陳相濤，陳芳芳，王 方，郇偉偉，李 潔，李小白

（1 杭州木木生物科技有限公司，浙江 311300）（2 杭州市臨安區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）（3 浙江農(nóng)林大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院）（4 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）

藍(lán)莓作為兼具營養(yǎng)和保健作用的美味水果，其富含酚類物質(zhì)如綠原酸，以及典型的黃酮類物質(zhì)如槲皮素、花青素、兒茶素、表兒茶素等[1-4]。這些物質(zhì)具有良好的抗氧化活性，具有預(yù)防黃斑變性、抗癌、防治阿爾茨海默病[5-7]、降低心臟病風(fēng)險[8-9]、降低膽固醇[10]等功效。因此，其深受百姓喜愛，被譽(yù)為“第三代水果”。藍(lán)莓屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium），目前栽培的藍(lán)莓主要由4 種藍(lán)莓雜交而成，分別為四倍體高叢藍(lán)莓、二倍體和四倍體矮叢藍(lán)莓、六倍體兔眼藍(lán)莓，以及來自多倍體雜交的五倍體和非整倍體藍(lán)莓[11-12]。高叢藍(lán)莓又可細(xì)分為兩大類，即北高叢藍(lán)莓和南高叢藍(lán)莓[12]。南高叢藍(lán)莓需冷量一般為200～400 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于北高叢藍(lán)莓800～1 200 h。目前，國內(nèi)主要栽培的藍(lán)莓品種主要是這兩大類。藍(lán)莓種植區(qū)域從美洲（主要是美國、加拿大和墨西哥）延伸至歐洲（主要是波蘭、西班牙、俄羅斯）、亞洲（主要是中國、日本）和澳大利亞，目前已經(jīng)擴(kuò)展至非洲（如贊比亞）。我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)雖然起步較晚，但近年來發(fā)展迅猛，種植面積逐年增加，全國藍(lán)莓栽培面積從2000 年的僅10 hm2發(fā)展到2020 年的6.64 萬hm2，一躍成為全球最大的藍(lán)莓種植地[13]。因此，近幾年國內(nèi)對藍(lán)莓種苗需求井噴式地暴發(fā)。

傳統(tǒng)藍(lán)莓種苗繁殖主要靠扦插以及傳統(tǒng)組培，但扦插的效率太低，而且有嚴(yán)格的季節(jié)限制，無法應(yīng)用于大規(guī)模種苗生產(chǎn)。傳統(tǒng)組培繁殖系數(shù)遠(yuǎn)高于扦插，而且一年四季皆可進(jìn)行操作，但其存在一定的缺陷，尤其是成苗后移栽成活率較低一直是最大的問題，而且培養(yǎng)基中的糖分很容易引起污染而造成損失。20 世紀(jì)80 年代末，日本學(xué)者提出了無糖組織培養(yǎng)技術(shù)即光自養(yǎng)組織培養(yǎng)技術(shù)[14]。其原理是以輸入二氧化碳?xì)怏w作為碳源，以此替代傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的糖，讓植物通過光合作用自身合成糖，使試管苗由兼養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型。強(qiáng)制通氣（即通過二氧化碳富集進(jìn)行氣體交換）使扦插植物的凈光合速率提高了30～40 倍[15]，使幼苗的存活率提高了35%[16]。此類組織培養(yǎng)可在很大程度上提高苗木質(zhì)量，具有壯苗、加速生長、移栽成活率高等優(yōu)點(diǎn)[14]。也可節(jié)省蔗糖，降低生產(chǎn)成本，降低組培苗污染率，提高馴化移栽苗的效率。目前，人們已經(jīng)對木本植物杜仲[17]和歐李[18]，以及草本植物紅掌[19]和滿天星[20]等的無糖組培配方進(jìn)行了研究和開發(fā)，包括不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度、不同培養(yǎng)液濃度等，但尚未有藍(lán)莓無糖組培研究的任何報道，亟須對該技術(shù)在藍(lán)莓中的幾個關(guān)鍵技術(shù)問題進(jìn)行探索。在藍(lán)莓的常規(guī)組培研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IBA、NAA 和ABT 等植物生長調(diào)節(jié)劑對植株的生根有重要作用[21]，在無糖組培的液體培養(yǎng)基中，這些植物生長調(diào)節(jié)劑也同樣需要重視。另外，由于無糖組培的特殊環(huán)境，固體基質(zhì)和營養(yǎng)液的配比（固液比）對植株生根也有重要影響。固液比過高，固體基質(zhì)更容易起到支撐作用，但影響植物的營養(yǎng)吸收；固液比過低，雖然植物更容易吸收營養(yǎng)，但固體基質(zhì)支撐作用會被減弱，且浪費(fèi)營養(yǎng)液而增加成本。雖然無糖組培去除了糖和有機(jī)質(zhì)而減少了污染率，但污染現(xiàn)象還是存在，通過抑菌劑可進(jìn)一步降低污染率。因此，筆者針對植物生長調(diào)節(jié)劑、固液比以及抑菌劑進(jìn)行探討，建立了一套實(shí)用的藍(lán)莓無糖組培方案，為藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為杭州木木生物科技有限公司前期生產(chǎn)的綠寶石藍(lán)莓常規(guī)組培苗，挑選培養(yǎng)60 d 并且生長健壯的藍(lán)莓苗進(jìn)行無糖培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1無糖基質(zhì)的準(zhǔn)備、接種和培養(yǎng)

