郭小江 熊 力 譚元成 楊紅文 楊齊心 楊 酸 向 進(jìn) 張依裕*

（1 貴州省草地技術(shù)試驗(yàn)推廣站，貴州貴陽 550000； 2 貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550000； 3 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025； 4 貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州貴陽 550000）

繁殖力的高低決定了養(yǎng)豬生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)回報(bào)。因此，母豬的繁殖力一直都是育種學(xué)家和養(yǎng)殖業(yè)主最為重視的目標(biāo)性狀。但由于繁殖力是一個(gè)低遺傳力性狀，受環(huán)境影響較大，通過常規(guī)的手段難以提升其繁殖指標(biāo)，將分子育種手段應(yīng)用于豬的繁殖性狀選擇是提高繁殖的重要手段[1]。現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，促性腺激素釋放激素（GnRH）和下丘腦激活的分泌對垂體和卵巢功能的發(fā)揮起至關(guān)重要的作用，下丘腦障礙可能引起卵巢靜止，下丘腦－垂體－卵巢軸協(xié)調(diào)調(diào)控性器官的發(fā)育和配子的形成，下丘腦、垂體、卵巢中基因的表達(dá)水平呈時(shí)序性變化，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育、卵泡成熟及其排卵等生殖活動[2,3]。速激肽3（TAC3）基因編碼速激肽家族中的神經(jīng)激肽B（NKB），在下丘腦弓狀核高表達(dá)，分沁NKB 的神經(jīng)元主要位于下丘腦漏斗區(qū)域和下丘腦前部，同時(shí)，在外周組織如胎盤、卵巢等中表達(dá)也相當(dāng)豐富。母豬初情期的啟動取決于NKB 通過與神經(jīng)激肽B 受體3（NK3R）結(jié)合誘導(dǎo)GnRH 釋放[4,5]。Topaloglu 等[6]報(bào)道，突變TAC3 或其受體TACR3 基因的突變會引起GnRH分泌減少，導(dǎo)致人促性腺激素綜合征發(fā)生。García-Ortega 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，NKB/NK3R 系統(tǒng)在人顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞中的表達(dá)水平隨細(xì)胞分化程度而發(fā)生變化，直接調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞的功能。因此，TAC3 基因可能參與哺乳動物繁殖相關(guān)的生命活動如初情期啟動、卵巢卵泡的成熟等?？聵坟i繁殖力低，提高其繁殖力是當(dāng)前的主要育種工作。本研究通過鑒定柯樂豬TAC3 基因的多態(tài)性，并分析其多態(tài)性對繁殖指標(biāo)的影響，探索其作為繁殖性狀選擇的分子標(biāo)記的可行性，以推進(jìn)柯樂豬的育種工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

健康狀態(tài)良好的初產(chǎn)柯樂豬母豬78 頭，來源于貴州優(yōu)農(nóng)谷發(fā)展有限公司。

1.2 樣品采集和數(shù)據(jù)收集

清潔消毒的耳號鉗采集柯樂豬的耳組織，每頭采集后，火燒冷卻后采集第2 頭，重復(fù)操作，保障每頭樣品不產(chǎn)生混樣，采集后的樣品于-80℃冰箱保存。測定每頭柯樂豬的5 個(gè)繁殖指標(biāo)，包括總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生個(gè)體重、斷奶仔豬數(shù)和斷奶個(gè)體重。

1.3 基因組DNA 提取

根據(jù)組織的基因組DNA 提取試劑盒的操作說明，分別提取柯樂豬母豬每個(gè)個(gè)體的基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢測DNA 完整性和濃度，對DNA 濃度進(jìn)行稀釋，終濃度為150 ng/μL。

1.4 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 收錄的TAC3 基因（NC_010447.5）序列，Oligo 6.0 設(shè)計(jì)1 對引物擴(kuò)增其第1 內(nèi)含子，正向引物：5’-GGGATTGGTGATTCTCAGTC-3’，反向引物：5’-CACATATTTCCCCAGGATGT-3’，擴(kuò)增區(qū)域：g.22328450-22329041，包含第1 外顯子和部分內(nèi)含子，PCR 擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，DNA 模板1.5 μL，上下游引物各1.5 μl，RNase-Free Water 10.5 μL，共25 μL 體系。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性12 min；95℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸80 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR 產(chǎn)物并拍照，PCR產(chǎn)物送北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用DNA Star 軟件中Editseq 和MegAlign 程序及人工校對鑒定SNP 位點(diǎn)，Haploview 軟件計(jì)算SNP 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率以及多態(tài)信息含量（PIC），卡方計(jì)算器對基因型分布卡方值（χ2）進(jìn)行計(jì)算，SPSS 18.0 軟件分析SNP 位點(diǎn)基因型與繁殖指標(biāo)效應(yīng)程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 TAC3 基因SNP 鑒定

采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測引物的PCR 產(chǎn)物，表明擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，無雜帶（圖1A）。對PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，在柯樂豬TAC3 基因第1 內(nèi)含子中檢測到1 個(gè)SNP 位點(diǎn)：g.22329038 T＞C，產(chǎn)生3 種基因型，分別為TT、TC 和CC。

