吳雨琦,徐 超,楊紅福,劉家俊,吳琴燕, 譚小力,鄧淵鈺,陳懷谷,莊義慶

(1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212000; 2.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇句容212400; 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇南京210000)

由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是世界范圍內(nèi)對(duì)小麥最具破壞性的病害之一[1]。該病害主要發(fā)生在潮濕、半潮濕地區(qū),特別是氣候濕潤多雨的溫帶地區(qū)[2]。小麥感病后,不僅會(huì)造成嚴(yán)重減產(chǎn),而且影響其品質(zhì)和食用價(jià)值[3-4]。同時(shí),由赤霉病菌產(chǎn)生的真菌毒素,尤其是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素嚴(yán)重危害人畜健康[5]。2000-2018年,小麥赤霉病在中國的年平均發(fā)生面積約占小麥總種植面積的20%[6],在黃淮麥區(qū)、西北麥區(qū)和東北春麥區(qū)均有發(fā)生[7],對(duì)中國小麥的安全生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重威脅。

培育并種植抗病品種是防控小麥赤霉病最經(jīng)濟(jì)、有效且環(huán)保的措施。目前,國內(nèi)外已經(jīng)鑒定出一些高抗赤霉病的材料,如蘇麥3號(hào)以及地方品種望水白、白三月黃、黃方柱等[8-10]。國外品種如日本小麥Nyubai[11]、巴西小麥Frontana[12-13]以及國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)合成衍生品系SYNI[14]等都具有較好的赤霉病抗性。研究表明,小麥對(duì)赤霉病的抗性可分為五種類型,即:Type Ⅰ(抗侵染)、Type Ⅱ(抗擴(kuò)展)、Type Ⅲ(抗毒素積累)、Type Ⅳ(籽?？剐?和Type Ⅴ(耐病性或耐產(chǎn)量損失)[15-16]。近些年來,已經(jīng)定位到許多與赤霉病抗性相關(guān)的基因。其中,位于3BS染色體上的Fhb1是目前發(fā)現(xiàn)的最有效且穩(wěn)定的主效抗擴(kuò)展性基因[11, 17-20];Fhb2也是一個(gè)抗擴(kuò)展性基因,位于6BS染色體Xgwm133～Xgwm644區(qū)間內(nèi)[21];Fhb5是一個(gè)抗侵入性基因,位于5A染色體Xgwm304～Xgwm415區(qū)間內(nèi)[22],這些抗性基因的遺傳均較為穩(wěn)定。

本研究收集了江蘇省淮南和淮北麥區(qū)共計(jì)69份小麥品種(系),通過調(diào)查田間自然發(fā)病條件下赤霉病的發(fā)病情況以及籽粒中DON毒素積累情況,探究Fhb1、Fhb2和Fhb5基因在供試小麥品種(系)中的分布及其與病情指數(shù)和DON含量之間的相關(guān)性,以期為小麥赤霉病的防控以及赤霉病抗性品種(系)的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為江蘇省69份小麥品種(系),其中淮南麥區(qū)30份,淮北麥區(qū)39份。以蘇麥3號(hào)(高抗赤霉病)、揚(yáng)麥158(中抗赤霉病)、淮麥20(中感赤霉病)和矮抗58(高感赤霉病)作為對(duì)照品種。各小麥品種(系)名稱詳見表1。

表1 自然發(fā)病條件下供試小麥品種(系)的病穗率、病情指數(shù)和DON含量

1.2 小麥赤霉病田間自然發(fā)病調(diào)查

試驗(yàn)在江蘇省鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。參照朱展望等[23]的方法,將每份品種(系)種植5行,行長1 m,行距0.25 m,每行播種100粒。于病情穩(wěn)定后(2021年5月15日)按0～4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有材料進(jìn)行病情調(diào)查,每個(gè)小區(qū)調(diào)查50穗,并按照《GB/T 15796-2011 小麥赤霉病測報(bào)技術(shù)規(guī)范》中的方法進(jìn)行赤霉病病穗率和病情指數(shù)計(jì)算。

