沈 童 吳 華 陳鑫磊 刁明勇 李金銘 王 碩 武小慶 行倩文

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

青海省特色野生植物黑果枸杞含有豐富的花青素?；ㄇ嗨貏e名花色苷，是水溶性類黃酮色素的重要亞類[1-2]?；ㄇ嗨鼐哂薪档托难芗膊〉陌l(fā)生率等多種生物功效，特別是抗炎、抗氧化的功效得到廣泛報道[3]。康雪燕[4]研究花青素對豬睪丸細(xì)胞的毒性和豬傳染性胃腸炎病毒的作用，發(fā)現(xiàn)花青素對豬傳染性胃腸炎病毒具有一定的治療效用。Csernus 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，花青素可以改善受脂多糖LPS 影響的肉雞生長性能、炎癥參數(shù)和腸道形態(tài)。Tian 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，花青素能夠提高短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，調(diào)節(jié)腸道微生物群結(jié)構(gòu)。

大量研究表明，氧化應(yīng)激會引起心肌細(xì)胞的功能損傷，從而成為心血管等疾病的發(fā)病緣由[3]，而缺氧能夠引起氧化應(yīng)激對機(jī)體造成組織損傷。目前鮮見關(guān)于黑果枸杞花青素對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的報道。因此，本試驗探究黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，為深入研究黑果枸杞花青素改善氧化應(yīng)激所引起的損傷及其相關(guān)分子機(jī)制提供參考，也為其對動物機(jī)體的免疫作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

本試驗所用的H9c2 大鼠心肌細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物及試劑

黑果枸杞花青素（純度64.4%，青海金麥杞生物科技有限公司）；DMEM 干粉、胎牛血清、雙抗（Gibco公司）；PBS（Hfart 公司）；胰蛋白酶EDTA 溶液0.25%（Solarbio 公司）；青霉素-鏈霉素混合液（武漢普諾賽生命科技有限公司）；RIPI（強(qiáng)）裂解液（陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司）。

超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超微量Ca2+-ATP 酶、超微量Na+K+-ATP 酶、總蛋白（TP）測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；大鼠血紅素氧合酶-1 （HO-1） 測定、大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、大鼠白細(xì)胞介素-10（IL-10）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測定試劑盒由江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.3 試驗儀器

超凈工作臺（江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司），臺式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱及CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司），MIC-101 細(xì)胞低氧小室-細(xì)胞缺氧-細(xì)胞高氧富氧培養(yǎng)倉（杭州Aipu Instrument Equipment 有限公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），酶標(biāo)儀（意大利MuLTISKAN 公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將H9c2 大鼠心肌細(xì)胞置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（10%胎牛血清+1%雙抗DMEM 培養(yǎng)基），待細(xì)胞生長約70%～80%融合時進(jìn)行傳代，2～3 d進(jìn)行一次細(xì)胞傳代，培養(yǎng)足夠的細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞分組及處理

將H9c2 大鼠心肌細(xì)胞以每孔5×105個細(xì)胞接種于24 孔板，每組3 個復(fù)孔，分組處理后置細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃ 5% CO2飽和濕度）中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。將培養(yǎng)好的心肌細(xì)胞分成常氧組、常氧+AC 組、低氧組和低氧+AC組。

常氧+AC 組和低氧+AC 組用50 mg/L AC 預(yù)處理12 h，令細(xì)胞貼壁及生長到合適的細(xì)胞密度。常氧組與常氧+AC 組放置CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，低氧組與低氧+AC 組放置細(xì)胞1%氧濃度低氧小室中低氧處理24 h。其中氧濃度使用MIC-101 細(xì)胞低氧小室-細(xì)胞缺氧-細(xì)胞高氧富氧培養(yǎng)倉控制氧濃度，每組設(shè)置3 個重復(fù)。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 細(xì)胞抗氧化因子

細(xì)胞計數(shù)后，以每孔1×105個接種于96 孔板中，按上述分組進(jìn)行試驗，取各組細(xì)胞上清液，利用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細(xì)胞上清液抗氧化因子CAT、MDA、SOD、GSH-Px、HO-1 活性，試劑盒需提前20 min 從冰箱中取出平衡至室溫，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.2 細(xì)胞能量代謝相關(guān)因子

細(xì)胞計數(shù)后，以每孔1×105個接種于96 孔板中，按上述分組進(jìn)行試驗，取各組細(xì)胞上清液，按檢測試劑盒說明書進(jìn)行處理，通過定磷法檢測各組細(xì)胞Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性。

