楊廷旭,薛蕊芳

楊廷旭,薛蕊芳,酒泉市人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科 甘肅省酒泉市 735000

0 引言

結(jié)腸癌是臨床上常見的一種惡性腫瘤,我國結(jié)腸癌發(fā)病率與死亡率逐年上升,已嚴(yán)重威脅患者生命安全,隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步,分子靶向治療等成為結(jié)腸癌的主要治療手段,因而尋找結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因?qū)μ岣呓Y(jié)腸癌的治療效果具有重要意義[1,2].環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是不具有5’端帽子結(jié)構(gòu)與3’端多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子,其具有穩(wěn)定性、特異性等特點(diǎn),且它可靶向微小RNA(microRNA,miRNA/miR)調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能,與結(jié)腸癌進(jìn)展密切相關(guān)[3,4].有報道稱,circSHKBP1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并可通過調(diào)控miR-582-3p/HUR/VEGF表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5].然而,目前尚不明確circSHKBP1在結(jié)腸癌的作用.通過應(yīng)用 Starbase分析circSHKBP1同miR-125a-5p能夠通過結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合.相關(guān)的文獻(xiàn)證實了miR-125a-5p可減少結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[6].但尚不清楚circSHKBP1/miR-125a-5p分子軸對結(jié)腸癌的影響.本研究著重驗證是否circSHKBP1可以調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡通過靶向miR-125a-5p.

1 材料和方法

1.1 材料 收集本院2020-03/2020-07經(jīng)病理學(xué)確診的69例結(jié)腸癌患者的腫瘤及癌旁組織,術(shù)后標(biāo)本立即置于-80 ℃保存. 男39例,女30例,年齡(48-67)歲,平均年齡(53.21±4.16)歲.本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求,所有受試者均簽署知情同意書.本研究已征得本院倫理委員會批準(zhǔn).

人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞購自上海晶抗生物;于美國Gibco購置DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清;于美國Invitrogen購買Trizol試劑(cat.no.15596-018)、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(cat.no.11668-019);北京天根生化提供反轉(zhuǎn)錄(cat.no.KR107)與熒光定量PCR試劑盒(cat.no.KR123);于廣州銳博生物購買了sh-NC、sh-circSHKBP1、miR-NC、miR-125a-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-125a-5p;北京索萊寶提供了MTT試劑盒(cat.no.M1020)、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(cat.no.CA1040)與熒光素酶活性檢測試劑盒;于美國Promega購置雙熒光素酶報告基因載體;于美國CST和Abcam購置了兔抗人Bax、Bcl-2、GAPDH抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗.

1.2 方法

1.2.1 實驗分組: 接種于6孔板(1×105個/孔)中,待HT29細(xì)胞生長至80%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染.依據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將sh-NC、sh-circSHKBP1、miR-NC、miR-125a-5p mimics分別對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,記為sh-NC組、shcircSHKBP1組、miR-NC組、miR-125a-5p四組.此外,將sh-circSHKBP1分別與anti-miR-NC和anti-miR-125a-5p對細(xì)胞共轉(zhuǎn),標(biāo)記成sh-circSHKBP1+anti-miR-NC組和sh-circSHKBP1+anti-miR-125a-5p組.

1.2.2 qRT-PCR檢測circSHKBP1、miR-125a-5p的表達(dá)水平: 依據(jù)Trizol試劑,總RNA來自組織和細(xì)胞被提取并測定其濃度使用紫外分光光度計.通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,引物序列:circSHKBP1上游5’-CTTGTCAGCGAGCTCTATCG-3’,下游5’-GTAAATGGAGCCGTTGTTGC-3’;miR-125a-5p上游5’-TCGGCAGGTCCCTGAGACCCTT-3’,下游5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;U6上游5’-TCCGACGCCGCCATCTCTA-3’,下游5’-TATCGCACATTAAGCCTCTA-3’;β-actin上游5’-GGCCCAGAATGCAGTTCGCCTT-3’,下游5’-AATGGCACCCTGCTCACGCA-3’.反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2min,95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共40個循環(huán).通過羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀,circSHKBP1、miR-125a-5p相對表達(dá)量被評估.

