王小云　孫紅艷　史夢　于佳

摘要：以黃瓜乙烯響應(yīng)因子CsERF7轉(zhuǎn)錄本為研究對象，通過外源硒緩解黃瓜鎘脅迫試驗分析其表達(dá)及黃瓜生長狀況，并克隆CsERF7基因，構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，同時分析CsERF7的理化性質(zhì)和功能。結(jié)果表明，外源硒顯著升高了鎘脅迫引起的黃瓜生長指標(biāo)的降低，CsERF7在鎘處理下的表達(dá)豐度是對照的56%，而鎘+硒比單獨鎘處理上調(diào)表達(dá)4.53倍，與RNA-seq結(jié)果相符，此基因可能在硒調(diào)控黃瓜鎘脅迫響應(yīng)中起作用。同時，成功構(gòu)建超表達(dá)載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP，轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因株系。生物信息學(xué)分析表明，黃瓜CsERF7基因?qū)儆贏P2/ERF家族的AP2亞家族，開放閱讀框ORF長度588 bp，編碼196個氨基酸，有1個AP2結(jié)構(gòu)域；該蛋白屬于非跨膜親水性蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測定位在線粒體中，存在22個氨基酸磷酸化位點；其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和延伸鏈構(gòu)成，與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果高度一致，所得蛋白序列與黃瓜、甜瓜同源性最高。

關(guān)鍵詞：黃瓜；ERF；基因克隆；過表達(dá)載體構(gòu)建；生物信息分析

中圖分類號：S642.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0046-07

黃瓜（Cucumis sativus）是世界范圍內(nèi)普遍種植的蔬菜，是我國設(shè)施蔬菜主要栽培種之一，在蔬菜產(chǎn)業(yè)中的地位十分重要；同時兼具清熱利水、健腦安神、潤膚美容等多種功效。我國城市食用黃瓜產(chǎn)地多位于城市近郊，這里同時也聚集較多的城市廢棄物，以及含重金屬的農(nóng)藥、化肥的大量使用，使得我國蔬菜質(zhì)量問題依然堪憂，其中包括鎘在內(nèi)的重金屬污染十分突出。重金屬鎘具有較高的可轉(zhuǎn)移性，能夠被植物的根部吸收，繼而轉(zhuǎn)運至地上部分可食器官并在植物中積累［1］；并通過食物鏈富集于人體引發(fā)多種疾病，嚴(yán)重威脅人類健康［2］。因此，治理土壤鎘污染，深入探討黃瓜鎘毒害及耐性的生理與分子機制，發(fā)掘耐鎘關(guān)鍵基因，培育耐鎘新品種已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)科學(xué)的研究熱點。

乙烯響應(yīng)因子ERF（ethylene-responsive factor）是植物界的一類轉(zhuǎn)錄因子，屬于植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物抗病、干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫中具有重要作用，該基因在不同植株中的超表達(dá)能夠提高其抗性［3］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及其相互間的序列相似性分為AP2、RAV和ERF 3個主要亞家族［4］，其中AP2蛋白在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中起著重要作用［5］；RAV家族蛋白在生物和非生物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用［6］；ERF亞家族成員對植物的生長發(fā)育以及逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)有著重要的調(diào)控作用，主要包括植物生長、果實發(fā)育、低溫和干旱脅迫等環(huán)境脅迫［7-8］。

在黃瓜轉(zhuǎn)錄因子ERF研究中，張慧敏等報道CsERF（登錄號：Csa7M448110）是黃瓜葉片中調(diào)控苦味形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［9］；CsERFs和CsHDAs基因表達(dá)水平與黃瓜果實冷害有一定的關(guān)系［10］；潘健等報道部分ERF基因家族成員參與雌花分化初期的基因表達(dá)調(diào)控［11］。至今，ERF轉(zhuǎn)錄因子與鎘脅迫相關(guān)的研究鮮見報道，因此本研究擬以前期通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法篩選獲得應(yīng)答鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄因子CsERF7為研究對象，驗證其與硒和鎘的調(diào)節(jié)作用關(guān)系，通過對目的基因的擴增，構(gòu)建CsERF7過表達(dá)載體，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最后利用農(nóng)桿菌花序法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株，為CsERF7功能的深入研究提供依據(jù)，為硒介導(dǎo)的黃瓜耐鎘機理研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