病穗率=(發(fā)病穗數(shù)/調(diào)查總穗數(shù))×100%

病情指數(shù)=100× [∑(各級(jí)病穗數(shù)×相應(yīng)病級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總穗數(shù)×4)]

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí),全穗無病;1級(jí),病小穗數(shù)占全部小穗數(shù)的25%以下;2級(jí),病小穗數(shù)占全部小穗數(shù)的25%～50%;3級(jí),病小穗數(shù)占全部小穗數(shù)的50%～75%;4級(jí),病小穗數(shù)占全部小穗數(shù)的75%以上。

1.3 DON毒素含量的測定

將供試小麥品種(系)的麥穗手工脫粒后,用高速研磨粉碎機(jī)(YK-200B,青州市益康中藥機(jī)械配件廠)研磨至粉末狀,裝入自封袋中,室溫保存?zhèn)溆?。稱取0.5 g樣品粉末置于5 mL離心管中,加入2.5 mL去離子水,混勻后充分振蕩3 min,在室溫下4 000 r·min-1離心5 min。取上清液,用樣本稀釋液稀釋10、50、100倍后,備用。

用嘔吐毒素(DON)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(維賽,江蘇)檢測樣品中的DON毒素含量(最低檢測限為200 ppb)。在Multiskan FC型酶標(biāo)儀(賽默飛,美國)上按試劑盒說明書要求分別在450 nm處檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的吸光值。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。當(dāng)濾液中的DON毒素含量超過檢測范圍時(shí),更換其他倍數(shù)的稀釋液。

1.4 相關(guān)性分析

用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用SPSS 22.0對(duì)供試小麥品種(系)的病穗率、病情指數(shù)和DON毒素含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 基因組DNA提取及PCR檢測

將供試小麥品種(系)的種子置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱(光照16 h/黑暗8 h)中培養(yǎng)7 d后,每個(gè)品種(系)隨機(jī)挑選5株,用消過毒的剪刀小心剪下小麥葉片,置于2 mL離心管中。用植物基因組DNA提取試劑盒(索萊寶,北京)提取DNA,具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

用TaHRC-GSM-F/R引物[24]對(duì)Fhb1基因進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)體系為10 μL,包括PCR Mix 5 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1) 各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序用touchdown程序進(jìn)行[25]。用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,用DNA凝膠成像系統(tǒng)(JS-680D,上海培清科技有限公司)進(jìn)行觀察并拍照。

用連鎖標(biāo)記Gwm133和Gwm644[21]檢測Fhb2基因,用連鎖標(biāo)記Gwm304和Xhbg394[22]檢測Fhb5基因。PCR反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)程序利用三步法進(jìn)行[21-22]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,經(jīng)過銀染及顯影后進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥品種(系)的赤霉病抗性及籽粒中DON含量分析

從表1可以看出,供試小麥品種(系)均有不同程度的赤霉病發(fā)生,淮北麥區(qū)品種(系)的病害發(fā)生程度明顯高于淮南麥區(qū)品種(系)。

淮南麥區(qū)30個(gè)小麥品種(系)的病穗率平均值為14.88%,姜運(yùn)麥1624最高(30.43%),華麥1028最低(5.98%);病情指數(shù)平均值為2.75,姜運(yùn)麥1624最高(5.38),金揚(yáng)麥2067最低(0.93);籽粒DON含量平均值為4.65 μg·g-1,YC202002最高(5.88 μg·g-1),揚(yáng)大617最低(2.79 μg·g-1)。

淮北麥區(qū)39個(gè)小麥品種(系)的病穗率平均值為45.91%,富麥668最高(100%),佳麥203最低(18.57%);病情指數(shù)平均值為13.97,江麥166最高(48.54),農(nóng)麥158最低(3.43);籽粒DON含量平均值為10.10 μg·g-1,富麥668最高(11.50 μg·g-1),華麥118最低(6.51 μg·g-1)。