1.6.3 細(xì)胞炎癥因子

細(xì)胞計數(shù)后，以每孔1×105個接種于96 孔板中，按上述分組進(jìn)行試驗，取各組細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細(xì)胞上清液炎性相關(guān)因子IL-6、IL-10、TNF-α 的含量，試劑盒需提前20 min 從冰箱中取出平衡至室溫，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行初步處理，SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞抗氧化因子指標(biāo)的影響（見表1）

表1 黑果枸杞花青素對H9c2大鼠心肌細(xì)胞抗氧化因子活性的影響

由表1 可知，與常氧組相比，常氧+AC 組大鼠心肌細(xì)胞CAT、HO-1 活性顯著升高（P＜0.05），GSH-Px、SOD 活性均極顯著升高（P＜0.01），MDA 的含量顯著降低（P＜0.05）；低氧組大鼠心肌細(xì)胞GSH-Px、HO-1 活性均顯著降低（P＜0.05），CAT、SOD 活性均極顯著降低（P＜0.01），MDA 含量極顯著升高（P＜0.01）。

與低氧組相比，低氧+AC 組大鼠心肌細(xì)胞CAT、GSH-Px、SOD 和HO-1 活性均極顯著升高（P＜0.01），MDA 含量極顯著降低（P＜0.01）。

結(jié)果表明，黑果枸杞花青素可通過上調(diào)抗氧化因子CAT、GSH-Px、SOD、HO-1 的生成并下調(diào)過氧化產(chǎn)物MDA 的含量提高H9c2 大鼠心肌細(xì)胞的抗氧化水平。

2.2 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞能量代謝相關(guān)因子的影響（見表2）

表2 黑果枸杞花青素對H9c2大鼠心肌細(xì)胞能量代謝相關(guān)因子活性的影響 單位：U/mg prot

由表2 可知，與常氧組相比，常氧+AC 組大鼠心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶的活性顯著升高（P＜0.05）；低氧組大鼠心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP 酶活性顯著降低（P＜0.05）， Ca2+-ATP 酶活性極顯著降低（P＜0.01）。與低氧組相比，低氧+AC 組大鼠心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP 酶、 Ca2+-ATP 酶活性均極顯著升高（P＜0.01）。

結(jié)果表明，低氧可抑制細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性，黑果枸杞花青素可通過上調(diào)Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性改善低氧對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞ATP 酶的損傷，并增強(qiáng)低氧下心肌細(xì)胞的能量代謝。

2.3 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子含量的影響（見表3）

表3 黑果枸杞花青素對H9c2大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子含量的影響

由表3 可知，與常氧組相比，常氧+AC 組大鼠心肌細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-6 抗體含量均顯著降低（P＜0.05），抗炎因子IL-10 抗體含量極顯著升高（P＜0.01）；低氧組大鼠心肌細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-6抗體含量均極顯著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10 抗體含量極顯著降低（P＜0.01）。

與低氧組相比，低氧+AC 組大鼠心肌細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-6 抗體含量均極顯著降低，抗炎因子IL-10抗體含量極顯著升高（P＜0.01）。

結(jié)果表明，黑果枸杞花青素可通過抑制低氧誘導(dǎo)后的H9c2 大鼠心肌細(xì)胞中促炎因子TNF-α、IL-6 的分泌，促進(jìn)抗炎因子IL-10 的分泌，抑制低氧誘導(dǎo)的炎癥的發(fā)生。

3 討論

3.1 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞抗氧化因子含量的影響

氧化應(yīng)激是活性氧生成與抗氧化防御系統(tǒng)之間失衡的結(jié)果[7-8]，能夠?qū)е滦募〖?xì)胞損傷，從而引發(fā)心肌損傷性疾病[9-10]，影響機(jī)體能量代謝，引發(fā)炎癥反應(yīng)。MDA、CAT、SOD、GSH-Px 是判斷機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)，MDA 屬于機(jī)體氧化應(yīng)激后的產(chǎn)物，間接反映心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度[11]。CAT、SOD、GSH-Px 作為3 種內(nèi)源性抗氧化酶，可抑制機(jī)體內(nèi)自由基生成[12-14]，上調(diào)CAT、SOD、GSH-Px 氧化因子水平可緩解機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激后自由基的產(chǎn)生，提高清除自由基的能力，減少氧化應(yīng)激對機(jī)體造成的損傷。HO-1是一種新發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶，可以在氧化應(yīng)激狀態(tài)下被誘導(dǎo)產(chǎn)生，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1 高度表達(dá)可以保護(hù)機(jī)體免受損傷[15]。