以黃瓜津研四號為研究材料，其種子購自太原市種子公司；哥倫比亞野生型擬南芥種子、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞均由武漢艾迪晶生物科技有限公司提供。所用化學(xué)試劑均采用普通分析純，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

黃瓜幼苗培養(yǎng)及生理指標(biāo)測定和RNA測序試驗于2021年10—12月進(jìn)行，實時熒光定量qPCR驗證、過表達(dá)載體及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化試驗于2022年3—5月進(jìn)行，所有試驗均在太原科技大學(xué)生物工程實驗室開展（RNA測序除外），具體試驗處理和方法如下。

1.2黃瓜幼苗的培養(yǎng)及處理

1.2.1黃瓜種子的處理先用2%的H2O2將黃瓜種子消毒20 min，再用蒸餾水沖洗干凈，并浸種2 h后置于22 ℃/18 ℃生長室內(nèi)砂床發(fā)芽。

1.2.2黃瓜幼苗水培試驗設(shè)計及分析測定項目黃瓜幼苗長至2葉1心期，選生長均勻一致的黃瓜植株移苗至水培溶液中放置在溫室內(nèi)培養(yǎng)。水培容器為3 L水桶，每桶盛培養(yǎng)液2.5 L，每桶6穴，每穴2株，海綿固定。營養(yǎng)液pH值調(diào)至5.8±0.1，基本培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)7 d后進(jìn)行鎘、硒處理：對照（CK，基本培養(yǎng)液）、3 μmol/L Se、50 μmol/L Cd、50 μmol/L Cd+3 μmol/L Se，并分別記作CK、Se、Cd、Cd+Se，各處理隨機排列，重復(fù)3次；24 h保持通氣，每隔5 d更換培養(yǎng)液。處理10 d后各處理間有了顯著差異，收集葉片，清洗表面灰塵，并在液氮中迅速冷凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中備用；并分析測定黃瓜株高、根長、SPAD值和生物量［12-13］。

1.3RNA-seq高通量測序

采用Illumina HiSeqTM高通量測序平臺在北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行黃瓜葉片RNA-seq測序，原始序列過濾后得到clean reads。選取HISAT軟件將過濾后的測序序列進(jìn)行基因組定位分析；經(jīng)過組裝、比較，新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測；最后，采用HTSeq軟件union模型對各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，采用DEGSeq軟件對構(gòu)建的基因作差異分析，差異基因篩選的閾值設(shè)置為q值<0.005，然后篩選硒和鎘處理黃瓜幼苗中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。結(jié)合差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的q值及在葉片中的基因表達(dá)豐度值，最終選取CsERF7作為本研究對象。

1.4實時熒光定量qPCR驗證

根據(jù)GenBank中β-actin基因（登錄號：XM_011659465）和測序后轉(zhuǎn)錄本CsERF7的序列（登錄號：Csa7G432080），利用Primer BLAST在線設(shè)計特異性熒光定量PCR所用引物。引物序列分別為β-actin，F(xiàn)：5′-GAATCCAGCACGATACCA-3′，R：5′-TCAACCCAAAGGCTAACA-3′，預(yù)計擴增長度為136 bp；CsERF7，F(xiàn)：5′-CCGAGCTACCTCGCATACAG-3′，R：5′-TCCGAGGTCTAGCAGCTCTT-3′，預(yù)計擴增長度為228 bp。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

總RNA的提取采用上述各處理的冷凍葉片，用液氮研磨后采用Trizol法提取，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合超微量紫外可見分光光度計檢測濃度、純度及完整性。cDNA的合成嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書執(zhí)行。PCR反應(yīng)體系為25 μL，單管含有12.5 μL 2×SYBR green，各0.2 μL上游和下游引物，11.1 μL ddH2O和1 μL cDNA模板。熒光定量PCR在CFX 實時熒光PCR檢測系統(tǒng)（BioRAD）里進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40次。每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。cDNA產(chǎn)物用Actin引物作參照用于定量RT-PCR，對照（CK）的表達(dá)設(shè)為1。