2.2 供試小麥品種(系)病穗率、病情指數(shù)和DON含量的相關(guān)性

對(duì)供試小麥品種(系)的病穗率、病情指數(shù)和籽粒DON含量間的相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)供試小麥品種(系)的籽粒DON含量與病穗率和病情指數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.705和0.573;病穗率與病情指數(shù)也呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.864。

2.3 供試小麥品種(系)抗性基因的鑒定結(jié)果

以蘇麥3號(hào)(高抗)、揚(yáng)麥158(中抗)、淮麥20(中感)和矮抗58(高感)為對(duì)照,利用Fhb1基因的功能標(biāo)記、Fhb2和Fhb5基因的連鎖標(biāo)記對(duì)69份小麥品種(系)進(jìn)行抗性基因鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅攜帶Fhb1的小麥品種(系)有6份(圖1和表2),均來自淮南麥區(qū),分別為揚(yáng)麥28、揚(yáng)輻麥9號(hào)、華麥8號(hào)、寧麥資119、鎮(zhèn)麥13和鹽麥20K50,占供試品種(系)的8.70%。僅攜帶Fhb2的小麥品種(系)有2份(圖2和表2),分別為鄭品麥27號(hào)和寧S19040,均來自淮北麥區(qū),占供試品種(系)的2.90%。僅攜帶Fhb5的小麥品種(系)有9份(圖3表2),分別為YC202002、揚(yáng)19006、揚(yáng)19124、揚(yáng)輻麥9246、鎮(zhèn)17015、姜運(yùn)麥1624、寧紅17121、中研麥238和農(nóng)麥330,占供試品種的13.04%,其中只有農(nóng)麥330來自淮北麥區(qū),其余8個(gè)品種(系)均來自淮南麥區(qū)。

M:DL2000;S:蘇麥3號(hào);Y:揚(yáng)輻麥158;H:淮麥20;AK:矮抗58;1:揚(yáng)麥28;2:蘇研麥017;3:揚(yáng)輻麥9號(hào);4:華麥8號(hào);5:寧麥資119;6:鎮(zhèn)麥13;7:練08;8:YC202002;9:揚(yáng)大617;10:鹽麥20K50;11:金揚(yáng)麥2067。

M:DL600;S:蘇麥3號(hào);Y:揚(yáng)輻麥158;H:淮麥20;AK:矮抗58;1:瑞華麥518;2:鄭品麥27號(hào);3:寧S19040;4:寧中0183;5:揚(yáng)大617。

M:DL600;S:蘇麥3號(hào);Y:揚(yáng)輻麥158;H:淮麥20;AK:矮抗58;1:YC202002;2:揚(yáng)大617;3:金揚(yáng)麥2067;4:揚(yáng)19006;5:揚(yáng)19124;6:揚(yáng)輻麥9246;7:鎮(zhèn)17015;8:農(nóng)麥208;9:姜運(yùn)麥1624;10:寧紅17121;11:練08;12:中研麥238;13:農(nóng)麥330。

表2 不同抗性基因類型小麥品種(系)的病情指數(shù)和DON含量

同時(shí)攜帶2個(gè)抗性基因(Fhb1+Fhb5)的小麥品種(系)有2份,分別為金揚(yáng)麥2067和練08;同時(shí)攜帶3個(gè)抗性基因(Fhb1+Fhb2+Fhb5)的小麥品種(系)僅有1份,為揚(yáng)大617,這3個(gè)品種(系)均來自淮南麥區(qū)。