以去除有機(jī)組分、糖和瓊脂的改良WPM 培養(yǎng)基（杭州木木生物科技有限公司）為基本營養(yǎng)液，以1～3 mm 的蛭石顆粒為固體培養(yǎng)基質(zhì)。配好的營養(yǎng)液與基質(zhì)按一定比例混合后，裝入培養(yǎng)容器內(nèi)，基質(zhì)厚度為3～4 cm。將配制好的培養(yǎng)基質(zhì)與容器一起高壓滅菌，滅菌條件為：121 ℃，30 min。在超凈工作臺上，將生長健壯的藍(lán)莓增殖苗去除頂部和基部之后，修剪成2～3 cm 的莖段，插入裝有上述基質(zhì)的無糖盒中，放入培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。暗培養(yǎng)3 d后，提供光照和二氧化碳。設(shè)定培養(yǎng)室內(nèi)的二氧化碳濃度為0.12%，光照強(qiáng)度為10 000 lx，光照時間為16 h/d，培養(yǎng)溫度保持在（25±2）℃。

1.2.2不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度對藍(lán)莓苗生根的影響

設(shè)計(jì)4 個不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度處理：T1，改良WPM＋0.1 mg/L IBA；T2，改良WPM＋0.5 mg/L IBA；T3，改良WPM＋1.0 mg/L IBA；T4，改良WPM＋1.0 mg/L NAA。固液比為1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養(yǎng)液，pH 值調(diào)至5.2 左右。每個處理制備5 個無糖盒，每個無糖盒接種300 株。分別在培養(yǎng)30 d 和60 d時，從每個無糖盒中隨機(jī)選取50 株，測量藍(lán)莓苗根系數(shù)量和長度，計(jì)算平均值，并統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.3不同固液比對藍(lán)莓苗生根的影響

為保證整個生長過程都有充足的水分，設(shè)計(jì)3個不同固液比處理：T5，1.8 L 蛭石＋1.1 L 營養(yǎng)液；T6，1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養(yǎng)液；T7，1.8 L 蛭石＋1.4 L 營養(yǎng)液。營養(yǎng)液為改良WPM＋1.0 mg/L IBA，pH值調(diào)至5.2 左右。每個處理制備5 個無糖盒，每個無糖盒接種300 株。分別在培養(yǎng)30 d 和60 d 時，從每個無糖盒中隨機(jī)選取50 株，測量藍(lán)莓苗根系數(shù)量和長度，計(jì)算平均值，并統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.4不同抑菌劑在無糖組培中的應(yīng)用

在營養(yǎng)液中分別添加4 種不同的抑菌劑：T8，1 g/L 多菌靈（四川國光農(nóng)化股份有限公司）；T9，2 g/L 山梨酸鉀（西安晉湘藥用輔料有限公司）；T10，25 mg/L 氯霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；T11，2 mL/L 植培凈（杭州木木生物科技有限公司）。營養(yǎng)液為改良WPM＋1.0 mg/L IBA，固液比為1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養(yǎng)液，pH 值調(diào)至5.2左右。每個處理制備8 個無糖盒，高溫高壓滅菌，滅菌條件為：121 ℃，30 min。經(jīng)過滅菌之后接種藍(lán)莓苗，接種后放入培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。每隔15 d 觀察污染情況，并記錄污染率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在植物生長調(diào)節(jié)劑和固液比的試驗(yàn)中，根系數(shù)量、根系長度和生根率的統(tǒng)計(jì)是不計(jì)污染個體的。采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用LSD 方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度對藍(lán)莓苗生根的影響

