李超友,趙如華,霍蓉花,倪 濤,薛 剛,吳靖芳

0 引 言

甲狀腺癌是頭頸部和內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,死亡率雖然很低,但發(fā)病率和復(fù)發(fā)率在世界范圍內(nèi)不斷增加[1-2]。分化型甲狀腺癌 (differentiated thyroid carcinoma,DTC)的快速增長主要是由甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)所驅(qū)動[3-4]。大約27%～80%的PTC患者可發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(lymph node metastasis,LNM),是局部復(fù)發(fā)的重要危險因素[5-6]。

載脂蛋白是多功能蛋白質(zhì),可作為脂蛋白組裝的模板,還是血循環(huán)中主要脂質(zhì)(膽固醇、甘油三酯和磷脂)的運(yùn)輸載體[7]。異常的脂質(zhì)生物合成與惡性腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和誘導(dǎo)腫瘤血管生成有關(guān)[8]。載脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)主要在肝中合成,并在大腦、脾、腎以及巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中產(chǎn)生[9-10]。它由299個氨基酸組成,具有三個主要等位基因:APOE-ε2、APOE-ε3和 APOE-ε4[5]。APOE作為蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的多功能復(fù)合物,主要參與脂質(zhì)代謝和體內(nèi)平衡,并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長因子的產(chǎn)生影響血管生成、腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[11]。來自巨噬細(xì)胞的APOE是參與將脂質(zhì)輸送至腫瘤細(xì)胞以及壞死區(qū)域巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)再循環(huán)的主要成分[12]。研究表明,APOE的過度表達(dá)與結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌和間變性甲狀腺癌等惡性行為有關(guān)[10]。Luo等[12]認(rèn)為非小細(xì)胞型肺癌患者APOE水平升高,與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān),表明APOE可作為評估非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展有用的臨床生物標(biāo)志物。然而,APOE在PTC中的表達(dá)譜和功能尙不明確。APOE在PTC發(fā)生及進(jìn)展中的表達(dá)譜和功能尙不明確。本研究旨在探討APOE在PTC發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LNM)中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2019年9月至2022年9月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科收治的161例接受甲狀腺切除術(shù)(全切或部分切除)術(shù)后病理診斷為PTC患者(PTC組)的臨床資料。其中男17例,女144例,年齡27～76歲,平均年齡(49.97±10.77)歲。31例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者為對照組,其中男3例,女28例,平均年齡(52.42±12.96)歲。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果將PTC患者分為LNM組(PTC伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,n=51)和單純PTC組(PTC不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,n=110)。LNM組中男3例,女48例,平均年齡(47.41±12.39)歲;單純PTC組中男14例,女96例,平均年齡(51.15±9.76)歲。按照APOE中位數(shù)水平將PTC組分為:高水平組(>128.90 ng/L,n=80),低水平組(≤128.90 ng/L,n=81)。入選標(biāo)準(zhǔn):①首次就診;②經(jīng)組織病理學(xué)診斷為PTC或結(jié)節(jié)性甲狀腺腫;③均自愿接受甲狀腺切除術(shù)(全切或部分切除)及淋巴結(jié)清掃術(shù);④術(shù)前實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢查、電子病歷資料及術(shù)后病理結(jié)果無缺失;⑤癌癥分期診斷符合美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)甲狀腺癌分期系統(tǒng)(第8版,2017年);⑥血漿標(biāo)本保存完好,無溶血現(xiàn)象。排除標(biāo)準(zhǔn):①既往甲狀腺手術(shù)史;②既往服用降血脂藥物;③既往接受抗甲狀腺藥物、L-甲狀腺素替代或抑制治療或任何可能引起甲狀腺功能變化的藥物(雌激素、雄激素、鋰、糖皮質(zhì)激素等);④臨床或亞臨床甲狀腺功能減退癥或甲狀腺功能亢進(jìn)癥;⑤放射性碘治療史或頭頸部輻射暴露史;⑥其他組織病理學(xué)的THCA,如甲狀腺髓樣癌(MTC)或甲狀腺未分化癌(ATC);⑦懷孕或哺乳婦女;⑧合并其他原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤。本研究已獲得河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:W2022036),患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 臨床資料收集詳細(xì)記錄所有研究對象的一般資料:包括年齡、性別等基線資料,采集入選患者術(shù)前晨起空腹肘靜脈血,檢測脂代謝相關(guān)指標(biāo):甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCHO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、載脂蛋白A1(APOA1)、載脂蛋白B(APOB)、載脂蛋白a[LP(a)],術(shù)后組織病理報告包括原發(fā)腫瘤單雙側(cè)、多灶性(2個或2個以上腫瘤)、腫瘤最大徑(cm)、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目、臨床分期。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)用于檢測對照組和PTC組患者血漿APOE蛋白濃度。使用商業(yè)ELISA試劑盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd),嚴(yán)格按照試劑盒所附說明進(jìn)行,10 min內(nèi)使用全波長酶標(biāo)儀(Multiskan SkyHigh,Thermo Fisher Scientific)在450 nm下測量APOE蛋白的吸光度值(A值)。以時間為橫坐標(biāo),以A值為縱坐標(biāo),繪制APOE的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算其濃度水平。

