S01，PS06和PS08的條帶僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)主要斑點(diǎn)，且比移值（Rf）與標(biāo)準(zhǔn)品（（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇）一致；菌株P(guān)S07，PS18的條帶明顯多出1個(gè)斑點(diǎn).從真菌測序結(jié)果可知，除了菌株P(guān)S08歸屬于扁桃腐皮殼菌（D. amygdali），其余菌株歸屬于鏈格孢屬（A. Nees），但轉(zhuǎn)化產(chǎn)物卻不相同，說明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與種屬之間不存在必然的聯(lián)系.

3.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物GC-MS檢測

各菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總離子色譜（TIC）圖，如圖2所示.圖2中：I為強(qiáng)度；t為時(shí)間.

檢索NIST 17.0數(shù)據(jù)庫可知，峰1匹配環(huán)氧檸檬烯（limonene oxidde），屬于檸檬烯-1，2-二醇前體物質(zhì)［20-22］；峰2匹配化合物檸檬烯-1，2-二醇，保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致；峰3匹配結(jié)果與峰2一致，推測為峰2的同分異構(gòu)體；峰4未檢索到匹配的化合物.

3.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物PS18-1，PS18-2的TLC圖和TIC圖，如圖3所示.

經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，化合物PS18-1，PS18-2均匹配為檸檬烯-1，2-二醇，結(jié)合TLC結(jié)果，推測二者為同分異構(gòu)體.

化合物PS18-1碳譜13C NMR（500 MHz，CD3OD）的化學(xué)位移（δ）為151.44，108.98，74.41，71.70，38.79，35.13，34.38，27.63，27.41，21.08.該碳譜化學(xué)位移與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物2（（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇）完全一致［23］，也與化合物2a的碳譜化學(xué)位移相同［24］.化合物PS18-1的氫譜1H NMR（500 MHz，CD3OD）的化學(xué)位移（δ）為3.55（dd，J = 2.3，2.0，1H，H-2），1.63（m，H-3），1.91（ddd，1Heq，13.2，13.2，2.6，H-3），2.27（m，1H，H-4），1.48（m，Hax-5），1.60（m，Heq-5），1.49（m，1Hax，H-6），1.73（m，1Heq，H-6），1.20（s，3H，H-7），4.71（bs，1H，H-9），4.68（bs，1H，H-9），1.72（s，3H，H-10）.該數(shù)據(jù)與化合物2的氫譜數(shù)據(jù)一致［23］.

綜上，化合物PS18-1歸屬于（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇.化合物PS18-1和化合物2的碳譜圖和氫譜圖，如圖4所示.

化合物PS18-2碳譜13C NMR（500 MHz，CD3OD）的化學(xué)位移（δ）為150.11，109.39，77.83，74.45，45.23，39.79，37.87，29.77，21.02，18.91.該碳譜數(shù)據(jù)與化合物1（（1S，2R，4R）-檸檬烯-1， 2-二醇）數(shù)據(jù)完全相同［23］.化合物PS18-2的氫譜1H NMR（500 MHz，CD3OD）的化學(xué)位移（δ）為3.50（dd，J = 4.6，11.8，1H，H-2）， 1.30（m，Hax-3）， 1.83（m，1Heq，H-3）， 2.06（dddd，1H，12.4，12.4，3.5，3.4，H-4），1.47（dddd，17.5，14.8，14.8，3.5，Hax-5），1.75（m，Heq-5），1.25（m，1Hax，H-6），1.63（m，1Heq，H-6），1.15（s，3H，H-7），4.71（bs，1H，H-9），4.69（bs，1H，H-9），1.72（s，3H，H-10），該數(shù)據(jù)與化合物1的氫譜數(shù)據(jù)一致［23］.

綜上，PS18-2歸屬為（1S，2R，4R）-檸檬烯-1，2-二醇.PS18-2與化合物1的碳譜圖和氫譜圖，如圖5所示.

由圖3，4，5可知：Rf較高的斑點(diǎn)為（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇，Rf較低的斑點(diǎn)為（1S，2R，4R）-檸檬烯-1，2-二醇.文獻(xiàn)［25］報(bào)道檸檬烯轉(zhuǎn)化為檸檬烯-1，2-二醇時(shí)，需要通過FAD結(jié)合單加氧酶（FAD-binding monooxygenase）生成檸檬烯環(huán)氧化物（limonene-1，2-epoxide），再通過環(huán)氧化物水解酶（epoxide hydrolase）生成檸檬烯-1，2-二醇.通過比較7株植物內(nèi)生真菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，可得以下2個(gè)結(jié)論.1） 來源于不同種屬植物內(nèi)生真菌的環(huán)氧化物水解酶存在差異，如D. amygdali PS08和A. Nees PS18，前者生成（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇，后者額外生成（1S，2R，4R）-檸檬烯-1，2-二醇，與文獻(xiàn)［26］報(bào)道的氯過氧化物酶轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯生成檸檬烯-1，2-二醇類似，該酶在氯離子存在下生成2種手性產(chǎn)物.2） 即使是來源于同一種屬植物內(nèi)生真菌的環(huán)氧化物水解酶也可能存在差異，如A. Nees PS01與A. Nees PS06生成（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇，而A. Nees PS07，A. Nees PS09和A. Nees PS18則額外生成（1S，2R，4R）-檸檬烯-1，2-二醇.因此，該轉(zhuǎn)化機(jī)制可能需要進(jìn)一步完善.

3.4 產(chǎn)物的測量

檸檬烯-1，2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示.圖6中：S為峰面積；ρ為檸檬烯-1，2-二醇的質(zhì)量濃度.

由圖6可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為S=129 971.734 13ρ-15 963.437 46，R2=0.993.

依此標(biāo)準(zhǔn)曲線，各菌株產(chǎn)（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇的質(zhì)量濃度，如圖7所示.

由圖7可知：各菌株產(chǎn)（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇的質(zhì)量濃度為0.36～2.46 g·L-1.其中，菌株P(guān)S08產(chǎn)量最高，達(dá)到（2.46±0.16） g·L-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)［14］吻合.

4 結(jié)束語

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇（檸檬甘油）屬于一種比較重要的檸檬烯含氧衍生物.研究表明，該化合物具有抗癌［27-29］和抗炎活性［28］，也可作為合成其他生物活性物質(zhì)前體［30-32］.由于該化合物存在4種立體構(gòu)型［24］，手性不同的純萜類對(duì)映體其藥理活性（抗微生物活性、毒性或氣味特性）存在差異［33］，如（1S，2R，4R）-檸檬烯-1，2-二醇和（1S，2S，4R）-檸檬烯-1，2-二醇對(duì)新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）的最小抑制濃度分別為184，1 470 μmol·L-1［23］.因此，4種構(gòu)型的化合物生物活性數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步挖掘.

采用假臭草來源植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯，轉(zhuǎn)化單一且產(chǎn)量達(dá)克級(jí)，轉(zhuǎn)化效果較理想.

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（責(zé)任編輯： 錢筠 ??英文審校： 劉源崗）

收稿日期： 2023-02-03

通信作者： 楊道茂（1975-），男，講師，博士，主要從事微生物生物轉(zhuǎn)化的研究.E-mail：ydmao@hqu.edu.cn.

基金項(xiàng)目： 國家級(jí)大學(xué)生科創(chuàng)項(xiàng)目（202110385039）； 福建省個(gè)人和團(tuán)隊(duì)科技員項(xiàng)目（2022年度）； 華僑大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)資金資助項(xiàng)目（Z15X0004）

http：∥www.hdxb.hqu.edu.cn