陳 妍 李市場(chǎng)杜瑩瑞 胡鋒陽 丁 慧 龔明貴

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471000）

痛風(fēng)是最常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎之一[1]，高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的主要因素[2]。痛風(fēng)發(fā)作可引起常見的腎臟疾病等并發(fā)癥[3]。家禽痛風(fēng)是一種蛋白質(zhì)代謝障礙引起的高尿酸血癥，其病理特征為血液尿酸水平增高，尿酸鹽在關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)軟骨、內(nèi)臟、腎小管及輸尿管中沉積。趙運(yùn)吉[4]對(duì)高蛋白飼料引起的雛鵝痛風(fēng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)通過摻拌粗飼料、減少日糧供應(yīng)量、多喂青飼料等方法降低日糧蛋白質(zhì)含量可以減少尿酸的產(chǎn)生。

白楊素是一種天然存在于蜂蜜、蜂膠和蘑菇中的類黃酮化合物。Chang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，白楊素具有抗高尿酸和抗炎作用，可以輔助治療痛風(fēng)。本文研究的中藥發(fā)酵液的原料含有車前草、土茯苓、桑葉等藥材。單純的中藥發(fā)酵風(fēng)味差，為改善中藥本身苦澀的口感，可添加少量的果蔬（如檸檬、柚子、獼猴桃、馬齒莧等）作為輔料，自然發(fā)酵。本試驗(yàn)研究中藥發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清指標(biāo)以及腎臟、踝關(guān)節(jié)相關(guān)指標(biāo)的改善效果，探究其作用機(jī)制，為中藥發(fā)酵液在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 中藥發(fā)酵液

中藥發(fā)酵液由洛陽糠豪川禾科技有限公司提供（發(fā)酵用優(yōu)勢(shì)菌種為戊糖乳桿菌和美洲虎乳桿菌，將馬齒莧、苦蕎等干燥研磨過80目篩混合作為底物，液體厭氧發(fā)酵180 d）。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

雄性大鼠60只，雄性，SPF級(jí)，體重（200±20）g，購自河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（試驗(yàn)動(dòng)物許可證明編號(hào)：SYXK（豫）2020-0008）。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

1,1-二硝基-2-三硝基苯肼、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；維生素C、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鄰苯三酚，購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒，購自上海易匯生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；BCD-318AT 型臥式冷凍箱（海爾電器有限公司）、生化培養(yǎng)箱（太倉精宏儀器設(shè)備有限公司）、ME203E/02 型電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）、iMagic-V7型全自動(dòng)生化分析儀（深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司）。

1.2 發(fā)酵液成分分析

樣品從-80 ℃冰箱中取出解凍后，渦旋10 s混勻。取混勻后的樣本200 μL，置2 mL離心管，加入200 μL提取劑提取。渦旋5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，于進(jìn)樣瓶中保存，委托嘉興邁維代謝生物科技有限公司進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)，并由該公司協(xié)助進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

HPLC-MS 條件：色譜柱，Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相，A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B 相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度，0 min B 相比例為5%，9.00 min 內(nèi)B 相比例線性增加至95%，并維持在95% 1.00 min，10.00～11.10 min，B 相比例降為5%，并以5%平衡至14.00 min；柱溫40 ℃；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量4 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V （正模式）/-4 500 V （負(fù)模式），簾氣（CUR）25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿（QQQ）中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

