金緯緯，林一禾，莊曉蘋，趙小迎

有研究顯示腫瘤干細胞（CSCs）在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和耐藥性等方面具有至關重要的作用[1-4]。但是如何精確識別、追蹤及靶向殺傷CSC是臨床治療子宮內(nèi)膜癌的關鍵。集落刺激因子1（CSF1）是機體內(nèi)微環(huán)境中如腫瘤微環(huán)境和骨髓微環(huán)境常見的造血生長因子，其在血液系統(tǒng)中參與了多種免疫反應過程，可刺激造血祖細胞生長與分化，而在腫瘤微環(huán)境中，過往的研究顯示CSF1 在腫瘤細胞的侵襲遷移、免疫逃逸、脂質(zhì)代謝、血管發(fā)生和炎癥反應中發(fā)揮重要作用[5-8]。有研究顯示，CSF1 也表達于各類實體腫瘤細胞中，尤其在CSCs 中呈現(xiàn)高表達[9]，但CSF1 在子宮內(nèi)膜癌中的相關研究報道較少。本研究探討CSF1 在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達情況，揭示其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Excell 公司），TRizol（Invitrogen）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（eBioscience 公司），SYBR Green PCR Kit（BD 公司），anti-CSF1 抗體（Abclonal 公司），anti-rabbit-IgG（Sigma公司），NC 模（上海時代生物科技有限公司），SDSPAGE 凝膠預制膠試劑盒（碧云天生物技術有限公司），Tween-20（上海生工生物工程有限公司），質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G、shRNA、人腎上皮細胞系293T細胞由溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實驗室保存。超凈細胞工作臺和細胞培養(yǎng)箱（Thermo），低溫高速離心機（Hettich），移液器（Eppendorf），流式細胞分析儀（FACS Calibur），數(shù)字化成像設備（GE Healthcare），熒光倒置顯微鏡（Nikon），BIO-RAD凝膠電泳系統(tǒng)（伯樂公司）。細胞株實驗組：子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞（腺癌）；對照組：正常內(nèi)膜細胞系ECT1/E6E7細胞，宮頸癌細胞株Hela細胞株（腺癌），乳腺癌細胞株MCF7、胃癌細胞株SGC-7901、結腸癌細胞系SW620。上述所有細胞株由溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室贈送。本研究經(jīng)溫州市中西醫(yī)結合醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 CSF1 mRNA 水平表達檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法（real-time PCR）檢測CSF1基因表達情況。1×106Ishikawa 細胞和1 ml Trizol 混合，按Trizol 說明書抽提細胞RNA。CSF1 引物跨內(nèi)含子，所有引物序列由上海生工生物工程公司合成。引物：CSF1（108 bp）：上游5’- TGGCGAGCAGGAGTATCAC-3’，下游5’- AGGTCTCCATCTGACTGTCAAT-3’；ACTIN（101 bp）：上游5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’；下游5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’；BCL-2（108 bp）：上游5’- GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3’，下游5’- CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3’；BCL-X（108 bp）：上游5’- GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3’，下游5’-TCCATCTCCGATTCAGTCCCT3’；BAD（108 bp）：上游5’-CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG-3’，下 游 5’-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3’；BAK（108 bp）：上游5’-AGCAATGATCTGTTCACAACCG-3’，下 游 5’-CGCCATGTATAGCCCAGGC-3’；BAX（108 bp）：上游5’- CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3’，下 游 5’-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3’。反應在10l 的體系中進行，其中2×實時熒光定量PCR 混合液5l、10mol/L的上下游引物各0.2l、樣本cDNA1（l50ng）、高壓處理過的去離子水3.8l。熱循環(huán)如下：95 ℃5 min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，32 個循環(huán)；72℃5min。應用2- Ct法分析mRNA 相對表達水平。

1.2.2 CSF1 蛋白表達檢測 采用免疫印跡法檢測CSF1 蛋白在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達情況。采用含有蛋白酶抑制劑RIPA蛋白裂解液，按照說明書提取細胞內(nèi)總蛋白量。采用BIO-RAD 凝膠電泳系統(tǒng)，置于足量的電泳液中，根據(jù)測得的蛋白濃度上樣，10%SDS-PAGE 膠電泳，恒壓80 V，90 min；電泳結束，將樣品轉(zhuǎn)移至NC 膜，恒流220mA，持續(xù)90min。用PBS 配置5%脫脂牛奶，室溫封閉1h，然后用PBS配置2%牛血清白蛋白按相應濃度稀釋抗體，4 ℃輕搖孵育過夜。第2天，回收一抗，用含有0.1%Tween-20的TBST 洗NC 膜5 min，洗3 次；使用PBS 配制2%BSA，稀釋二抗，NC膜室溫孵育二抗1h，然后用含有0.1%Tween-20 的TBST 洗NC 膜5 min，共3 次。凝膠圖像采集及分析：采用CCD 攝像頭，Quantity One凝膠圖像處理系統(tǒng)，分析得出蛋白表達水平。