1.2.3TIMER(Tumor Immune Estimation Resource)數(shù)據(jù)庫分析APOE在甲狀腺癌中的表達(dá)情況①TIMER數(shù)據(jù)庫分析APOE表達(dá)水平:在TIMER數(shù)據(jù)庫差異表達(dá)模塊輸入框中輸入基因名稱APOE,選擇泛癌分析,獲得AOPE基因在泛癌組織與癌旁正常組織中的差異表達(dá)情況;②TIMER數(shù)據(jù)庫分析APOE基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性:通過TIMER數(shù)據(jù)庫Gene模塊獲得APOE在甲狀腺癌中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性,包括腫瘤純度、B細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 對照組和PTC組APOE及脂代謝指標(biāo)比較PTC組APOE水平明顯高于對照組(P<0.05),HDL-C、APOA1低于對照組(P<0.05)。見表1。

表 1 入組患者APOE及脂代謝指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of APOE and lipid metabolism indexes between PTC group and benign control group

2.2PTC發(fā)生的影響因素納入APOE及脂代謝指標(biāo)等構(gòu)建多因素Logistic回歸方程,結(jié)果發(fā)現(xiàn):APOE是PTC發(fā)生的危險因素(P=0.022)。見表2。

表 2 Logistic回歸分析PTC發(fā)生的影響因素Table 2 Logistic regression analysis of factors affecting the occurrence of PTC

2.3血漿APOE預(yù)測PTC發(fā)生的價值A(chǔ)POE預(yù)測PTC發(fā)生的AUC為0.639,診斷臨界值為109.99 ng/L,靈敏度為81.4%,特異度為48.4%,表明APOE具備作為預(yù)測PTC進(jìn)展生物標(biāo)志物的趨勢,具有一定的臨床指導(dǎo)意義。見圖1。

圖 1 血漿APOE預(yù)測PTC發(fā)生的ROC曲線Figure 1 ROC curve of plasma APOE predicting PTC occurrence

2.4單純PTC組和LNM組APOE及脂代謝指標(biāo)比較兩組年齡、APOE、LDL-C、APOA1、APOB、LP(a)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),LNM組APOE水平明顯高于單純PTC組(P=0.022)。見表3。

表 3 PTC患者LNM組和單純PTC組APOE及脂代謝指標(biāo)比較Table 3 Comparison of APOE and lipid metabolism indexes between LNM group and pure PTC group

2.5PTC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素Logistic多因素回歸分析顯示:APOE水平升高將增加PTC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(P<0.05);年齡越小,PTC患者發(fā)生LNM的可能性越大(P<0.05);LP(a)對PTC發(fā)生LNM具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表 4 Logistic回歸分析PTC發(fā)生LNM的影響因素Table 4 Logistic regression analysis of the influencing factors of LNM in PTC

2.6APOE低水平組與高水平組脂代謝指標(biāo)和臨床病理參數(shù)比較高水平組和低水平組之間淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)。見表5。

表 5 PTC患者血漿載脂蛋白E高水平組和低水平組相關(guān)指標(biāo)比較Table 5 Comparison of relevant indicators between the high level group and low level group of APOE

2.7影響APOE水平的危險因素淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目為自變量,以APOE水平為因變量,多因素Logistic回歸分析顯示:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多,APOE的水平越高(OR=1.286,95%CI:1.033～1.602,P<0.05),表明轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目是影響APOE水平的獨(dú)立危險因素。

2.8TIMER數(shù)據(jù)庫分析APOE在泛癌的表達(dá)及與THCA免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系與癌旁正常組織相比,APOE在甲狀腺癌(THCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、膽管癌(CHOL)、食管癌(ESCA)、頭頸部鱗癌(HNSC)、肝細(xì)胞癌(LIHC)、前列腺癌(PRAD)、胃腺癌(STAD)、結(jié)腸腺癌(COAD)、胰腺癌(PAAD)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)及子宮內(nèi)膜癌(UCEC)癌癥中高表達(dá)(P<0.01) ;在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)、肺鱗癌(LUSC)及皮膚黑色素瘤(SKCM)癌癥中低表達(dá)(P<0.05),見圖2;APOE在THCA中與B細(xì)胞(r=0.308)、中性粒細(xì)胞(r=0.243)、CD8+T細(xì)胞(r=0.089)、CD4+T細(xì)胞(r=0.098)、巨噬細(xì)胞(r=0.121)、樹突狀細(xì)胞(r=0.266)表達(dá)呈正相關(guān),與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.008),均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001圖 2 APOE在泛癌和癌旁正常組織中的差異性表達(dá)Figure 2 Differential expression of APOE in pan-carcer and adjacent normal tissues