從河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院購買大鼠30 只（雄性）隨機(jī)分成3 組，分別灌胃低濃度（20%）發(fā)酵液、中濃度（40%） 發(fā)酵液、 高濃度（60%） 發(fā)酵液16 mL/kg，在每天灌胃1 次的情況下，持續(xù)灌胃15 d，觀察試驗(yàn)大鼠均無不良反應(yīng)，表明發(fā)酵液無毒性可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇60只雄性大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、發(fā)酵液低濃度組、發(fā)酵液中濃度組、發(fā)酵液高濃度組。所有大鼠自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始試驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組給予正常大鼠飼料，其余組大鼠均給予2%氧嗪酸鉀聯(lián)合12%酵母膏飼料，連續(xù)造模4周。陽性對(duì)照組（別嘌醇片組：濃度為0.52 g/L）、發(fā)酵液低濃度（20%）組、發(fā)酵液中濃度（40%）組、發(fā)酵液高濃度組（60%）組大鼠灌胃16 mL/kg 對(duì)應(yīng)濃度的發(fā)酵液，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min 離心15 min 得到血清。取腎臟、踝關(guān)節(jié)，用4 ℃的生理鹽水沖洗，洗盡殘血，以4%甲醛固定。

1.5.2 腎臟指數(shù)、踝關(guān)節(jié)周徑

使用卷尺緊貼大鼠踝部最細(xì)處，水平環(huán)繞一周，記錄測(cè)量結(jié)果，即踝關(guān)節(jié)周徑。甲醛固定的樣本進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，供常規(guī)光鏡下切片的病理形態(tài)學(xué)變化觀察，計(jì)算腎臟指數(shù)。

1.5.3 血清生化指標(biāo)

取適量存放于EP 管中處理后的大鼠血清，血清中尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量按試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Word 和Graphpadprism8 作圖，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)比較組間差異顯著性。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥發(fā)酵液成分分析

利用軟件Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，得到混樣樣品質(zhì)譜分析總離子流，見圖1。

圖1 混樣樣品質(zhì)譜分析總離子流

中藥發(fā)酵液成分分析見表1。

表1 中藥發(fā)酵液成分分析

由表1可知，中藥材發(fā)酵液中主要含有9種物質(zhì)，其中含有黃酮類化合物55種，相對(duì)含量占15.39%。

2.2 不同濃度發(fā)酵液對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)周徑的影響（見表2）

由表2 可知，治療后高濃度發(fā)酵液組大鼠踝關(guān)節(jié)周徑與空白對(duì)照組最為接近，極顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01），說明高濃度發(fā)酵液能夠有效改善大鼠踝關(guān)節(jié)痛風(fēng)癥狀。

2.3 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠腎臟指數(shù)的影響（見圖2）

圖2 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠腎臟指數(shù)的影響

由于尿酸鹽通過腎臟，會(huì)加大腎臟的負(fù)荷。尿酸鹽在腎臟沉積，腎臟萎縮，導(dǎo)致腎臟受損質(zhì)量減輕，腎功能衰退。由圖2 可知，發(fā)酵液能夠明顯抑制這種趨勢(shì)，高濃度發(fā)酵液組大鼠的腎臟系數(shù)與空白對(duì)照組最為接近，作用效果最明顯。高濃度發(fā)酵液組腎臟指數(shù)高于模型對(duì)照組，極顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01）。

2.4 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清UA 含量的影響（見圖3）

圖3 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清UA含量的影響

UA產(chǎn)生過多與腎損害有關(guān)，是引發(fā)高尿酸血癥的關(guān)鍵因素，而高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的重要生理生化基礎(chǔ)。由于UA過高會(huì)造成尿酸鹽沉積，本研究通過測(cè)定大鼠血清UA含量判斷發(fā)酵液改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的效果。

由圖3 可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清UA含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，高濃度發(fā)酵液組大鼠血清UA含量極顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，高濃度發(fā)酵液能夠有效降低大鼠體內(nèi)UA含量。

2.5 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清BUN含量的影響（見圖4）

圖4 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清BUN含量的影響

BUN能夠反映腎組織健康程度，腎損傷會(huì)伴隨BUN增加。由圖4 可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清BUN含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，高濃度發(fā)酵液組大鼠血清BUN 含量極顯著降低（P＜0.01）。高濃度發(fā)酵液組大鼠血清BUN 含量明顯低于其他組，表明高濃度發(fā)酵液可降低血清BUN含量，保護(hù)腎損傷。

