韋 偉,單守明,徐文娣,李光宗

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西商洛 726000)

0 引 言

【研究意義】山葡萄(VitisamurensisRupr)為葡萄科葡萄屬,具有抗寒耐旱等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是葡萄屬中最抗寒的物種,是葡萄抗寒育種的重要種質(zhì)資源[1,2]?！p優(yōu)’為山葡萄品種,東亞種群,原產(chǎn)中國(guó),具有生長(zhǎng)旺盛、抗病耐旱和抗寒力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是加工果汁,釀制山葡萄類甜型葡萄酒的優(yōu)良品種之一[3,4]。人工繁殖時(shí)其生根極為困難,因此常規(guī)繁殖方式為嫁接[5]。嫁接繁殖的葡萄苗在鹽堿地易出現(xiàn)缺素、嫁接口愈合不好和嫁接口劈裂等現(xiàn)象,不僅會(huì)影響苗木成活率,更會(huì)嚴(yán)重影響葡萄的產(chǎn)量和質(zhì)量。研究山葡萄生根的分子機(jī)理,對(duì)其生產(chǎn)中的繁殖具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】常見葡萄生根一般為插條扦插生根和組織培養(yǎng)生根,都離不開生長(zhǎng)素類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,主要為IAA、IBA和NAA,合適的生長(zhǎng)素及濃度處理下會(huì)顯著提高‘雙優(yōu)’葡萄的生根數(shù)目[5,6]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠獲得研究對(duì)象在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況,進(jìn)而深入研究其生物學(xué)過(guò)程的分子機(jī)制[7,8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)于山葡萄的組織培養(yǎng)和其生根分子機(jī)理的研究并不多。需運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)‘雙優(yōu)’葡萄組織培養(yǎng)生根期的愈傷組織進(jìn)行測(cè)序和生物信息分析,了解其生根的分子機(jī)理,驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將山葡萄‘雙優(yōu)’組織培養(yǎng)至生根階段,以不同濃度的IBA、NAA和蔗糖誘導(dǎo)生根,對(duì)其愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。篩選差異表達(dá)基因,分析COG注釋、GO富集、KEGG富集通路、關(guān)鍵通路表達(dá)量等,研究‘雙優(yōu)’葡萄生根的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材 料

‘雙優(yōu)’葡萄組織培養(yǎng)所用外植體為寧夏大學(xué)農(nóng)科實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)獲得的帶芽莖段。材料為2 a生的‘雙優(yōu)’葡萄苗,取樣時(shí)間為2021年7月。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的消毒

將外植體取回后,選取較為健康的帶芽莖段,立即進(jìn)行消毒處理。流水充分沖洗10 min后,在超凈工作臺(tái)中70%的乙醇溶液消毒45 s,取出后使用無(wú)菌水沖洗3次,之后15%的H2O2溶液消毒6 min,再次使用無(wú)菌水沖洗4次。

1.2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)

已消毒的帶芽莖段切去兩端約5 mm,末端接入培養(yǎng)基。啟動(dòng)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基類型、激素、蔗糖和瓊脂濃度為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂,pH為5.8～6.0。光照時(shí)間16 h,光照強(qiáng)度2 500 lx,組培室溫度25 ℃。

1.2.3 生根培養(yǎng)

啟動(dòng)培養(yǎng)帶芽莖段的芽萌發(fā)長(zhǎng)至5 cm左右,在超凈工作臺(tái)中切取長(zhǎng)勢(shì)較為均一的萌發(fā)枝條轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中,每瓶接1個(gè)無(wú)根苗。設(shè)置IBA(0.1、0.3和0.5 mg/L)、NAA(0.1、0.3和0.5 mg/L)和蔗糖(15、25和35 g/L)處理。培養(yǎng)基類型為1/2B5,瓊脂濃度均為7.5 g/L,光照時(shí)間12 h,光照強(qiáng)度2 500 lx,組培室溫度為25℃,每組設(shè)置10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。觀察其生根狀況,待莖基部愈傷組織生出較小的根系,于根系數(shù)目增長(zhǎng)較快時(shí),取下基部愈傷組織切去周圍較小根系,迅速液氮冷凍,并保存于-80℃冰箱中用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及qRT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn)。表1