1.5過表達(dá)載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP的構(gòu)建

CsERF7基因引物設(shè)計方法和合成公司同上，并在上下游兩端分別加上保護(hù)堿基和EcoRⅠ、HindⅢ 限制性內(nèi)切酶酶切位點（下劃線處序列）。引物序列為F：5′-ACTAGGGTCTCGCACC ATGGCTCGTCCACAACAACG-3′，R：5′-ACTAGGGTCTCTGCC TGTAATAATTTCGAATGATCCGAGGT-3′，預(yù)計擴增片段長度為588 bp。

采用上述引物和cDNA模板進(jìn)行目的片段擴增并回收，與改造后的載體pEGOEP35S-H 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌、菌檢、提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果序列與目的片段序列比對一致，即為該過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

取100 μL冰凍的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，加5 μL上述質(zhì)粒DNA；迅速轉(zhuǎn)入37 ℃解凍；在 37 ℃ 溫浴5 min（無振蕩）；加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，28 ℃、260 r/min振蕩，預(yù)表達(dá)2～4 h；取適當(dāng)體積均勻涂布于含有抗生素的LB平板；28 ℃ 培養(yǎng)2～4 d，即可觀察到轉(zhuǎn)化子。

挑取單菌落克隆到5 mL LB培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24～40 h，作PCR驗證，挑取陽性PCR的克隆1個，將此菌液取100 μL加入100 μL 30%甘油（提前滅菌）。充分渦旋混勻，室溫放置數(shù)小時，每30 min到1 h混勻1次。最后儲藏于-80 ℃待用。

1.7農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

首先，將哥倫比亞野生型擬南芥播種之后用保鮮膜覆蓋達(dá)到保溫保濕的效果。待擬南芥長出2張真葉時移栽，移栽后的苗用保鮮膜保濕3～4 d即可揭去保鮮膜，1個月左右蓮座葉可以覆蓋塑料杯，此時幼苗的澆水量要適中。當(dāng)生長至第1次抽莖產(chǎn)生第1輪花蕾時，摘去該花蕾，在短日照的情況下讓擬南芥營養(yǎng)生長，在侵染1周左右可將其置于長日照下，當(dāng)其旁支的第2花蕾的枝條長2～10 cm時進(jìn)行浸染。取出上述-80 ℃保存的含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌室溫解凍后浸染花序，第1次侵染前要去除已長出的角果，第1次侵染之后隔1周侵染1次，侵染2～3次，侵染之后植株不能缺水；每次浸染后用塑料薄膜套袋24 h，取掉薄膜后用去離子水洗去殘余菌液，大約3周后等擬南芥角果泛黃干燥后收種子。

將T0種子用75%乙醇洗30 s左右，之后用無菌水清洗2次，再用30%次氯酸鈉浸泡10 min左右，用無菌水洗2～3次，用無菌水浸泡1 h后，用01%的瓊脂水溶液懸浮后，轉(zhuǎn)移至含潮霉素的MS篩選培養(yǎng)基。待擬南芥長出2張真葉且長勢較好時移栽，移栽后的苗用保鮮膜保濕3～4 d即可揭去保鮮膜，適量澆水，1個月左右蓮座葉可以覆蓋塑料杯。約1個月后，待擬南芥長到一定大小之后用CTAB法提取DNA，進(jìn)行PCR檢測。

1.8生物信息學(xué)分析

使用BLAST對黃瓜CsERF7基因編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比對；使用Prot-Param分析CsERF7基因基本理化性質(zhì)；利用在線工具NCBI-CDS里的SMART軟件預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件NetPhos 3.1分析ERF7蛋白的潛在磷酸化位點；利用PSORT Ⅱ預(yù)測ERF7蛋白的亞細(xì)胞定位；通過SignalP 4.1 Server在線工具進(jìn)行信號肽預(yù)測分析，在線軟件TMHMM 2.0預(yù)測跨膜螺旋區(qū)，SOPMA預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，使用ProtScale分析蛋白質(zhì)的親疏水性。利用MEGA 11軟件，采用NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用BioAider V1.423軟件進(jìn)行序列相似性分析。