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖: 取對數(shù)生長期HT29細(xì)胞接種于96孔板(2×103個/孔)后,將20 μL MTT試劑添加到每孔繼續(xù)常溫培養(yǎng)4 h,棄上清,將150 μL DMSO加入避光振蕩.5 min后,酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光度值(A)并計算細(xì)胞增殖抑制率[(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%].

1.2.4 平板克隆形成實驗: 取500個HT29細(xì)胞于6孔板中,然后常溫培育至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán).預(yù)冷PBS洗滌后,細(xì)胞被500 μL甲醇固定20 min,然后400 μL 1%結(jié)晶紫染色15 min.最后,細(xì)胞克隆形成數(shù)被拍照和觀察.

1.2.5 細(xì)胞凋亡率檢測: 胰蛋白酶消化后,HT29細(xì)胞被收集,用預(yù)PBS洗滌.隨后,添加 500 μL結(jié)合緩沖液對細(xì)胞進(jìn)行重懸,然后再加入5 μL Annexin V-FITC室溫5 min.檢測前加入5 μL PI混勻并放置5 min,通過FACS Calibur流式細(xì)胞儀驗證細(xì)胞凋亡的情況.

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測circSHKBP1與miR-125a-5p的靶向關(guān)系: 首先熒光素酶報告基因載體包括:野生型載體wt-circSHKBP1和缺失miR-125a-5p結(jié)合區(qū)域的突變型載體mut-circSHKBP1被構(gòu)建.依據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,miR-NC或miR-125a-5p mimics分別與wt/mutcircSHKBP1共轉(zhuǎn)染入HT29細(xì)胞.培養(yǎng)24 h,取上清,檢測細(xì)胞熒光素酶活性.基于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,sh-NC、sh-circSHKBP1分別轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞,培養(yǎng)48 h,miR-125a-5p的表達(dá)量被qRT-PCR分析.

1.2.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量: 依據(jù)RIPA裂解液,各組被提取細(xì)胞總蛋白,隨后BCA法對蛋白濃度進(jìn)行統(tǒng)一定量.5×SDS上樣緩沖液被添加,沸水中煮10 min.每孔40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后室溫封閉,加入一抗Bax(1:1000)、Bcl-2(1:1000)與GAPDH抗體(1:2000),4 ℃孵育過夜.將膜浸泡在二抗稀釋液(1:3000),1 h后,曝光顯影,并分析條帶灰度值依據(jù)ImageJ軟件.

統(tǒng)計學(xué)處理符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)被SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析,并以(mean±SD)表示.獨(dú)立樣本t檢驗作兩組間比較,單因素方差分析作多組間比較,P<0.05表明具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌中circSHKBP1和miR-125a-5p表達(dá) 與癌旁組織比較,在結(jié)腸癌組織中circSHKBP1的表達(dá)量提高(P<0.05),miR-125a-5p的表達(dá)量降低(P<0.05),見圖1.

圖1 結(jié)腸癌中circSHKBP1和miR-125a-5p的表達(dá).A: 結(jié)腸癌中circSHKBP1高表達(dá);B: 結(jié)腸癌中miR-125a-5p低表達(dá)(69例).結(jié)腸癌組 vs 癌旁組,aP<0.05.

2.2 干擾circSHKBP1處理后轉(zhuǎn)染效率的檢測 與sh-NC組比較,sh-circSHKBP1組中circSHKBP1的表達(dá)量降低(P<0.05),見圖2.表明轉(zhuǎn)染效果良好并可用于后續(xù)實驗.

圖2 干擾circSHKBP1轉(zhuǎn)染效率的檢測.sh-circSHKBP1組 vs sh-NC組,aP<0.05.

2.3 干擾circSHKBP1對HT29細(xì)胞增殖、凋亡的影響與sh-NC組比較,沉默circSHKBP1可以提高細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和Bax表達(dá)水平(P<0.05),減少克隆形成數(shù)(P<0.05),降低Bcl-2表達(dá)水平(P<0.05),見圖3、表1.