2.4 淮南和淮北麥區(qū)攜帶不同抗性基因小麥品種(系)的病情指數(shù)和DON含量

從表2可以看出,淮南麥區(qū)品種(系)中,與不攜帶抗性基因的品種(系)相比,僅攜帶Fhb1以及攜帶Fhb1+Fhb5和Fhb1+Fhb2+Fhb5的品種(系)病情指數(shù)分別降低0.36、0.72和0.60,籽粒DON含量分別降低0.35、0.77和1.94 μg·g-1;僅攜帶Fhb5的品種(系)病情指數(shù)平均值和籽粒DON含量均有所升高;不存在僅攜帶Fhb2的品種(系)?；幢丙渽^(qū)品種(系)中,僅攜帶Fhb2和僅攜帶Fhb5的品種(系)的病情指數(shù)平均值分別為21.37和14.49,籽粒DON含量分別為10.31和11.24 μg·g-1,與不攜帶抗性基因的品種相比,均有所增加;不存在僅攜帶Fhb1的品種(系)?；茨消渽^(qū)僅攜帶Fhb5的品種(系)以及淮北麥區(qū)僅攜帶Fhb2或Fhb5的品種(系)病情指數(shù)和籽粒Don含量低于不攜帶抗性基因的品種(系),原因可能是僅攜帶這兩個(gè)基因的品種(系)數(shù)目太少,試驗(yàn)誤差所致。以上結(jié)果說明,淮南麥區(qū)大部分小麥品種(系)具有赤霉病抗性。

3 討論

本研究通過調(diào)查田間自然發(fā)病條件下淮南和淮北麥區(qū)不同小麥品種(系)對(duì)赤霉病的抗性以及籽粒中DON的積累情況,發(fā)現(xiàn)淮南麥區(qū)小麥品種(系)的病害發(fā)生程度明顯低于淮北麥區(qū)品種(系),且籽粒DON含量與病穗率及病情指數(shù)均呈極顯著正相關(guān),這與徐 飛等[26-27]的研究結(jié)果一致。但也有部分小麥品種(系)的病穗率較高,而籽粒中DON含量較低,如華麥118、中研麥611等,說明這些品種(系)可能具有抗毒素積累能力;還有一些品種表現(xiàn)出較高的病情指數(shù),而病穗率較低,如揚(yáng)19124等,說明這些品種具有抗侵染的能力,但不具有抗擴(kuò)展的能力。

研究表明,Fhb1和Fhb2基因具有抗擴(kuò)展性[21,24],Fhb5基因具有抗侵染性[22]。Xie等[28]將蘇麥3號(hào)中的Fhb1基因?qū)氚拇罄麃喰←溒贩N中,發(fā)現(xiàn)攜帶Fhb1的后代對(duì)赤霉病的抗性高于親本。Bernardo等[29]以蘇麥3號(hào)的衍生品系寧7840為抗源,將抗性基因Fhb1導(dǎo)入到美國硬冬小麥品種Clark中,發(fā)現(xiàn)后代中攜帶Fhb1的品系對(duì)赤霉病的抗性顯著提高,籽粒DON含量也明顯下降。本研究發(fā)現(xiàn),與不攜帶抗性基因的品種(系)相比,僅攜帶Fhb1的品種(系)的病情指數(shù)平均值和籽粒DON含量均較低,說明Fhb1基因能夠提高小麥品種(系)的赤霉病抗性。

與攜帶單個(gè)抗性基因的小麥品種(系)相比,攜帶多個(gè)抗性基因(Fhb1+Fhb5、Fhb1+Fhb2+Fhb5)的品種(系)的赤霉病病情指數(shù)和籽粒DON含量均較低,這與Brar等[30]的研究結(jié)果一致。由此可見,聚合多個(gè)抗性基因不僅能提高赤霉病抗性,還可降低籽粒DON含量。本研究篩選到一個(gè)同時(shí)攜帶3個(gè)抗性基因(Fhb1+Fhb2+Fhb5)的品種(揚(yáng)大617),該品種攜帶與蘇麥3號(hào)相同的抗性基因組合,其病穗率、病情指數(shù)和籽粒DON含量均較低,表明該品種可以作為赤霉病抗性育種的親本材料。

此外,我們還檢測到病穗率較高但DON含量較低的小麥品種(系)(如華麥118、中研麥611等),以及病穗率、病情指數(shù)和DON含量均較低的小麥品種(系)(如揚(yáng)輻麥6號(hào)、揚(yáng)麥27等),在這些材料中均未檢測到Fhb1、Fhb2或Fhb5抗性基因,初步推測這些品種(系)中可能攜帶其他抗性基因,需深入挖掘潛在的抗性位點(diǎn)。