趙 晶，孫鳳蘭，王 紅，付曉慶，劉瑋瑋

（德州市婦幼保健院特檢科 山東 德州 253011）

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxie-ischemic encephalopathy，HIE）是指新生兒在圍產(chǎn)期因窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損傷，其極易引起新生兒出現(xiàn)各類腦損傷后遺癥，嚴(yán)重的可危及生命[1]。因此，對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病的臨床早期診斷和及時(shí)干預(yù)治療尤為重要。普通的超聲檢測(cè)雖然已經(jīng)廣泛用于新生兒顱腦損傷的診斷，但因其技術(shù)局限性，導(dǎo)致靈敏度較低，需要極具經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師才能準(zhǔn)確判斷。有研究表明聲輻射力脈沖彈性成像技術(shù)（ARFI）在組織硬度檢測(cè)中具有較高的靈敏度，因此在顱腦損傷的早期精確診斷應(yīng)用中具有巨大潛力[2-3]。盡管如此，基于安全性考慮，當(dāng)前關(guān)于顱腦損傷的相關(guān)研究主要集中于各類動(dòng)物模型[4-5]。因此，本研究首先通過(guò)孕鼠子宮體動(dòng)脈結(jié)扎的方法構(gòu)建大鼠缺氧缺血性腦病模型，隨后分別利用多普勒超聲檢測(cè)模型鼠大腦的MCA血流參數(shù)和利用ARFI彈性成像技術(shù)檢測(cè)新生大鼠模型的腦組織硬度。兩種超聲檢測(cè)方法得到的數(shù)據(jù)分別與模型鼠腦組織的病理染色、神經(jīng)細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)以及凋亡相關(guān)蛋白的WB結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)ARFI彈性成像應(yīng)用于缺氧缺血性腦損傷檢測(cè)的可行性進(jìn)行深入研究，為今后該技術(shù)應(yīng)用于臨床提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的30只孕晚期Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。參考顏淑芹等[5]的造模方法，將所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象無(wú)麻醉仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，手術(shù)暴露子宮后用止血鉗將雙側(cè)子宮角及子宮體動(dòng)脈結(jié)扎。根據(jù)結(jié)扎時(shí)間不同分為對(duì)照組、10分鐘組、20分鐘組三組，每組10只。其中，對(duì)照組僅暴露子宮而不結(jié)扎，隨后縫合傷口，繼續(xù)飼養(yǎng)，自然分娩。模型組結(jié)扎完成后，剖宮產(chǎn)取出胎鼠，使其盡快恢復(fù)自主呼吸，交給代乳媽媽鼠喂養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得德州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)YXLL-202004）。

1.2 方法

超聲檢查使用含內(nèi)置ARFI技術(shù)的Simens公司的ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀。探頭9L4，頻率（7 ～9）MHz。熒光顯微鏡使用日本奧林巴斯CKX53熒光顯微鏡。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)使用美國(guó)伯樂(lè)公司的Mini-PROTEAN? Tetra電泳槽以及ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

三個(gè)實(shí)驗(yàn)組存活的模型幼鼠分別于出生后6天、8天、10天、12天進(jìn)行超聲檢查。將幼鼠頭顱固定在檢查臺(tái)上，探頭置于其頭部頂骨中線，先應(yīng)用多普勒彩超和脈沖多普勒測(cè)定雙側(cè)大腦中的收縮期最大血流速度（Vs）、舒張期末最大血流速度（Vd）以及阻力指數(shù)（RI）。隨后使用ARFI彈性成像技術(shù)測(cè)量腦實(shí)質(zhì)的聲觸診量化（VTQ）值。所有測(cè)量值連續(xù)測(cè)定3次取平均值作為最終結(jié)果。

1.3 動(dòng)物模型病理學(xué)檢測(cè)