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用植物RNA提取試劑盒(美吉逾華)提取愈傷組織的總RNA,每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 使用Nanodrop 2000(IMPLEN, 美國(guó)) 檢測(cè)RNA的濃度和純度,使用瓊脂糖凝膠電泳(電壓5 V/cm, 時(shí)間15 min)檢測(cè)RNA完整性,使用Agilent 2100(Agilent Technologies, 美國(guó))測(cè)定RIN值。純化mRNA利用Oligo (dT)磁珠法,并將mRNA打成片段,構(gòu)建cDNA文庫(kù)并進(jìn)行質(zhì)檢。將cDNA的粘性末端補(bǔ)成平末端,利用合成cDNA文庫(kù),由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw data)進(jìn)行過(guò)濾,得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean data)。將Clean reads用Hisat2 軟件與參考基因組進(jìn)行比對(duì),并評(píng)估比對(duì)結(jié)果。將組裝獲得的基因和轉(zhuǎn)錄本與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲得基因和轉(zhuǎn)錄本的功能信息并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1和矯正過(guò)的P值(P-adjust<0.05)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析,篩選不同樣品差異表達(dá)基因,分析GO和KEGG富集。

1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證

從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取6個(gè)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。使用RNAprep Pure Plant Plus Kit(TIANGEN)試劑盒提取總RNA;使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄;使用UltraSYBR Mixture(CWBIO)試劑盒,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Jena, 德國(guó))進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn),選用VvEF基因作為內(nèi)參基因,各反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù),利用2-△△CT算法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。表2

表2 qRT-PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

研究使用Origin Pro 2021處理數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品的選擇

研究表明,選擇根系數(shù)目差異較大的S1和S6進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,S6明顯生根較多。生根處理20 d后,S6主根數(shù)顯著高于其他組,S1的主根數(shù)目最少。圖1,圖2

圖1 各組‘雙優(yōu)’葡萄組織培養(yǎng)主根數(shù)

圖2 S1和S6‘雙優(yōu)’葡萄生根及組培苗

2.2 總RNA質(zhì)量特征

研究表明,‘雙優(yōu)’葡萄各樣品的OD260/280在2.07～2.15,OD260/230在1.09～2.19,濃度在188.90～454.50 ng/μL,RIN值除S6-1為9.9,其余均為10,各指標(biāo)檢測(cè)合格,符合上機(jī)要求。樣品總RNA條帶清晰且無(wú)彌散、無(wú)污染、無(wú)降解,品質(zhì)較好,符合上機(jī)要求。表3,圖3

注：M. Trans 2KPlus

表3 樣品總RNA 質(zhì)檢

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

研究表明,6組樣品一共獲得Clean reads 284.40 Gb,各樣品Clean reads數(shù)在44.18～49.02 Gb,錯(cuò)誤率均低于0.03%,Q20均大于98%,Q30均大于94%,各樣品cDNA的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷酸的GC含量變化范圍在45.95%～46.67%。89.15%～90.3%的Clean Reads 比對(duì)到參考基因組上,2.99%～3.67%的Reads比對(duì)于多個(gè)位置,85.66%～87.02%以上比對(duì)于唯一位置。表4

表4 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.4 差異表達(dá)基因分析

研究表明, S6較S1顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因 537個(gè),顯著下調(diào)的差異表達(dá)基因277個(gè),共814個(gè)差異表達(dá)基因, 差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)大多集中在-5～5,-log10(P-adjust)的0～6,差異表達(dá)基因響應(yīng)高濃度生長(zhǎng)素和蔗糖主要以上調(diào)表達(dá)為主。圖4

圖4 差異表達(dá)基因的火山圖

2.5 差異表達(dá)基因的COG注釋

研究表明,共805個(gè)差異表達(dá)基因注釋到COG的21個(gè)分類中,其中有450個(gè)差異表達(dá)基因注釋到未知功能;74個(gè)注釋到防御機(jī)制;46個(gè)注釋到細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn);37個(gè)注釋到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。較少注釋到RNA加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)和能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換等條目。圖5

