楊瑞賓 國(guó)學(xué)紅 周成英 吳雪梅

(興義市人民醫(yī)院,貴州 興義 562400 )

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種比較常見(jiàn)的慢性炎癥性自身免疫性疾病,對(duì)稱(chēng)性的手、足小關(guān)節(jié)的慢性滑膜炎及血管炎為本病的基本特征。miRNA是一類(lèi)抑制編碼基因表達(dá)的調(diào)控基因,其主要通過(guò)結(jié)合特定的靶mRNA的3’非編碼區(qū)使其降解或抑制其翻譯過(guò)程以影響目的基因的表達(dá)[1]。研究[2]表明,miR-155是與人體免疫密切相關(guān)的非編碼RNA,在單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及TB細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞表面發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。miR-155可通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞在自身免疫性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種自身免疫性疾病及免疫炎癥中發(fā)揮作用。本研究旨在探討RA患者miR-155如何調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群Th17及Treg細(xì)胞的分化及其特異性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá),從miRNA的角度研究RA免疫功能紊亂的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制,為RA的防治、病情監(jiān)測(cè)提供新思路和理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年8月至2020年10月本院風(fēng)濕免疫科RA患者62例為研究對(duì)象,其中輕度RA患者37例,重度RA患者25例。所有RA患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)并排除腫瘤及其它自身免疫性疾病。活動(dòng)期RA患者需符合RA診斷標(biāo)準(zhǔn)+關(guān)節(jié)腫脹≥3個(gè)且同時(shí)滿(mǎn)足以下條件中任意2條:關(guān)節(jié)內(nèi)或者周?chē)拷?個(gè)小時(shí);關(guān)節(jié)腫痛≥5;ESR≥28 mm/h;CRP↑≥1.5倍正常值。對(duì)照組選擇同期在我院體檢的健康者30例,男21例,女9例,年齡2～74歲;輕度RA患者男10例,女27例,年齡5～76歲;重度RA患者男2例,女23例,年齡25～77歲。根據(jù)知情同意原則,所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)并獲得本院倫理委員會(huì)同意。RA組與健康對(duì)照組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法 采集所以研究對(duì)象空腹靜脈血5 mL至EDTA抗凝的紫色無(wú)菌管內(nèi),離心收集血漿。密度梯度法離心獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)用Trizol LS和Trizol試劑分別提取外周血血漿及PBMCs中的RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA,以其為模板,RCR擴(kuò)增各目的基因。RT-qPCR法檢測(cè)RA患者及健康對(duì)照組外周血中miR-155、SOCS1、JAK3、RORγt 、SATA3、SATA5、Foxp3 的mRNA的表達(dá)情況,用免疫熒光法檢測(cè)IL-2、IL-6、IL-10、IL-17等細(xì)胞因子的表達(dá)情況;用免疫印跡分析(Western boltting)檢測(cè)SOCS1、JAK3、RORγt、SATA3、SATA5、Foxp3靶基因及相關(guān)信號(hào)通路中重要蛋白的表達(dá)情況。采用電化學(xué)發(fā)光法、免疫散射比濁法及膠乳增強(qiáng)免疫比濁法分別檢測(cè)各組研究對(duì)象血清中A-CCP、CRP、ASO與 RF含量;所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0、Graph prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-155、SOCS1、JAK3等基因的mRNA及其蛋白表達(dá)情況 RA患者外周血中miR-155mRNA、JAKmRNA3及其蛋白表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),且重度組RA患者miR-155mRNA、JAKmRNA3及其蛋白較輕度組RA患者更高(P<0.05);SOCS1mRNA及其蛋白表達(dá)水平在RA患者外周血中明顯低于健康人群(P<0.05),且重度組RA患者SOCS1mRNA與其蛋白表達(dá)水平較輕度組RA患者更低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2調(diào)控Th17細(xì)胞分化相關(guān)STAT3/RORγ通路分子的mRNA及其蛋白表達(dá)情況 RA患者外周血中STAT3mRNA、RORγtmRNA及其蛋白表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯升高(P<0.05);且重度組RA患者STAT3mRNA表達(dá)水平及蛋白P-STAT3/STAT3、RORγt/β-actin表達(dá)水平較輕度組升高更明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3調(diào)控Treg細(xì)胞分化相關(guān)STAT5/Foxp3通路分子的mRNA及其蛋白表達(dá)情況 RA患者外周血中STAT5mRNA及其蛋白、p-STAT5蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05),且重度組RA患者STAT5mRNA及其蛋白、p-STAT5蛋白表達(dá)水平較輕度組患者表達(dá)更低(P<0.05);Foxp3mRNA及其蛋白在重度RA患者外周血中表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05),在輕度RA患者中Foxp3mRNA降低不明顯(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注:Treg細(xì)胞分化相關(guān)STAT5/Foxp3通路分子在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中的表達(dá)變化圖3 與對(duì)照組相比較,*P<0.05;與輕度組相比較,#P<0.05。

2.4外周血中miR155、SOCS1、SATA3、SATA5、ROPγt、FOXP3、JAK3mRAN含量 RA患者外周血中miR-155 mRNA、JAK3 mRNA、SATA3 mRNA、RORγt mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05),且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān);而SOCS1 mRNA、SATA5 mRNA、Foxp3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組,且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 RA組與對(duì)照組外周血中miR155、SOCS1、SATA3、SATA5、ROPγt、FOXP3、JAK3mRAN含量比較