在所有超聲檢查結(jié)束后，對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的所有模型幼鼠進(jìn)行病理檢測(cè)。具體方法：首先，將實(shí)驗(yàn)對(duì)象麻醉后固定于解剖臺(tái)上，用PBS生理鹽水進(jìn)行心臟和大腦灌注。隨后，取完整一側(cè)大腦經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋等處理。另一側(cè)完整大腦冷凍于超低溫冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。大腦組織蠟塊在石蠟切片機(jī)上切片5 μm后行蘇木素-伊紅染色（HE染色），封片后顯微鏡觀察。

1.4 TUNEL組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)

大腦組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后20 μg/mL的蛋白酶K室溫處理20 min，PBS漂洗三次徹底去除殘留的蛋白酶K。按照TUNEL試劑盒（碧云天）說(shuō)明書(shū)的要求配制熒光標(biāo)記反應(yīng)液，37°避光孵育樣本60 min后洗去反應(yīng)液，DAPI復(fù)染后封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間采用方差分析（ANOVA），以秩和檢驗(yàn)分析非正態(tài)分布的資料。各指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的Vs值

子宮動(dòng)脈結(jié)扎20分鐘和10分鐘組出生的幼鼠模型大腦Vs值在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均低于對(duì)照組（P＜0.05），但隨著生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)并未出現(xiàn)進(jìn)一步的降低。結(jié)扎20分鐘組與10分鐘組在各時(shí)間點(diǎn)的Vs值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦Vs值測(cè)量結(jié)果（，cm/s）

表1 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦Vs值測(cè)量結(jié)果（，cm/s）

注：①表示與對(duì)照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組相比，P＞0.05。

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）6.86±0.62①②6.94±0.84①②10分鐘組（n=7）7.27±0.57①6.81±0.67①對(duì)照組（n=10）11.57±0.5511.14±0.89組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）6.41±0.64①②6.41±0.47①②10分鐘組（n=7）6.91±0.76①6.64±0.94①對(duì)照組（n=10）11.24±0.5911.04±0.86

2.2 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的Vd值

子宮動(dòng)脈結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組中大腦Vd值在幼鼠出生后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異；結(jié)扎20分鐘組與10分鐘組在各時(shí)間點(diǎn)的Vd值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦Vd值測(cè)量結(jié)果（，cm/s）

表2 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦Vd值測(cè)量結(jié)果（，cm/s）

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）4.95±0.4①②4.79±0.7①②10分鐘組（n=7）4.46±0.28①4.26±0.52①對(duì)照組（n=10）4.0±0.454.82±0.39

表2（續(xù)）

表2 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦Vd值測(cè)量結(jié)果（，cm/s）

注：①表示與對(duì)照組相比，P＞0.05；②表示與10分鐘組相比，P＞0.05。

組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）4.92±0.47①②4.12±0.46①②10分鐘組（n=7）4.41±0.41①4.01±0.75①對(duì)照組（n=10）4.16±0.264.18±0.58

2.3 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的RI值

子宮動(dòng)脈結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組中模型幼鼠大腦RI值在出生后6～12天各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均低于對(duì)照組（P＜0.05），但數(shù)值并未隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生明顯變化。結(jié)扎20分鐘組與10分鐘組在各時(shí)間點(diǎn)的RI值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦RI值測(cè)量結(jié)果（）

表3 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦RI值測(cè)量結(jié)果（）

注：①表示與對(duì)照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組相比，P＞0.05。

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）0.45±0.01①②0.39±0.02①②10分鐘組（n=7）0.42±0.02①0.45±0.04①對(duì)照組（n=10）0.57±0.030.59±0.03組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）0.35±0.04①②0.42±0.03①②10分鐘組（n=7）0.42±0.03①0.47±0.01①對(duì)照組（n=10）0.55±0.030.57±0.03

2.4 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的聲觸診量化（VTQ）值

子宮動(dòng)脈結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組中模型幼鼠大腦VTQ值在出生后6到12天各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均高于對(duì)照組（P＜0.05），但數(shù)值并未隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加而發(fā)生明顯變化。結(jié)扎20分鐘組在各時(shí)間點(diǎn)的VTQ值均顯著高于10分鐘組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表4。