1.2.3 慢病毒shCSF1 制備 1.5×106293T 細胞接種到10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，加入10 ml DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS）中；24h后，將質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G和目的基因敲除shRNA 質(zhì)粒（敲除組）或?qū)φ战M質(zhì)粒，按照3∶1∶4 比例分別加入1.5ml無菌EP管中，再加入2.5mmol/L 氯化鈣50l，并用滅菌水補至500l，吹打混勻；將配置好的混合液逐滴加入500l 2×HBS，放置于室溫靜置30min。將上述混合液緩慢、逐滴加入至293T 細胞培養(yǎng)液中，4 h 后，換液，用10 ml 新鮮DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS）更換原培養(yǎng)液；48 h 后，收取該293T 培養(yǎng)液上清液即慢病毒上清液。

1.2.4 構建CSF1 敲除的子宮內(nèi)膜腺癌細胞系 將1×105/ml 子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa 細胞，接種至6 孔板，24 h后棄去孔內(nèi)原先培養(yǎng)基，將對照組及shCSF1慢病毒上清液加入孔內(nèi)，37 ℃2 000 r/min 離心感染2 h，用實時熒光定量PCR 法和免疫印跡法檢測感染shRNA 后CSF1 mRNA 和蛋白表達水平，檢測shCSF1 敲除效率。采用流式細胞儀，分選綠色熒光蛋白陽性細胞，并繪制細胞增殖曲線檢測細胞增殖情況。

1.2.5 細胞凋亡染色 1×106子宮內(nèi)膜癌細胞，1000 r/min 離心5 min，棄上清液；用1×緩沖液（100l）重懸細胞，加入2l Annexin V 和PI，室溫下避光孵育30 min。1 000 r/min 離心5 min 沉淀細胞，1×緩沖液洗1 次，立即用流式細胞儀檢測分析。

1.2.6 BAX特異性抑制劑BAI1 處理子宮內(nèi)膜癌細胞 BAX 特異性抑制劑BAI1 用DMSO 溶解，處理子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa 細胞濃度為1m，作用時間為24 h。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用GraphPadPrism7 軟件制作數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析圖，實驗數(shù)據(jù)均來自3 個以上獨立樣本，每個樣品至少獨立重復3 次結果，兩組比較采用獨立樣本t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析與Tukey 多重檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CSF1 在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達情況 子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa細胞的CSF1 表達水平均高于正常內(nèi)膜細胞系及其他腫瘤細胞，而在mRNA表達水平上，子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa 中CSF1 相對表達水平均高于正常內(nèi)膜細胞ECC、MCF-7、SGC-7901、HELA 及SW620（均P ＜0.05），見圖1 ～2。

圖1 CSF1 在腫瘤細胞中蛋白表達水平

圖2 CSF1 在腫瘤細胞中mRNA 表達水平

2.2 敲除CSF1 可誘導子宮內(nèi)膜癌細胞增殖抑制敲除CSF1 子宮內(nèi)膜癌細胞系，構建2 條shCSF1 慢病毒載體，感染子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa后，發(fā)現(xiàn)CSF1 mRNA 及蛋白表達水平均呈現(xiàn)下降趨勢（均P＜0.05），見圖3 ～4。同時獲取CSF1 敲除的子宮內(nèi)膜癌細胞系，并對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖速率進行監(jiān)測，與對照組細胞相比，CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜腺癌細胞增殖受到抑制，見圖5。

圖3 靶向CSF1-特異性shRNA蛋白水平敲除效率

圖4 靶向CSF1-特異性shRNA mRNA 水平敲除效率

圖5 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細胞增殖曲線

2.3 敲除CSF1 可誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡 與對照組細胞相比，CSF1 敲低組Ishikawa細胞中細胞凋亡的水平上調(diào)，shCSF1-#1 和shCSF1-#2 組細胞凋亡率分別為45.04%和18.84%，均高于對照組Scramble組的3.32%（均P ＜0.05），見圖6 ～7。