如表1 所示，T1、T2 處理的藍(lán)莓苗根系數(shù)量、根系長度和生根率均與T3、T4 處理存在顯著差異。在T1 處理培養(yǎng)30 d 的情況下，生根率為0；在培養(yǎng)60 d 的情況下，藍(lán)莓苗有生根表現(xiàn)，生根率為61.77%。隨著IBA 濃度的增加，T2、T3 處理的藍(lán)莓苗根系數(shù)量、根系長度和生根率相較于T1 處理均有顯著提高，T3 處理的這些性狀均顯著優(yōu)于T2處理。T3、T4 處理的藍(lán)莓苗根系數(shù)量、根系長度和生根率之間差異均不顯著。這些結(jié)果說明IBA 濃度增加能夠顯著改善藍(lán)莓苗的生根情況，在1.0 mg/L IBA 的情況下即可達(dá)到藍(lán)莓種苗的生產(chǎn)需求。2 種植物生長調(diào)節(jié)劑在1.0 mg/L 濃度下對藍(lán)莓苗生根的影響差異不大，對藍(lán)莓苗根系生長的促進(jìn)作用類似。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度對藍(lán)莓苗生根的影響

2.2 不同固液比對藍(lán)莓苗生根的影響

如表2 所示，3 個固液比處理的藍(lán)莓苗根系數(shù)量、根系長度和生根率之間均存在差異。在T5 處理培養(yǎng)30 d 的情況下，生根率為0；在培養(yǎng)60 d 的情況下，藍(lán)莓苗有生根表現(xiàn)，生根率為31.85%。T6處理的藍(lán)莓苗根系數(shù)量、根系長度和生根率均顯著高于T5 處理。T7 處理的藍(lán)莓苗根系數(shù)量、根系長度和生根率均顯著高于T5 處理；在T7 處理培養(yǎng)30 d 的情況下，藍(lán)莓苗的根系數(shù)量和生根率均顯著低于T6 處理；在培養(yǎng)60 d 的情況下，藍(lán)莓苗的根系數(shù)量、根系長度和生根率與T6 處理均無顯著差異。這些結(jié)果說明營養(yǎng)液比重的增加顯著改善了藍(lán)莓苗的根部性狀，但當(dāng)營養(yǎng)液過量時，藍(lán)莓苗生長中期（30 d）的生根率受到了影響。

表2 不同固液比對藍(lán)莓苗生根的影響

2.3 不同抑菌劑在藍(lán)莓無糖組培中的應(yīng)用

4 種抑菌劑對藍(lán)莓無糖組培苗的抑制污染效果如表3 所示。在培養(yǎng)15 d 時，4 種抑菌劑處理的藍(lán)莓苗均無污染產(chǎn)生。在培養(yǎng)30 d 時，T10 處理的藍(lán)莓苗污染率為10.53%，而其他處理的藍(lán)莓苗均未發(fā)現(xiàn)污染情況。在培養(yǎng)45 d 時，T8、T9 處理的藍(lán)莓苗也出現(xiàn)了污染情況，但T8、T9 處理的污染率均顯著低于T10 處理。在培養(yǎng)60 d 時，4 種抑菌劑處理的藍(lán)莓苗均出現(xiàn)了污染情況，且污染率存在顯著差異，抑菌效果表現(xiàn)為：T11 處理＞T9 處理≈T8處理＞T10 處理。T11 處理的抑菌效果最好，能夠有效降低污染率至13.65%（圖1）。