表4 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦VTQ值測(cè)量結(jié)果（，m/s）

表4 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時(shí)間點(diǎn)大腦VTQ值測(cè)量結(jié)果（，m/s）

注：①表示與對(duì)照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組比較，P＜0.05。

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）1.86±0.17①②1.80±.0.11①②10分鐘組（n=7）1.34±0.07①1.39±0.10①對(duì)照組（n=10）0.83±0.090.86±0.09組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）1.85±0.14①②1.85±0.18①②10分鐘組（n=7）144±0.13①1.43±0.11①對(duì)照組（n=10）0.96±0.070.86±0.07

2.5 各實(shí)驗(yàn)組模型大腦切片HE染色觀察結(jié)果

對(duì)照組中神經(jīng)細(xì)胞排列緊密、整齊，細(xì)胞形態(tài)正常。結(jié)扎10分鐘組和結(jié)扎20分鐘組中腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)很多大的空泡。結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

圖1 三組模型腦組織HE染色結(jié)果

2.6 TUNEL染色觀察各實(shí)驗(yàn)組模型大腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

結(jié)扎10分鐘組和結(jié)扎20分鐘組中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著少于對(duì)照組，而細(xì)胞凋亡率卻明顯高于對(duì)照組。結(jié)扎20分鐘組中的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著少于結(jié)扎10分鐘組，細(xì)胞凋亡率顯著上升。模型組中的一些神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)較正常神經(jīng)細(xì)胞核發(fā)生變型。結(jié)果詳見(jiàn)圖2、表5。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組腦組織TUNEL染色結(jié)果

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果（）

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果（）

注：①表示與對(duì)照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組相比，P＜0.05。

組別單視野細(xì)胞數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)凋亡率/%結(jié)扎10分鐘組95.28±7.16①45.43±4.37①45.61±4.54①結(jié)扎20分鐘組88.4±4.88①54.7±6.01①61.89±6.03①②對(duì)照組102.6±8.043.6±1.353.47±1.18

2.7 計(jì)算各參數(shù)之間的相關(guān)性系數(shù)

結(jié)果顯示只有VTQ值和細(xì)胞凋亡率成高相關(guān)性且有顯著差異（r=0.9974，P=0.046）。見(jiàn)表6。

表6 動(dòng)物模型大腦血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)、VTQ值與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

3 討論

新生兒大腦組織對(duì)能量和氧氣的需求非常旺盛，一旦發(fā)生缺氧缺血會(huì)極大影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能，造成腦損傷[1]。因此對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病的早期診斷和治療至關(guān)重要。目前對(duì)HIE的臨床診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，其包括磁共振成像（MRI）和超聲檢查[6-8]。MRI是鑒別HIE特異性和敏感性最高的檢查方式[9]。然而，不能進(jìn)行床旁操作，費(fèi)用昂貴且通常需要鎮(zhèn)靜麻醉限制了其在新生兒顱腦損傷檢查中的應(yīng)用。因此，越來(lái)越多的臨床醫(yī)生開(kāi)始首選超聲這種可以在床邊進(jìn)行的低成本、無(wú)輻射損害的檢查方式來(lái)診斷新生兒腦損傷[10]。彩色多普勒超聲可以測(cè)量出新生兒顱腦中的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，而這些參數(shù)的改變與HIE的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。隨著超聲技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，超聲檢查的敏感度也在逐步提高，其中超聲彈性成像技術(shù)就是一種很有潛力并且非常適合檢測(cè)腦損傷的超聲成像技術(shù)[2-3]。