2.6 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清Cr含量的影響（見圖5）

圖5 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清Cr含量的影響

Cr 是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，主要由腎小球?yàn)V過排出體外。腎臟損害伴隨著BUN 和血Cr 的增加[6-9]。由圖5 可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清Cr含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比，高濃度發(fā)酵液組大鼠血清Cr含量顯著降低（P＜0.05），表明高濃度發(fā)酵液能夠降低大鼠血清Cr含量，減少腎損傷。

2.7 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β 含量的影響（見圖6）

圖6 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β含量的影響

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹程度與炎癥因子[10]有關(guān)。由圖6 可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清IL-1β 含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，高濃度發(fā)酵液組大鼠血清IL-1β含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，高濃度發(fā)酵液能夠抑制炎性因子表達(dá)，減輕水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥癥狀。

2.8 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α含量的影響（見圖7）

圖7 不同濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α含量的影響

尿酸鈉結(jié)晶刺激局部組織產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，如TNF-α，其含量升高說明體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。由圖7可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清TNF-α含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，高濃度發(fā)酵液組血清TNF-α含量極顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，高濃度發(fā)酵液能夠有效終止炎性細(xì)胞因子的活化，改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥情況。

2.9 不同處理組大鼠腎臟損傷病理切片（見圖8）

由圖8可知，空白對(duì)照組腎色暗紅，表面光滑，外觀無腫脹，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎組織形態(tài)正常。模型對(duì)照組腎色暗黃，腎臟組織被膜不完整，腎小球萎縮，腎小管排列紊亂，大部分細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，腎臟受損嚴(yán)重。陽性對(duì)照組腎臟病變明顯減輕，腎小管仍見擴(kuò)張，管腔增大。低濃度發(fā)酵液組腎小管排列紊亂，局部細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。中濃度發(fā)酵液組腎臟病變程度減輕，腎臟組織被膜較完整，個(gè)別細(xì)胞壞死。高濃度發(fā)酵液組腎組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，腎小管擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化有所改善，與空白對(duì)照組腎臟狀態(tài)最為接近[11-13]。

結(jié)果表明，中藥材發(fā)酵液可在一定程度上改善腎損傷的病理學(xué)狀況，緩解損傷腎組織的炎癥，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以高濃度發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的改善效果最顯著。

2.10 不同處理組大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片（見圖9）

圖9 不同處理組大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片（100×）

由圖9 可知，空白對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無組織水腫現(xiàn)象[14]。模型對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜腫脹表層受損，細(xì)胞可見明顯增生，結(jié)構(gòu)排列紊亂，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。陽性對(duì)照組輕微滑膜細(xì)胞增生、變性，炎細(xì)胞減少。低濃度發(fā)酵液組和中濃度發(fā)酵液組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織輕度腫脹，細(xì)胞輕度增生，結(jié)構(gòu)排列紊亂。高濃度發(fā)酵液組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織輕度腫脹，細(xì)胞排列稍顯紊亂，與空白對(duì)照組狀態(tài)接近。

3 討論

3.1 中藥發(fā)酵液對(duì)大鼠腎功能的影響

中草藥經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后活性物質(zhì)含量增加，大分子物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)。血清UA、BUN 和Cr 含量是反映腎臟功能的特異性指標(biāo)。UA 是由腎臟排出體外，BUN 和Cr 是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，經(jīng)腎臟排出。本研究中，模型對(duì)照組大鼠血清UA、BUN 和Cr 含量均明顯高于空白對(duì)照組，說明腎功能出現(xiàn)了問題。高濃度發(fā)酵液組大鼠血清UA、BUN 和Cr 含量均低于模型對(duì)照組，且與空白對(duì)照組接近，說明該中藥發(fā)酵液對(duì)腎功能損害大鼠的腎臟具有一定的保護(hù)作用。