2.6 差異表達(dá)基因GO富集

研究表明,分子功能大類中主要包括多糖結(jié)合、微管運(yùn)動(dòng)活性和碳水化合物結(jié)合等條目;細(xì)胞組分大類中主要包括驅(qū)動(dòng)蛋白復(fù)合體、胞外區(qū)和微管相關(guān)復(fù)合物等條目;生物學(xué)過(guò)程中主要包括基于微管的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)素激活信號(hào)通路和蛋白質(zhì)磷酸化等條目。差異基因在生物學(xué)過(guò)程富集到的較多,在分子功能和細(xì)胞組分中富集到的較少。圖6

圖6 差異表達(dá)基因的GO富集

2.7 差異基因KEGG代謝通路

研究表明,共涉及通路84條,差異表達(dá)基因在苯丙烷生物合成通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因20個(gè),其中8個(gè)上調(diào)表達(dá),12個(gè)下調(diào)表達(dá);在類黃酮生物合成通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因12個(gè),其中6個(gè)上調(diào)表達(dá),6個(gè)下調(diào)表達(dá);在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因16個(gè),其中13個(gè)上調(diào)表達(dá),3個(gè)下調(diào)表達(dá);在托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因7個(gè),其中2個(gè)上調(diào)表達(dá),5個(gè)下調(diào)表達(dá);在β-丙氨酸代謝通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因7個(gè),其中4個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào)。此外還有9個(gè)差異表達(dá)基因在淀粉和蔗糖代謝通路中富集。顯著富集的代謝途徑直接或間接地參與‘雙優(yōu)’葡萄愈傷組織的生根中,其中部分基因可能在生根過(guò)程中發(fā)揮重要作用。圖7,圖8

圖7 KEGG富集散點(diǎn)圖

圖8 KEGG富集分析顯著富集通路基因數(shù)

2.8 植物激素相關(guān)基因的表達(dá)量

研究表明,H1和H6‘雙優(yōu)’葡萄生根愈傷組織在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共富集16個(gè)。差異基因富集于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯和水楊酸途徑。生長(zhǎng)素途徑包括Aux/IAA和GH3基因家族,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LAX3,共11個(gè)差異表達(dá)基因,在S6中均為上調(diào)表達(dá);細(xì)胞分裂素途徑中包含一個(gè)A-ARR蛋白相關(guān)基因,S6中為上調(diào)表達(dá);油菜素內(nèi)酯途徑中包括2個(gè)TCH4-2相關(guān)基因,在S6中下調(diào)表達(dá),1個(gè)CYCD3-1相關(guān)基因,在S6中上調(diào)表達(dá);水楊酸途徑包括1個(gè)PR1相關(guān)基因,S6中下調(diào)表達(dá)。S6中上調(diào)表達(dá)基因較多,尤其生長(zhǎng)素途徑,11個(gè)差異表達(dá)基因均為上調(diào)表達(dá),生長(zhǎng)素途徑可能與愈傷組織生根關(guān)系密切。其中有5個(gè)上調(diào)表達(dá)基因,表達(dá)量差異尤為明顯,為IAA14、IAA22、IAA27、LAX3和A-ARR基因,5個(gè)基因可能對(duì)‘雙優(yōu)’葡萄愈傷組織的生根有重要作用。圖9

注：使用log10(FPKM)值進(jìn)行聚類分析。紅色代表高表達(dá)基因,藍(lán)色代表低表達(dá)基因,從藍(lán)色到紅色為log10(FPKM)逐漸上升

2.9 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗(yàn)證

研究表明,RNA-seq的表達(dá)差異倍數(shù)和qRT-PCR相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較,二者趨勢(shì)相近,表明RNA-seq分析結(jié)果可靠。圖10