圖1 TAC3 基因SNP 鑒定（A： PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物； B： SNP 鑒定峰圖）

2.2 TAC3 基因g.22329038 T＞C 位點(diǎn)的遺傳特性分析

通過分析TAC3 基因中g(shù).22329038 T＞C 位點(diǎn)在柯樂豬群體中的遺傳參數(shù)（見表1）。結(jié)果表明，TC 基因型是優(yōu)勢基因型，其頻率為0.436；T 是優(yōu)勢等位基因，其頻率為0.577；多態(tài)信息含量（PIC）為0.369，PIC 處于0.25～0.50 之間，其為中度多態(tài)位點(diǎn)，基因型χ2值為1.433，基因型分布未偏離Hardy-Weinberg 平衡（＞0.05）。

表1 TAC3 基因g.22329038 T＞C 位點(diǎn)的群體遺傳參數(shù)

2.3 TAC3 基因g.22329038 T＞C 位點(diǎn)對柯樂豬繁殖性狀的影響

由表2 可知，g.22329038 T＞C 位點(diǎn)TT 基因型個(gè)體在產(chǎn)活仔數(shù)上顯著高于CC 基因型（＜0.05），g.22329038 T＞C 位點(diǎn)的不同基因型對總產(chǎn)仔數(shù)、初生個(gè)體重、斷奶仔豬數(shù)和斷奶個(gè)體重的影響均沒有達(dá)到顯著的水平（＞0.05）。

表2 TAC3 基因g.22329038 T＞C 位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性

3 討論

現(xiàn)有的研究證實(shí)，TAC3 基因在豬下丘腦弓狀核高表達(dá)，其編碼的蛋白質(zhì)NKB 是一種神經(jīng)肽，對哺乳動物的生殖系統(tǒng)發(fā)育與成熟有重要調(diào)控作用。孫曉笛[8]研究表明，TAC3 基因在小尾寒羊卵巢和子宮體中的表達(dá)量與常年發(fā)情有關(guān)。García-Ortega 等[7]報(bào)道了TAC3 基因編碼的蛋白質(zhì)NKB 和KISS1 基因編碼的蛋白Kisspeptin 在直接作用于人卵巢卵泡顆粒細(xì)胞，促進(jìn)卵泡成熟。蔣書東等[9]報(bào)道，母犬下丘腦、垂體和卵巢中TAC3 mRNA 表達(dá)量表現(xiàn)為從仔犬期至初情期逐漸上升，初情期達(dá)最高，揭示NKB 可能參與母犬初情期的啟動?；10]發(fā)現(xiàn)皖西白鵝就巢期和休產(chǎn)期各級卵泡顆粒層細(xì)胞、卵泡膜及間質(zhì)部位NKB 表達(dá)量顯著低于產(chǎn)蛋期。邢燕[11]研究表明母豬初情期啟動時(shí)下丘腦、垂體和卵巢中TAC3 mRNA 水平表達(dá)上調(diào)，到初情期后表達(dá)量逐漸減少。Wang 等[12]報(bào)道了TAC3 與香豬的繁殖性狀相關(guān)。另外，KISS1 編碼的蛋白質(zhì)Kisspeptin 與TAC3 編碼的蛋白質(zhì)NKB 協(xié)同調(diào)控下丘腦GnRH 的釋放，進(jìn)而促進(jìn)卵巢LH 分泌[13]。

至今，已有研究表明TAC3 基因的變異能影響人和哺乳動物的繁殖性能。Xin 等[14]對人的研究發(fā)現(xiàn)中國女孩TAC3 基因中存在9 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中A63P 突變與特發(fā)性性早熟相關(guān)。Tusset 等[15]研究也表明A63P 突變與特發(fā)性中樞性青春期障礙有關(guān)。但是關(guān)于豬TAC3 基因的遺傳變異對繁殖性狀的影響至今罕見報(bào)道。本研究在柯樂豬TAC3 第1 內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了g.22329038 T＞C 突變，且該突變對產(chǎn)活仔數(shù)的影響達(dá)顯著水平（＜0.05），TT 基因型為有利基因型。在真核生物中的基因組中，基因多處于斷裂狀態(tài)，各外顯子之間由內(nèi)含子所隔離，在轉(zhuǎn)錄過程中，內(nèi)含子會被剪切掉，但內(nèi)含子突變會調(diào)控轉(zhuǎn)錄而影響轉(zhuǎn)錄的效率已被大量的試驗(yàn)所證實(shí)，甚至于內(nèi)含子的突變可導(dǎo)致剪接失效，產(chǎn)生不同的基因剪接體并導(dǎo)致生產(chǎn)性能的改變[16]。多態(tài)信息含量（PIC）是決定育種進(jìn)展的一個(gè)重要指標(biāo)，低的PIC 制約選擇，反之則有利于選擇[17]。本研究結(jié)果揭示g.22329038 T＞C 位點(diǎn)可能是柯樂豬產(chǎn)活仔數(shù)的一個(gè)重要分子標(biāo)記。