圖1 藍(lán)莓無糖組培苗和組培盒

表3 不同抑菌劑在藍(lán)莓無糖組培中的污染率 %

3 討論

3.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度對藍(lán)莓苗生根的影響

本研究結(jié)果顯示，藍(lán)莓無糖組培苗的根系數(shù)量和長度均隨植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的增加而增加，說明植物生長調(diào)節(jié)劑對于組培苗的生根起著關(guān)鍵作用。在改良WPM＋0.1 mg/L IBA 培養(yǎng)30 d 的情況下，藍(lán)莓苗基本不生根，但隨著培養(yǎng)時間的增加，即使在較低的IBA 濃度下，藍(lán)莓苗也開始生根。這可能與培養(yǎng)后期水分蒸發(fā)進(jìn)而提高了IBA 濃度有關(guān)。另外，對比2 種植物生長調(diào)節(jié)劑可以發(fā)現(xiàn)，IBA 和NAA在1.0 mg/L 濃度下，對藍(lán)莓苗根系生長的促進(jìn)作用差異較小，均取得了較好的生根效果。這與李子杰等[22]報道的常規(guī)組培生根培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑水平相當(dāng)（改良WPM＋1.0 mg/L IBA）。當(dāng)然也與許多常規(guī)生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑水平具有一定差異，例如肖海峻等[21]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓瓶內(nèi)最佳生根培養(yǎng)基（1/2 WPM＋2.0 mg/L IBA＋0.2%活性炭）中IBA 濃度達(dá)2.0 mg/L，而在程磊等[23]研究的最佳組培苗生根培養(yǎng)基（1/2 WPM＋20 g/L 蔗糖＋0.5 mg/L IBA＋10.0 g/L 活性炭）中，IBA 濃度只有0.5 mg/L，這可能是由于較高的糖為植株提供了充足的碳源，從而減少了其對植物生長調(diào)節(jié)劑刺激的依賴。植物生長調(diào)節(jié)劑水平低雖然不容易引起組培苗變異，但會嚴(yán)重拉長整個生長周期，造成生根效果較差、根系細(xì)弱，不利于種苗生產(chǎn)。本試驗(yàn)中，在改良WPM＋0.1 mg/L IBA 處理培養(yǎng)30 d 的情況下，藍(lán)莓苗基本不生根，而且培養(yǎng)后期根系也較弱。相反，植物生長調(diào)節(jié)劑水平過高則容易誘導(dǎo)形成愈傷組織和變異，也不利于種苗生產(chǎn)。因此，在本試驗(yàn)中植物生長調(diào)節(jié)劑水平控制在1.0 mg/L 以內(nèi)。文獻(xiàn)已經(jīng)報道IBA 和NAA 較IAA 的生根促進(jìn)作用更好，這是因?yàn)镮AA 易被氧化分解而失效，因此本試驗(yàn)使用IBA 和NAA 這2 種植物生長調(diào)節(jié)劑均取得了良好效果。

3.2 不同固液比對藍(lán)莓苗生根的影響

在無糖組培中固體基質(zhì)與營養(yǎng)液的比例是至關(guān)重要的，這直接影響植株與營養(yǎng)液的接觸[16]。固液比過高，雖然容易支撐植株，但會影響植物接觸營養(yǎng)液，從而造成其營養(yǎng)吸收困難；固液比過低，雖然植物更容易吸收營養(yǎng)，但固體基質(zhì)支撐作用會被減弱，浪費(fèi)營養(yǎng)液而增加成本，更為重要的是容易造成植物根系呼吸困難，導(dǎo)致爛根。本試驗(yàn)對3個不同固液比進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)1.8 L 蛭石＋1.1 L和1.25 L 營養(yǎng)液均對藍(lán)莓苗莖段的接種操作較為容易，但1.8 L 蛭石＋1.1 L 營養(yǎng)液的固液比過大，造成植株吸收營養(yǎng)困難，因此影響了其生根率。1.8 L蛭石＋1.4 L 營養(yǎng)液的固液比偏小，營養(yǎng)液偏多，不利于藍(lán)莓苗莖段的接種操作。因此，1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養(yǎng)液對藍(lán)莓無糖組培較為合適，在培養(yǎng)中期有利于生根，并且根系質(zhì)量最好，但在培養(yǎng)后期，由于水分蒸發(fā)，根系生長減緩，藍(lán)莓苗生長也開始停滯。而過多的營養(yǎng)液（1.4 L）在培養(yǎng)初期和中期均影響了根系的誘導(dǎo)和生長，還造成了一定的爛根和死苗；培養(yǎng)后期由于水分蒸發(fā)，營養(yǎng)液的量趨于合理水平，最終導(dǎo)致1.25 L 和1.4 L 營養(yǎng)液對藍(lán)莓苗根部性狀的影響趨同。因此，在利用1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養(yǎng)液的實(shí)踐操作中，培養(yǎng)后期可以適當(dāng)?shù)卦黾訝I養(yǎng)液來保證植株能夠吸收足夠的營養(yǎng)，以期得到更好的效果。

