田 瑤，張佳營，鄭 露，李 鴻，張 鈺，涂 星，4*

(1.湖南科技職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，湖南 長沙 410118；2.湖北恩施學(xué)院，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；4.湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測中心，湖北 恩施 445000)

桔梗為桔?？浦参锝酃Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.]干燥根，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效[1]，其主要有效成分包括三萜皂苷類、黃酮類、酚類、甾醇類、多糖和聚炔類等，具有祛痰、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗肥胖、降血糖、降血脂、保肝、抗腫瘤等作用，臨床上常用于咳嗽痰多，胸悶不暢，咽痛音啞，肺擁吐膿等癥[2-3]。作為藥食兩用品種，桔梗市場需求量日益增加，在野生資源急劇減少的情況下，其人工栽培品已成為市場的主流產(chǎn)品。而栽培過程中田間除草、病蟲害防治過程中農(nóng)藥的使用不可避免，其殘留成為社會普遍關(guān)注的問題。中藥中農(nóng)藥多殘留檢測近年來獲得廣泛的關(guān)注，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其靈敏度高、專屬性強(qiáng)、定性定量同步進(jìn)行等特點(diǎn)逐漸用于農(nóng)藥殘留的檢測分析。QuEChERS法具有簡單快速、安全廉價(jià)等特點(diǎn)，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理[4-5]，QuEChERS法結(jié)合GC-MS/MS在中藥和食品等產(chǎn)品種農(nóng)藥殘留檢測的運(yùn)用日趨成熟[6-8]。目前，對桔梗進(jìn)行農(nóng)藥殘留測定的文獻(xiàn)較少，且報(bào)道的時(shí)間較為久遠(yuǎn)，如單獨(dú)對桔梗中的有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留[9]、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留[10]進(jìn)行測定，對有機(jī)磷、廣譜殺蟲劑、殺螨劑等6種農(nóng)藥殘留[11]進(jìn)行測定，采用不同的樣品處理方法、色譜條件分別測定桔梗中的有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留[12]等。文獻(xiàn)中涉及到的桔梗中農(nóng)藥殘留測定的種類較少、覆蓋面窄、測定過程復(fù)雜，難以滿足目前不斷提高的檢驗(yàn)檢測要求。本研究首次建立QuEChERS法結(jié)合GC-MS/MS測定24批次不同產(chǎn)地野生或栽培的桔梗中34種農(nóng)藥殘留量的方法，為桔梗的質(zhì)量控制提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備 8890-7000 D氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；VXMNAL渦旋振蕩器；HMV-50 A多管渦旋混合器；ME204萬分之一電子分析天平；HSC-20B水域氮吹儀；5810 R高速離心機(jī)；Milli-Q純水系統(tǒng)。

1.2 藥物與試劑 QuEChERS提取包(由無水硫酸鎂6 g，無水醋酸鈉1.5 g組成，批號60105-335-B)、分散固相萃取凈化管(由無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化碳黑90 mg組成，批號：60105-509-B)；54種禁用農(nóng)藥混合對照品(1.2 mL/瓶，批號：2102076)、殺蟲脒對照品溶液(1.2 mL/瓶，批號：2102078)；乙腈(LC-MS級，批號：32AA1437)；桔梗空白基質(zhì)樣品(約20 g/瓶)，其他試劑均為分析純。

24批桔梗樣品，經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部郜紅利教授檢定均為桔?？浦参锝酃Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.]干燥根或加工品，基本信息(表1)。

表1 桔梗樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密移取54種禁用農(nóng)藥混合對照品溶液(20～200 μg/mL)0.1 mL，殺蟲脒對照品溶液(100 μg/mL)40 μL，置于20 mL量瓶中，加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取磷酸三苯酯對照品適量，加乙腈溶解并定容至0.1 μg/mL，即得。

2.1.3 供試品溶液及空白基質(zhì)溶液的制備 參考中國藥典2020年版四部通則2341第五法藥材及飲片(植物類)中禁藥農(nóng)藥多殘留測定法中快速樣品處理(QuEChERS法)[13]，分別取24批次桔梗樣品和桔?？瞻谆|(zhì)樣品(過三號篩)3 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩(500次/min)5 min，加入QuEChERS提取包，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩(500次/min)3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心(4 000轉(zhuǎn)/min)5 min，取上清液9 mL，置預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩(500次/min)5 min使凈化完全，離心(4 000轉(zhuǎn)/min)5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得桔梗樣品溶液和桔?？瞻谆|(zhì)樣品溶液。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 DB-17 ms(50%苯基)-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純度氦氣。進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣，恒壓模式，柱前壓力為146 kPa，進(jìn)樣量1μL。升溫程序：初始溫度60℃，保持1 min，以30℃/min升至120℃，再以10℃/min升至160℃，再以2℃/min升至230℃，最后以15℃/min升溫至300℃，保持6 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，EI離子源，溫度250℃，碰撞氣為氬氣。接口溫度250℃，MRM質(zhì)譜監(jiān)測模式。農(nóng)藥混合對照品(34號峰為內(nèi)標(biāo)物磷酸三苯酯)總離子流圖(圖1)，桔?？瞻谆|(zhì)樣品圖(圖2)，各化合物具體離子對及CE值(表2)。

圖1 34種農(nóng)藥混合對照品MRM的總離子流圖(34號峰為內(nèi)標(biāo)物)