本研究顯示，在常氧狀態(tài)下，加入黑果枸杞花青素，大鼠心肌細(xì)胞CAT、HO-1 活性均明顯升高，GSH-Px、SOD 活性均極顯著升高，MDA 的含量明顯降低，說明在常氧條件下，黑果枸杞花青素能夠提高心肌細(xì)胞抗氧化能力。與常氧相比，低氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、HO-1 活性均明顯降低，CAT、SOD 活性均極顯著降低，MDA 含量極顯著升高，說明低氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。而加入黑果枸杞花青素后，低氧組心肌細(xì)胞的CAT、GSH-Px、SOD、HO-1 活性均極顯著升高，MDA 含量極顯著降低。研究表明，黑果枸杞花青素能夠提高心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激水平，減弱氧化應(yīng)激造成的損傷。

3.2 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞能量代謝相關(guān)因子的影響

能量代謝作為機(jī)體正常生理活動的基本特征，是機(jī)體的一種新陳代謝方式[16]。然而，機(jī)體不能直接吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)中的能量，必須轉(zhuǎn)化成高能磷酸化合物ATP儲存在細(xì)胞中。當(dāng)機(jī)體需要時，ATP 酶將ATP 催化水解成ADP 釋放出能量，為生理活動提供能量[17]。ATP 酶主要存在于組織細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)膜上，保證細(xì)胞新陳代謝物質(zhì)進(jìn)出，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用，Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶作為細(xì)胞膜上最典型的蛋白酶，也是能量代謝水平的重要的指標(biāo)。低氧狀態(tài)下，心肌細(xì)胞ATP 生成量減少，心肌細(xì)胞膜離子通道活動受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子增多。同時，Ca2+-ATP 酶活性受到抑制，使心肌細(xì)胞內(nèi)外鈣離子失衡，導(dǎo)致心肌損傷。因此，保持Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性能夠更好地維持細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+細(xì)胞離子平衡，從而保護(hù)心臟，減輕心肌損傷[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，在常氧狀態(tài)下，加入黑果枸杞花青素后，心肌細(xì)胞的Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性明顯升高，說明在常氧下黑果枸杞花青素可以提高其能量代謝水平。與常氧相比，低氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的Na+-K+-ATP 酶活性明顯下降，Ca2+-ATP 酶活性極顯著下降，說明低氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝下降。加入黑果枸杞花青素能夠極顯著提高心肌細(xì)胞中的Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性。研究表明，黑果枸杞花青素能夠通過提高心肌細(xì)胞中Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性，增強(qiáng)低氧情況下心肌細(xì)胞能量代謝，維持細(xì)胞離子平衡，從而起到保護(hù)心肌的作用。

3.3 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子含量的影響

炎癥是機(jī)體對外界刺激的一種防御反應(yīng)，但相應(yīng)也會造成一定程度的自我損傷。機(jī)體受到氧化應(yīng)激損傷，會增加炎性因子的產(chǎn)生[21]。由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的TNF-α 是參與機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)的重要的調(diào)節(jié)因子之一，可通過其他相關(guān)的細(xì)胞因子和增加血管通透性誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)[22]。IL-6 由心肌細(xì)胞自身產(chǎn)生[23]，能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒性，直接損傷心肌細(xì)胞[24]。IL-10 是一種有效的抗炎細(xì)胞因子，產(chǎn)生于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞，可抑制促炎因子如TNF-α、IL-6 等的合成，發(fā)揮抗炎作用[25-26]。

本研究顯示，在常氧狀態(tài)下，加入黑果枸杞花青素，促炎因子TNF-α、IL-6 含量均明顯降低，IL-10含量極顯著升高，說明黑果枸杞花青素能夠提高心肌細(xì)胞抗炎能力。與常氧相比，低氧狀態(tài)下促炎因子TNF-α、IL-6 含量均極顯著升高，抗炎因子IL-10 含量極顯著降低，說明低氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，抑制抗炎因子IL-10 分泌，減輕對促炎因子TNF-α、IL-6 的抑制作用。加入黑果枸杞花青素的低氧組中促炎因子TNF-α、IL-6 含量均極顯著降低，抗炎因子IL-10 含量極顯著升高。研究表明，黑果枸杞花青素能夠通過抑制心肌細(xì)胞中促炎因子TNF-α、IL-6 表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10 表達(dá)，降低低氧氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷的炎性反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，黑果枸杞花青素能夠通過提高CAT、GSH-Px、SOD、HO-1 活性，降低MDA 的含量提高H9c2 大鼠心肌細(xì)胞的抗氧化水平；通過提高Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性，增強(qiáng)低氧下心肌細(xì)胞的能量代謝；通過減少促炎因子TNF-α、IL-6 的含量，增加抗炎因子IL-10 含量，抑制低氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黑果枸杞花青素能夠緩解氧化應(yīng)激所致的一系列損傷，對H9c2 大鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，可為黑果枸杞花青素對心肌細(xì)胞氧化損傷的影響研究提供參考，同時也為開發(fā)青海省黑果枸杞作為新型植物源免疫增強(qiáng)劑提供參考。