2.5外周血中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17等細(xì)胞因子的表達(dá)情況 RA患者外周血中細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IL-17表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),且重度組RA患者較輕度組RA患者升高不明顯(P>0.05);細(xì)胞因子IL-6表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),且重度組患者IL-6表達(dá)水平明顯高于輕度組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 免疫熒光法比較RA各組與對(duì)照組血清中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17含量

2.6血清中A-CCP、ASO、RF、CRP等炎性因子的表達(dá)情況 RA患者血清中炎性因子A-CCP、RF含量均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),且重度組A-CCP含量較輕度組升高更顯著(P<0.05);重度組CRP含量顯著高于健康對(duì)照組及輕度組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 RA各組與對(duì)照組血清中A-CCP、ASO、RF、CRP含量比較

3 討 論

miRNA是具有免疫調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,miR-155為其家族成員且生物學(xué)活性廣泛,其可通過(guò)多種途徑調(diào)控T細(xì)胞的分化與功能,在維護(hù)免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中起到了重要作用。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-155、JAK-STAT信號(hào)通路分子、SOCS1等基因的mRNA及蛋白在RA外周血的表達(dá)情況,以探討其在RA中的致病機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示,RA患者外周血miR-155mRNA表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),且重度RA患者其miR-55 mRNA表達(dá)較輕度RA患者更高(P<0.05),說(shuō)明miR-155參與RA調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng),且與病情嚴(yán)重程度相關(guān);結(jié)果還顯示RA患者外周血中SOCS1mRNA及其蛋白水平顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05),JAK3mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),RA患者外周血STAT3mRNA、P-STAT3mRNA、RORγtmRNA及其蛋白表達(dá)水平也顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),此結(jié)果提示活化的STAT3蛋白參與RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。STAT3蛋白的活化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)與調(diào)控起關(guān)鍵作用,上調(diào)STAT3可促進(jìn)其RORγt表達(dá)致使活化的CD4+T細(xì)胞向Thl7細(xì)胞分化。本研究結(jié)果還顯示,RA患者外周血STAT5mRNA、P-STAT5mRNA、Foxp3mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05),且與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。研究[3]表明,STAT5是JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路中對(duì)Treg細(xì)胞分化起關(guān)鍵的作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子,STAT5蛋白的活化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)與調(diào)控起關(guān)鍵作用。上調(diào)STAT5可促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)致使活化的CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化,反之則抑制Treg細(xì)胞的分化。Th17細(xì)胞是引起自身免疫性疾病和宿主炎癥反應(yīng)中造成組織損傷的關(guān)鍵因子,且參與了RA免疫炎癥反應(yīng)、滑膜增殖、骨侵蝕多個(gè)病理環(huán)節(jié)。其分泌的主要致炎因子IL-17以激活補(bǔ)體、活化中性粒細(xì)胞釋放炎癥性因子方式介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)。IL-17、IL-1、IL-6、TNF-α等致炎因子聯(lián)合作用可加快血管翳形成與關(guān)節(jié)軟骨破壞,致使關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)一步加重[4-7]。本研究提示RA患者外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量較健康對(duì)照組明顯升高,且重度RA患者外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量較輕度RA患者升高更明顯,RA患者外周血中IL-17、IL-6表達(dá)水平也顯著高于健康對(duì)照組,且與疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)。Treg細(xì)胞是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+T細(xì)胞亞群,其可以通過(guò)降低炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生、減少抗體分泌,進(jìn)而維持自身免疫耐受。Treg細(xì)胞抑制自身免疫性炎癥反應(yīng)主要通過(guò)分泌細(xì)胞因子TGF-β和IL-10以抵抗其它CD4+T亞型細(xì)胞的分化與炎性介質(zhì)的釋放。被一系列研究[8-9]表明,RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于Th17/Treg之間的免疫失衡狀態(tài)及相關(guān)的細(xì)胞因子微環(huán)境發(fā)生了改變。趙俊桃等[10]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RA患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量明顯減少,Treg細(xì)胞數(shù)量明顯降低,且二者都與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,RA患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量明顯低于健康對(duì)照組,且重度RA患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量更少,提示RA患者存在免疫耐受下降;結(jié)果還顯示,A-CCP、RF等炎性因子在RA患者外周血中高表達(dá),參與RA的致炎過(guò)程,并且其特異性與敏感性較高,可用于評(píng)估類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。然而,免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)RA患者血清中IL-10 細(xì)胞因子水平較健康對(duì)照組卻明顯升高,Treg細(xì)胞數(shù)量與IL-10表達(dá)水平發(fā)生不一致的現(xiàn)象,有可能與標(biāo)本類(lèi)型的差異或病程與活動(dòng)度有關(guān),也可能RA患者體內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,在RA的炎癥過(guò)程中,miR-155參與調(diào)控著RA眾多的基因及信號(hào)蛋白的表達(dá)。在CD4+T細(xì)胞分化過(guò)程中,miR-155可能通過(guò)抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制物SOCSl的表達(dá)而上調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路中核轉(zhuǎn)錄因子STAT3及其細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORrt的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子IL-17、IL-6的表達(dá);通過(guò)下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路中核轉(zhuǎn)錄因子SATA5及其細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3途徑以抑制Treg細(xì)胞的分化。RA患者中存在Th17/Treg細(xì)胞之間免疫失衡狀態(tài)及多種炎性因子水平異常表達(dá),二者均參與了RA發(fā)病過(guò)程。(圖1、圖2見(jiàn)封三)。