圖10 部分基因的qRT-PCR 驗(yàn)證

3 討 論

林茜等[9]得到陽(yáng)光玫瑰葡萄組織培養(yǎng)的最佳生根激素配比為0.4 mg/L IBA +0.2 mg/L NAA。齊向麗等[10]得到紅國(guó)王葡萄組織培養(yǎng)生根階段的適宜蔗糖濃度為25～30 g/L。目前對(duì)于山葡萄組織培養(yǎng)的相關(guān)研究并不多,研究中最適處理S6培養(yǎng)基組成為1/2B5+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+25 g/L蔗糖。愈傷組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可知差異基因以上調(diào)表達(dá)為主,在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有16個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集,且IAA14、IAA22、IAA27、LAX3和A-ARR基因表達(dá)量差異較大,均為上調(diào)表達(dá)。

生長(zhǎng)素是一種重要的植物激素,在促進(jìn)不定根的起始和發(fā)生過(guò)程中有重要作用,可以在植物的嫩葉、根系和子葉中合成[11-13]。生長(zhǎng)素的運(yùn)輸包括2種形式,韌皮部的長(zhǎng)距離運(yùn)輸和極性運(yùn)輸[14]。極性運(yùn)輸離不開其運(yùn)輸?shù)鞍?包括促進(jìn)其流入的蛋白(AUX和LAX)和流出蛋白(P-Glycoprotein ABC和PIN)[15],在生長(zhǎng)素途徑中富集到LAX3基因,在S6中上調(diào)表達(dá),且于S1中表達(dá)量差異較大。生長(zhǎng)素是通過(guò)一些早期應(yīng)答基因以及轉(zhuǎn)錄因子等來(lái)調(diào)控植物的性狀的。生長(zhǎng)素早期應(yīng)答響應(yīng)基因主要包括Aux/IAA、GH3和SAUR基因家族[16]。Aux/IAA家族基因是重要的生長(zhǎng)素原初響應(yīng)基因,其家族多數(shù)成員都與根系生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)[17]。生長(zhǎng)素能調(diào)節(jié)Aux/IAA蛋白,之后快速調(diào)控一系列響應(yīng)基因的表達(dá)[18]。GH3家族基因是一類功能復(fù)雜的生長(zhǎng)素原初響應(yīng)基因,能被植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)快速高表達(dá),其功能包括吲哚乙酸(IAA)和茉莉酸(JA)的氨基酸化合成酶功能、在JA和水楊酸(SA) 介導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)中作用、可以與生長(zhǎng)素反應(yīng)因子互作,并參與光反應(yīng)途徑,其中GH3-6屬于Ⅱ類GH3基因,在維持生長(zhǎng)素的動(dòng)態(tài)平衡和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中作用,可以控制根的生長(zhǎng)[19-21]。在生長(zhǎng)素途徑中共富集Aux/IAA家族基因7個(gè),GH3家族基因3個(gè),10個(gè)基因均在S6中上調(diào)表達(dá)。生長(zhǎng)素途徑共11個(gè)差異表達(dá)基因,包括LAX、Aux/IAA和GH3基因家族,均在S6中上調(diào)表達(dá)。較高濃度生長(zhǎng)素誘導(dǎo)‘雙優(yōu)’葡萄生根,生長(zhǎng)素途徑在‘雙優(yōu)’葡萄的生根中發(fā)揮重要作用,其中涉及到IAA14、IAA22、IAA27和LAX3基因表達(dá)差異明顯。細(xì)胞分裂素途徑中包含2種反應(yīng)調(diào)節(jié)因子,其中A型ARR在細(xì)胞分裂素途徑中起負(fù)調(diào)控作用[22,23]。ARR-A基因在S6中上調(diào)表達(dá),與S1中表達(dá)量差異明顯,調(diào)控細(xì)胞分裂素的合成。

4 結(jié) 論

較高濃度的生長(zhǎng)素誘導(dǎo)山葡萄‘雙優(yōu)’組織培養(yǎng)生根,植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的生長(zhǎng)素途徑在其中作用重要,11個(gè)相關(guān)基因全部上調(diào)表達(dá)。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中涉及到表達(dá)量差異較大的基因包括IAA14、IAA22、IAA27、LAX3和A-ARR基因,都在S6中上調(diào)表達(dá),5個(gè)基因可能在‘雙優(yōu)’葡萄的生根中發(fā)揮重要作用。