圖3 干擾circSHKBP1對HT29細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.A: Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá);B: 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡.Bcl-2: B細(xì)胞淋巴瘤-2;Bax: Bcl-2相關(guān)X蛋白;GAPDH: 甘油醛3-磷酸脫氫酶;Annexin-V-FITC: 異硫氰酸熒光黃;PI碘化丙啶.

表1 干擾circSHKBP1對HT29細(xì)胞增殖、凋亡的檢測(mean±SD,n=9)

2.4 circSHKBP1靶向調(diào)控miR-125a-5p 正如圖4A所展示,circSHKBP1和miR-125a-5p存在結(jié)合位點(diǎn).我們的結(jié)果顯示miR-125a-5p過表達(dá)減少野生型載體wt-circSHKBP1熒光素酶活性(P<0.05),而對變型載體mutcircSHKBP1的熒光素酶活性無明顯影響,見圖4B.與sh-NC組比較,sh-circSHKBP1組中miR-125a-5p水平明顯升高(P<0.05),見圖4C.

圖4 circSHKBP1靶向調(diào)控miR-125a-5p. A: circSHKBP1含有miR-125a-5p的互補(bǔ)序列;B: 雙熒光素酶報告實驗;C: miR-125a-5p的表達(dá)被circSHKBP1調(diào)控.miR-NC組 vs miR-125a-5p組,aP<0.05;sh-circSHKBP1組 vs sh-NC組,bP<0.05.

2.5 miR-125a-5p影響HT29細(xì)胞增殖和凋亡 與miR-NC組對比,miR-125a-5p組可以提高細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和Bax表達(dá)水平(P<0.05),抑制克隆形成數(shù)(P<0.05),減少Bcl-2表達(dá)水平(P<0.05),見圖5、表2.

圖5 miR-125a-5p對HT29細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.A: Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá);B: 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡.Bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤-2;Bax: Bcl-2相關(guān)X蛋白;GAPDH: 甘油醛3-磷酸脫氫酶;Annexin-V-FITC: 異硫氰酸熒光黃;PI碘化丙啶.

表2 miR-125a-5p對HT29細(xì)胞增殖、凋亡的檢測(mean±SD,n=9)

2.6 抑制miR-125a-5p對干擾circSHKBP1處理的HT29細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與sh-circSHKBP1+anti-miR-NC組對比,sh-circSHKBP1+anti-miR-125a-5p組可以降低細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和Bax(P<0.05),增加克隆形成數(shù)(P<0.05),提升Bcl-2(P<0.05),見圖6、表3.

圖6 抑制miR-125a-5p對干擾circSHKBP1處理的HT29細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.A: Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá);B: 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡.Bcl-2: B細(xì)胞淋巴瘤-2;Bax: Bcl-2相關(guān)X蛋白;GAPDH: 甘油醛3-磷酸脫氫酶;Annexin-V-FITC: 異硫氰酸熒光黃;PI碘化丙啶.

表3 抑制miR-125a-5p對干擾circSHKBP1處理的HT29細(xì)胞增殖、凋亡的檢測(mean±SD,n=9)

3 討論

circRNA可通過miRNA表達(dá)而正向調(diào)控靶基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為,其表達(dá)異常與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),并可能作為結(jié)腸癌靶向治療的相關(guān)靶點(diǎn)[7,8].在結(jié)腸癌組織或細(xì)胞系中circRNA表達(dá)可以上調(diào)或下調(diào),circRNA表達(dá)上調(diào)時可作為癌基因而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展,而circRNA表達(dá)下調(diào)時可作為抑癌基因而抑制結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程[9,10].

circSHKBP1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)水平升高,并可通過調(diào)控miR-544a/FOXP1表達(dá)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管生成[11].然而,尚不清楚其在結(jié)腸癌中的表達(dá)及對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.本研究結(jié)果顯示,circSHKBP1是顯著增加的在結(jié)腸癌組織中,其沉默可以提高結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率,減少克隆形成數(shù),暗示結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及克隆形成可被干擾circSHKBP1抑制.信服的證據(jù)提示了失衡的細(xì)胞增殖與凋亡可加劇結(jié)腸癌進(jìn)展,其中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值降低增加凋亡[12,13].本研究結(jié)果顯示,沉默circSHKBP1表達(dá)可增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡能力,并可促進(jìn)Bax表達(dá)而抑制Bcl-2表達(dá),提示干擾circSHKBP1表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡.