3 討 論

癌癥與代謝紊亂密切相關(guān),細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累與抑制脂質(zhì)存儲機(jī)制之間失衡是癌癥的特征之一[13-14]。APOE作為一種重要的血漿脂蛋白,參與調(diào)節(jié)體循環(huán)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),并在腫瘤微環(huán)境中與炎性因子和抗癌T細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)炎癥性免疫應(yīng)答,同時介導(dǎo)脂蛋白顆粒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,影響抗凋亡信號、血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖[10,15]。Liu等[16]報道肺腺癌LNM患者APOE濃度升高。本研究發(fā)現(xiàn)PTC及LNM患者的血漿APOE升高增加了PTC發(fā)生風(fēng)險和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性。多因素Logistic回歸分析顯示,血漿APOE高表達(dá)可作為PTC及LNM的獨(dú)立危險因素。血漿APOE與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯相關(guān),提示高水平血漿APOE增加LNM的風(fēng)險,與晚期和高危PTC密切相關(guān),符合APOE在其他惡性腫瘤的趨勢性。我們猜想APOE的激活限制了固有免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞增殖的抑制,從而促進(jìn)多種類型癌癥的腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[11]。

脂質(zhì)代謝紊亂是許多癌癥的共同特征和危險因素,包括THCA[17]。血脂異常尤其是TCHO和LDL-C在甲狀腺疾病中很常見[18]。Revilla等[13]證實(shí)侵襲性惡性腫瘤患者的血清LDL-C和APOB明顯降低。本研究脂代謝指標(biāo)LDL-C、APOB和LP(a)在LNM組和單純PTC組差異顯著,且PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的LDL-C、APOB、LP(a)水平更低。Raisa等表示存在甲狀腺結(jié)節(jié)的患者HDL-C水平更低[19]。本研究PTC組存在更低水平的HDL-C,并且與PTC的發(fā)生呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)趨勢,根據(jù)Kim等[20]報道:HDL-C通過減少外周組織的氧化應(yīng)激來抑制腫瘤發(fā)生密切相關(guān),為HDL-C作為保護(hù)因素提供了證據(jù)。APOA1在PTC組以及LNM組與單純PTC組表現(xiàn)出的差異性,且APOA1在PTC組及LNM組處于更低水平,與Ma等[17]報道血清APOA1與PTC患者負(fù)相關(guān)結(jié)果一致。

癌癥的發(fā)生常伴隨著腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤。部分免疫細(xì)胞(髓樣抑制性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷性細(xì)胞)有助于形成惡性表型的腫瘤間質(zhì)[21]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)廣泛浸潤于多種腫瘤間質(zhì),通過腫瘤免疫逃逸和血管生成,促進(jìn)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[22]。接觸癌細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞因抗原遞呈能力受阻而導(dǎo)致T細(xì)胞激活失敗[21]。王彰驕等[23]認(rèn)為升高的樹突狀細(xì)胞與食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展密切相關(guān),腫瘤免疫抑制微環(huán)境可能是導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞功能障礙的重要原因。本研究通過TIMER數(shù)據(jù)庫泛癌研究結(jié)果顯示APOE不僅在THCA中高表達(dá),還在BRCA、CHOL、ESCA、HNSC、LIHC、PRAD、STAD、COAD、PCPG及UCEC中高表達(dá)。甲狀腺癌中的APOE表達(dá)水平與B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的表達(dá)顯著相關(guān)?？梢夾POE除執(zhí)行脂代謝功能外,還具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能[24]。所以推測甲狀腺癌中高表達(dá)的APOE可能是通過某種信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)免疫浸潤細(xì)胞向促腫瘤表型轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述,高水平血漿APOE是預(yù)測PTC發(fā)生LNM的獨(dú)立危險因素,具備作為評估PTC發(fā)生及進(jìn)展的新型生物標(biāo)志物的潛力。靶向APOE調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移在難治性THCA免疫治療策略具有巨大的臨床潛力。由于本研究樣本數(shù)量少,存在一定的局限性,如未研究APOE具體表型對PTC及LNM的作用,APOE在PTC中的免疫機(jī)制有待進(jìn)一步探究。