彈性成像是一種用來(lái)確定組織硬度的方法，相較于傳統(tǒng)的灰度超聲，其產(chǎn)生定量或半定量的測(cè)量組織形態(tài)，可以顯著提高診斷和預(yù)后的敏感性。彈性成像還可以用來(lái)檢測(cè)那些僅通過(guò)MRI或普通超聲無(wú)法定量地觀察這些病變的進(jìn)展和演變，深化人們對(duì)新生兒腦損傷的認(rèn)識(shí)[13]。ARFI彈性成像是一種新興的彈性成像技術(shù)，其包括聲觸診成像（virtual touch tissue imaging，VTI）和聲觸診組織定量（virtual touch tissue quantification，VTQ），并已經(jīng)應(yīng)用于顱腦超聲檢查[14]。盡管如此，國(guó)內(nèi)關(guān)于ARFI彈性成像技術(shù)應(yīng)用于新生兒腦損傷檢查的研究較少。因此，本研究利用彩色多普勒超聲技術(shù)結(jié)合ARFI彈性成像檢測(cè)缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型中測(cè)量值的變化，以期有新的發(fā)現(xiàn)。

制作大鼠缺氧缺血性腦損傷模型技術(shù)已經(jīng)得到多方面的研究，其中應(yīng)用較多的方法是將出生一周的幼鼠通過(guò)手術(shù)結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈后低氧處理而成[15]。然而，人類缺氧缺血性腦病的發(fā)生是妊娠期間或分娩過(guò)程中缺氧導(dǎo)致的。為了更接近于真實(shí)的情況，本實(shí)驗(yàn)采用了結(jié)扎孕晚期大鼠雙側(cè)子宮動(dòng)脈的方法制作動(dòng)物模型。為了保證模型組新生乳鼠成活率，將模型組分為結(jié)扎時(shí)間10分鐘組和20分鐘組，分別進(jìn)行觀察和研究。通過(guò)不斷摸索，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了子宮動(dòng)脈結(jié)扎誘發(fā)的新生缺氧缺血大鼠模型，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了顱腦超聲評(píng)價(jià)以及病理檢測(cè)、Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，子宮動(dòng)脈結(jié)扎20分鐘和10分鐘組的新生大鼠，在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)其大腦血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vd值變化不明顯，而Vs和RI值較對(duì)照組均發(fā)生顯著變化。盡管如此，結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組之間的Vs和RI值在各時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到明顯差異，這說(shuō)明缺氧缺血性腦損傷形成后很難自行修復(fù)。利用ARFI技術(shù)檢測(cè)的腦實(shí)質(zhì)VTQ值隨著子宮動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高，而且兩個(gè)不同時(shí)間組之間也存在明顯差異。HE染色結(jié)果表明，子宮動(dòng)脈結(jié)扎后，新生大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞間出現(xiàn)很多空泡。而TUNEL染色也從單個(gè)細(xì)胞層面揭示了對(duì)照組、結(jié)扎10分鐘、結(jié)扎20分鐘組之間，活的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量遞減而細(xì)胞凋亡率遞增。王超等[16]的研究也得到了類似的結(jié)果。那么，大腦血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和VTQ值分別與神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平的相關(guān)性如何呢？通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，ARFI彈性成像的VTQ值與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性比彩色多普勒超聲檢測(cè)血流參數(shù)更強(qiáng)，且具有顯著相關(guān)性。這也說(shuō)明ARFI彈性成像更能反映模型鼠大腦的缺氧缺血性腦損傷的真實(shí)情況，靈敏度更高。因此，ARFI彈性成像檢測(cè)新生大鼠腦組織彈性變化值對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的早期診斷和損傷程度分級(jí)的評(píng)價(jià)可能具有重要的參考價(jià)值。盡管如此，由于本項(xiàng)目得到的動(dòng)物模型數(shù)量還不夠多，導(dǎo)致最終得到的數(shù)據(jù)還不夠完善，這也是今后的研究需要改進(jìn)的地方。

綜上所述，該項(xiàng)研究結(jié)果為今后ARFI彈性成像技術(shù)能在新生兒顱腦損傷臨床診斷領(lǐng)域的安全、廣泛應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。