圖2 桔梗空白基質(zhì)樣品圖

表2 34種農(nóng)藥混合對照品質(zhì)量濃度及其內(nèi)標(biāo)的GC-MS/MS參考值

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限 取2.1.3項(xiàng)下桔?？瞻谆|(zhì)樣品溶液1.0 mL 6份，置氮吹儀上40℃水浴濃縮至約0.6 mL，分別加入混合對照品溶液10、20、50、100、150、20 μL，加乙腈稀釋并定容至1 mL，渦旋混勻，即得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按2.2項(xiàng)下分析條件進(jìn)行測試，經(jīng)選擇離子定量掃描，以相對響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以定量離子信噪比為10(S/N=10)確定方法定量限(LOQ)，結(jié)果(表3)。表3可見，34種農(nóng)藥在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r均>0.998)，其LOQ在0.000 3～0.600 0 mg/kg之間。

表3 桔梗中34種農(nóng)藥的線性及范圍、定量限、精密度、回收率考察結(jié)果

農(nóng)藥名稱線性方程相關(guān)系數(shù)r濃度范圍(ng/mL)LOQ(mg/kg)不同添加水平平均回收率及RSD(%)低水平中水平高水平回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)蠅毒磷Y=1.775 3X+0.023 20.998 94.990～99.80.090 068.958.7165.9113.4469.986.87

2.3.2 精密度和回收率 精密稱取桔?？瞻谆|(zhì)樣品3 g，分別添加75、150、300 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，每個(gè)水平平行制備6份，按所建立的方法測定，結(jié)果(表3)。由表3可見，在低、中、高3個(gè)水平下，34種農(nóng)藥的回收率均在60%～130%范圍內(nèi)，RSD均≤15%。

2.4 桔梗樣品中農(nóng)藥殘留量測定 按2.1.3項(xiàng)下平行制備24批次桔梗樣品供試品溶液3份，按照2.2項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣，結(jié)果取平均值，結(jié)果(表4)。由表可見，從24批桔梗樣品中，有18批次樣品檢出農(nóng)藥殘留，檢出率為75%；其中共10批次栽培桔梗和6批次桔梗飲片全部檢出農(nóng)藥殘留，檢出率為100%；8批次野生桔梗樣品中，有2批次檢出農(nóng)藥殘留，檢出率為25%。共檢出農(nóng)藥5種(對硫磷、甲基異柳磷、治螟磷、三氯殺螨醇和氟蟲腈)，檢出率分別為70.8%、54.2%、29.2%、50%、12.5%，其含量均在0.001～0.015 mg/kg之間，低于藥典規(guī)定的0.02 mg/kg的限度，所檢樣品合格率為100%；其余農(nóng)藥未檢出。

表4 24批次桔梗樣品中34種農(nóng)藥殘留檢出結(jié)果(mg/kg)

3 討論

中藥的農(nóng)藥殘留量分析屬于痕量分析，其農(nóng)藥殘留量低、干擾物如色素、揮發(fā)油等含量較高，使得GC-MS/MS在其檢測中的運(yùn)用受到一定的限制[14]。本研究采用中國藥典收錄的QuEChERS法優(yōu)化了樣品的前處理方法，以乙腈作為提取溶劑，渦旋振蕩為提取方法，采用分散固相萃取凈化，減少了干擾物質(zhì)，并較好地保留了目標(biāo)化合物。本研究所建立的桔梗中34種農(nóng)藥殘留分析方法線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均>0.998，回收率均在60%～130%范圍內(nèi)，RSD均≤15%，表明該方法可用于桔梗中34種農(nóng)藥殘留物的定性定量分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，桔梗藥材及飲片中對硫磷、甲基異柳磷、治螟磷、三氯殺螨醇和氟蟲腈殘留量均在0.001～0.015 mg/kg之間，均低于藥典規(guī)定的0.02 mg/kg的限度，所檢樣品合格率為100%；但這4種農(nóng)藥檢出率較高，分別為70.8%、54.2%、29.2%、50%、12.5%，其安全性不容忽視。桔梗在種植過程中，農(nóng)藥使用主要在田間除草、調(diào)節(jié)生長和病蟲害防治方面，而其主要病蟲害包括根腐病、銹病、蚜蟲、地老虎、蠐螬、螻蛄、螟蟲、紅蜘蛛等[15-16]，對硫磷、甲基異柳磷、氟蟲腈和治螟磷是防治病蟲害的常用農(nóng)藥。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，藥材中檢出三氯殺螨醇僅占30%，而飲片中100%檢出，提示桔梗的農(nóng)藥污染可能不僅來源于種植環(huán)節(jié)，也可能來源于加工、貯藏和運(yùn)輸過程。

中藥在國際貿(mào)易中受到農(nóng)藥殘留、重金屬及某些技術(shù)壁壘的影響，嚴(yán)重地影響了其出口創(chuàng)匯和國際口碑，從源頭上做好管控，減少禁用農(nóng)藥的使用是當(dāng)務(wù)之急。從本研究來看，禁用農(nóng)藥對硫磷、甲基異柳磷、治螟磷、三氯殺螨醇等仍然在全國多省份地區(qū)使用，應(yīng)當(dāng)對其禁用農(nóng)藥來源進(jìn)行追查，切實(shí)保障中藥材質(zhì)量安全。