圖6 子宮內(nèi)膜癌細胞敲除CSF1 后凋亡水平染色

圖7 子宮內(nèi)膜癌細胞敲除CSF1 后凋亡水平

2.4 CSF1 通過激活凋亡促進因子BAX 誘導子宮內(nèi)膜癌凋亡 結果顯示凋亡促進因子BAX 在CSF1敲除子宮內(nèi)膜癌細胞中表達水平升高，見圖8；利用BAX 特異性抑制劑BAI1，加入CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜癌細胞培養(yǎng)基中，CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜癌細胞生長抑制得到緩解，見圖9；流式細胞染色結果也顯示在加入BAX特異性抑制劑后，CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡水平受到抑制（P＜0.05），見圖10 ～11。

圖8 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡相關基因表達

圖9 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細胞加入BAX特異性抑制劑后細胞增殖曲線

圖10 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細胞加入BAX 特異性抑制劑后凋亡水平染色

圖11 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細胞加入BAX 特異性抑制劑后凋亡水平

3 討論

集落刺激因子家族是一類廣泛參與機體免疫反應過程的細胞生長因子。以往的研究顯示CSF1 常表達于免疫相關細胞中，作為一類分泌性蛋白生長因子，參與調(diào)控多種免疫反應。其主要功能是通過識別免疫相關細胞表面特異性的受體蛋白，向免疫相關細胞內(nèi)傳遞免疫抑制性信號，誘導免疫細胞功能及活性抑制，維持機體內(nèi)免疫系統(tǒng)動態(tài)平衡。但是這種調(diào)控方式一方面可維持機體正常的免疫功能，而在特殊環(huán)境中，如腫瘤微環(huán)境中，可造成腫瘤細胞免疫逃逸，誘發(fā)機體腫瘤發(fā)生。有研究報道，CSF1 在腫瘤細胞中也呈現(xiàn)差異性表達，CSF1 對腫瘤干細胞在體內(nèi)外自我更新能力的維持具有重要作用[10]。相關研究顯示CSF1 也在神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)及各類型腫瘤組織等不同組織來源的細胞中表達[11]，但其在這些細胞中，特別是在腫瘤干細胞中的作用、功能及調(diào)控機制尚未闡明[12]。

有研究顯示，mir-1254 通過抑制CSF1 表達，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲、遷移及誘導腫瘤細胞凋亡[13]。而在肺癌中，也有研究者發(fā)現(xiàn)抑制CSF1 表達可顯著抑制肺癌細胞的骨轉(zhuǎn)移過程[9]。而在乳腺癌細胞中CSF1 高表達可以誘導腫瘤相關巨噬細胞，并促進乳腺癌的侵襲與遷移[14]。Aharinejad 等[15]研究顯示，乳腺癌患者血清中CSF1 水平越高，患者預后越差。而現(xiàn)有的關于CSF1 對腫瘤細胞的作用機制研究主要集中在CSF1 家族成員參與免疫調(diào)節(jié)方面的作用[16]，但其針對CSCs本身功能和調(diào)控機制的研究較少，因而進一步剖析CSF1 在CSCs 中的功能及其調(diào)控機制，對于臨床治療腫瘤具有重要意義。

本研究結果顯示CSF1 在子宮內(nèi)膜癌細胞中高表達；同時利用特異性shCSF1 慢病毒敲除技術靶向下調(diào)CSF1 表達，敲除組Ishikawa 細胞生長減慢，腫瘤細胞凋亡。這揭示了CSF1 誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，抑制其增殖。而在機制上，本研究發(fā)現(xiàn)CSF1-BAX 信號通路調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡過程，同時發(fā)現(xiàn)其它凋亡相關BCL 家族蛋白成員，在CSF1 敲除后，也發(fā)生了變化，但是具體調(diào)控機制并不清楚；而凋亡相關BCL 家族蛋白成員多數(shù)位于線粒體內(nèi)，與線粒體功能密切相關。CSF1 敲除誘導的子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡是否與其細胞內(nèi)線粒體功能變化相關，是否會引起線粒體相關的代謝調(diào)控變化，是否能利用BCL 家族特異性抑制劑靶向殺傷腫瘤細胞或與常規(guī)化療藥物聯(lián)合用藥，克服臨床放化療耐受或腫瘤細胞免疫逃逸及腫瘤復發(fā)等瓶頸，上述3 方面將是后續(xù)探究CSF1 在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)控機制的重要方向。另一方面，腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了腫瘤細胞內(nèi)在因素外，腫瘤微環(huán)境也是調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞的重要因素，目前研究主要集中在CSF1 蛋白家族成員參與免疫調(diào)節(jié)方面[16]，因而進一步剖析CSF1 在腫瘤微環(huán)境中對CSCs 的調(diào)控機制，也將是后續(xù)的重要研究方向。