3.3 不同抑菌劑在藍(lán)莓無糖組培中的應(yīng)用

雖然無糖組培去除了最容易造成污染的糖分和有機(jī)組分，但由于無糖盒的面積較大，接種操作過程時間較長，另外接種的組培苗容易攜帶原組培瓶內(nèi)的有糖培養(yǎng)基，這些因素都有可能造成無糖組培中藍(lán)莓苗的污染。因此，需要添加有效的抑菌成分，才能確保植株的正常生長。多菌靈主要干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成從而影響細(xì)胞分裂，以此達(dá)到殺菌作用，其對多種真菌都有效果[24]。氯霉素屬廣譜抑菌劑，可作用于細(xì)菌核糖核蛋白體的50S 亞基，對革蘭陰性菌以及革蘭陽性菌都有比較強(qiáng)的抑菌作用，但對革蘭陰性菌的作用強(qiáng)于革蘭陽性菌[24]。山梨酸鉀的抑菌機(jī)理主要是與微生物酶系統(tǒng)的巰基結(jié)合從而破壞許多酶系統(tǒng)的作用，其可有效抑制霉菌、好氧性細(xì)菌以及酵母菌活性，還可以防止葡萄球菌、肉毒桿菌以及沙門氏菌等微生物的繁殖，不過對厭氧性芽孢菌還有嗜酸乳桿菌等微生物是無效的，抑制發(fā)育作用要強(qiáng)于其殺菌作用[25]。植培凈是一種長效、廣譜、高活性、新型組織培養(yǎng)專用、防菌落污染的抑制劑，其不殺菌，卻能夠抑制菌落在培養(yǎng)基上萌發(fā)成菌絲，能夠抑制孢子萌發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z的過程，可使孢子（菌落）一直停留這種形態(tài)不萌發(fā)，直到組培苗出瓶。本研究使用4 種抑菌劑，用量均按照說明書建議的工作濃度，即發(fā)揮作用的有效濃度，研究發(fā)現(xiàn)，在抑菌劑作用下，藍(lán)莓無糖組培苗的污染率較低，在培養(yǎng)15 d 時，藍(lán)莓苗的污染率為0；在培養(yǎng)15 d 以后才陸續(xù)有污染情況出現(xiàn)；效果最差的是氯霉素，其培養(yǎng)60 d 時的最終污染率在40%以上；效果最好的是植培凈，培養(yǎng)60 d 時的最終污染率只有13.65%。常規(guī)組培中的藍(lán)莓莖段作為外植體接種特別容易污染，在接種1周后陸續(xù)出現(xiàn)污染現(xiàn)象[26]。在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然繼代和生根期間的組培污染率有所下降，但其污染率也還是高于無糖組培。在添加抑菌劑后，無糖組培在控制污染的優(yōu)勢上進(jìn)一步突出，尤其是組培專用抑菌劑“植培凈”克服了無糖組培中接種量大、接種時間長而產(chǎn)生的污染風(fēng)險，其控制污染的效果明顯優(yōu)于其他3 種抑菌劑。

4 結(jié)論

藍(lán)莓無糖組培技術(shù)較常規(guī)的組培有較大的優(yōu)勢。通過去除糖分和有機(jī)組分的液體培養(yǎng)基減少了污染，繼而改用大容器培養(yǎng)，通過自然增加植株的適應(yīng)性，得到較為健壯的苗木。本研究對藍(lán)莓無糖組培中不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度、固體基質(zhì)與營養(yǎng)液比例以及抑菌劑的選擇這3 個重要的影響因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)改良WPM＋1.0 mg/L IBA/NAA 的營養(yǎng)液配方效果較好，1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養(yǎng)液的固液比最佳，植培凈的抑菌效果好于其他抑菌劑，在此條件下培養(yǎng)的藍(lán)莓苗健壯、根系多、污染率低。