本研究結(jié)果顯示,circSHKBP1被證實可以靶向負(fù)調(diào)控miR-125a-5p.miR-125a-5p過表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[14].miR-125a-5p表達(dá)上調(diào)可通過調(diào)控TAZ/EGFR信號通路而抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15].相關(guān)的研究證明miR-125a-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的抑制作用[16].本研究驗證,miR-125a-5p可加劇結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和減少增殖及克隆形成,而其抑制可緩解沉默circSHKBP1引發(fā)的增殖、克隆形成抑制和凋亡促進(jìn).表明circSHKBP1可促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展通過靶向miR-125a-5p.

4 結(jié)論

綜上所述,結(jié)腸癌組織中circSHKBP1表達(dá)上調(diào),miR-125a-5p表達(dá)下調(diào),干擾circSHKBP1可通過靶向下調(diào)miR-125a-5p表達(dá)調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡.這些發(fā)現(xiàn)意味著circSHKBP1/miR-125a-5p軸很有可能為結(jié)直腸癌的治療提供新的分子靶點(diǎn),但這些研究只僅限于體外的實驗.關(guān)于circSHKBP1在體內(nèi)是如何作用于結(jié)直腸癌以及相關(guān)的作用機(jī)制仍有待繼續(xù)研究.

文章亮點(diǎn)

實驗背景

CircSHKBP1可作為促癌基因參與癌癥進(jìn)展,因此我們假設(shè)circSHKBP1也參與結(jié)腸癌的發(fā)展.

實驗動機(jī)

本文擬研究circSHKBP1在結(jié)腸癌細(xì)胞生長中的作用,通過揭示一種新的調(diào)控途徑,為結(jié)腸癌的治療提供了新的見解及治療靶標(biāo).

實驗?zāi)繕?biāo)

結(jié)腸癌是臨床上常見的一種惡性腫瘤且在我國發(fā)病率與死亡率逐年上升.我們的目的是研究一個關(guān)鍵的circSHKBP1-miRNA通路在結(jié)腸癌中的作用.

實驗方法

采用MTT法、平板克隆形成、和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖及凋亡;采用雙熒光素酶報告實驗探索circSHKBP1-miRNA通路.

實驗結(jié)果

結(jié)腸癌組織中circSHKBP1高表達(dá)上調(diào),miR-125a-5p低表達(dá),敲除實驗證實敲低circSHKBP1可通過靶向調(diào)控miR-125a-5p表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,結(jié)果表明,致癌circSHKBP1通過競爭性結(jié)合miR-125a-5p來驅(qū)動癌癥進(jìn)展.

實驗結(jié)論

本次研究首次證實circSHKBP1在結(jié)腸癌中作為致癌基因,通過靶向抑制miR-125a-5p的表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞的生長.我們首次在結(jié)腸癌細(xì)胞中建立了circSHKBP1-miR-125a-5p通路,我們的研究結(jié)果表明circSHKBP1可能成為結(jié)腸癌的潛在治療靶點(diǎn),circSHKBP1特異性小干擾RNA可能是用于結(jié)腸癌臨床治療的有希望的分子.

展望前景

雖然在這項工作中發(fā)現(xiàn)了一些有趣的結(jié)果,但所提供的數(shù)據(jù)是基于有限數(shù)量的體外細(xì)胞.考慮到本研究的不足,未來需要進(jìn)行體內(nèi)實驗和收集更大數(shù)量的臨床標(biāo)本來驗證這些結(jié)論.