3.2 中藥發(fā)酵液對(duì)大鼠血清IL-1β含量的影響

白細(xì)胞介素是一類具有多重功效的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本研究中，模型對(duì)照組大鼠血清IL-1β 含量高于空白對(duì)照組，高濃度發(fā)酵液組顯著低于模型對(duì)照組，說明中藥發(fā)酵液能夠抑制IL-1β 炎性因子的表達(dá)，降低炎癥指標(biāo)，減輕水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥癥狀。

3.3 中藥發(fā)酵液對(duì)大鼠血清TNF-α含量的影響

TNF-α主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)急劇發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì)，對(duì)炎癥介質(zhì)的抑制是有效減輕痛風(fēng)炎癥的手段。本研究中，模型對(duì)照組大鼠血清TNF-α含量明顯高于空白對(duì)照組；與模型對(duì)照組相比，中藥發(fā)酵液低濃度組對(duì)TNF-α含量改善效果不明顯，高濃度組明顯降低，表明中藥發(fā)酵液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型具有一定的抗炎和防治作用。

3.4 中藥發(fā)酵液改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制探討

中藥發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)和其他生物活性物質(zhì)含量豐富，包括所用原料自身所有成分與微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的新成分。微生物發(fā)酵可提高許多生物活性物質(zhì)含量。類黃酮是植物次生代謝產(chǎn)物，來自許多水果、蔬菜、和其他植物性食物[15]。發(fā)酵液中的功效性物質(zhì)包括黃酮、酚類、礦物質(zhì)、功能性低聚糖、酶及其他次生代謝產(chǎn)物等。作為重要的中藥成分，黃酮生物活性廣泛[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，高濃度發(fā)酵液組大鼠血清中UA 和BUN 含量極顯著降低，說明高濃度發(fā)酵液能夠通過抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）活性保護(hù)由UA 過高造成的腎損傷，對(duì)改善痛風(fēng)癥狀具有良好的作用。

中醫(yī)治療痛風(fēng)具有多成分、多靶點(diǎn)、綜合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，具有較大的臨床應(yīng)用前景[18]。近年來，相關(guān)學(xué)者針對(duì)中醫(yī)藥治療痛風(fēng)開展了大量動(dòng)物試驗(yàn)研究，并取得了一定成效。翟福展[19]通過不同可飼用天然植物組方對(duì)痛風(fēng)雞蛋的臨床表現(xiàn)、血清變化進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)由積雪草、車前子、益母草、五加皮組成的方劑效果最為顯著。研究表明，以赤蒼藤、甘草、姜黃、薏仁作為防治家禽痛風(fēng)病的組方，使用12 種益生菌對(duì)中藥進(jìn)行發(fā)酵，肉雞痛風(fēng)治愈率達(dá)82.00%[20]。本文以2%氧嗪酸鉀聯(lián)合12%酵母膏特殊飼料進(jìn)行造模得到痛風(fēng)動(dòng)物模型，試驗(yàn)結(jié)果顯示，中草藥發(fā)酵液可改善痛風(fēng)動(dòng)物的腎損傷。中藥發(fā)酵營養(yǎng)成分含量豐富，能夠降低血清UA含量，各種原料相互促進(jìn)、協(xié)同增效，使其具備預(yù)防和調(diào)理痛風(fēng)的功效。本試驗(yàn)條件下，車前草、山楂、馬齒莧等配伍使用對(duì)2%氧嗪酸鉀聯(lián)合12%酵母膏特殊飼料飼養(yǎng)的高尿酸血癥大鼠具有積極的影響。因此，乳酸菌發(fā)酵中藥輔以果蔬治療痛風(fēng)具有廣闊的開發(fā)前景，值得進(jìn)一步深入開發(fā)[21-23]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，中藥發(fā)酵液對(duì)由高UA引起的腎損傷具有一定保護(hù)作用，對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠具有一定的消炎作用，以高濃度效果最為明顯。