2結(jié)果與分析

2.1RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

由表1可知，RNA-seq-CsERF7在鎘處理組和鎘+硒復(fù)合處理組中的表達(dá)豐度非常高，其中鎘處理表達(dá)豐度為對照的2.104倍，鎘+硒處理表達(dá)豐度為單獨鎘處理的5.600倍，推測其可能在外源硒介導(dǎo)的黃瓜耐鎘脅迫中扮演著重要的角色。因此，選擇CsERF7作為后續(xù)研究對象。

2.2外源硒對鎘脅迫下黃瓜幼苗生長的影響

黃瓜幼苗在50 μmol/L Cd處理5 d后受到了顯著的抑制，主要表現(xiàn)為植株矮化，葉片發(fā)黃（圖1-a）；根長比對照顯著下降36.64%，地上部和根系干質(zhì)量分別比對照下降了31.32%和33.57%，其中根長受到的影響尤為嚴(yán)重。3 μmol/L外源硒（Cd+Se處理）顯著緩解了50 μmol/L Cd引起的黃瓜幼苗毒害癥狀，SPAD值較單一鎘處理上升9.61%，同時增加黃瓜生物量積累，對根長和根系干質(zhì)量的緩解效果最為明顯；在無鎘條件下添加硒對黃瓜幼苗的生長沒有顯著效應(yīng)（圖1-b）。進(jìn)一步表明，外源亞硒酸鈉能顯著緩解鎘脅迫下黃瓜受到的毒害現(xiàn)象。

2.3CsERF7 qPCR鑒定結(jié)果

為驗證RNA-seq測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，對CsERF7進(jìn)行qPCR鑒定。由圖2-a可知，鎘處理CsERF7表達(dá)豐度是對照的56%；而鎘+硒復(fù)合處理與單獨鎘處理相比表達(dá)豐度顯著升高，比單獨鎘處理上調(diào)表達(dá)4.53倍。此表達(dá)結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果完全相符。

2.4黃瓜CsERF7基因擴增

提取黃瓜幼苗鎘+硒處理的葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增后電泳檢測出約588 bp的條帶，說明已成功擴增出黃瓜CsERF7基因編碼區(qū)序列（圖2-b）。

2.5黃瓜過表達(dá)載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP的構(gòu)建

將上述目標(biāo)基因片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒并使用EcoRⅠ和HindⅢ 對表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定（圖2-c）；電泳檢測后觀察到預(yù)期目的片段793 bp的條帶。經(jīng)測序比對，序列結(jié)果與已知的CsERF7基因序列完全匹配。

2.6擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化研究

利用凍融法將載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，以花序浸染法進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，依次經(jīng)過質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，擬南芥培養(yǎng)、浸染、篩選培養(yǎng)、潮霉素抗性基因的PCR檢測后獲得T1代擬南芥轉(zhuǎn)基因種子（圖3）。

2.7CsERF7生物信息學(xué)分析

2.7.1CsERF7基因編碼氨基酸序列分析序列分析結(jié)果表明，CsERF7基因可編碼196個氨基酸（圖4-a），相對分子量為22 393.94 u；在線ProtParam軟件預(yù)測CsERF7蛋白理論等電點為6.35，原子總數(shù)為3 080，分子式為C980H1 503N287O302S8，相對分子量為22 393.94 u，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）21個，帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）18個，脂肪指數(shù)67.81，總平均親水性預(yù)測為-0.753，屬于親水蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為53.24，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.7.2黃瓜ERF7蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析對黃瓜ERF7蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明，該蛋白屬于AP2/ERF家族、 AP2亞家族， 在多肽鏈的N端第7～70位氨基酸之間存在AP2結(jié)構(gòu)域，代表DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，無其他特征（圖4-a）。

2.7.3黃瓜ERF7蛋白質(zhì)信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析對黃瓜ERF7蛋白進(jìn)行信號肽分析， 發(fā)現(xiàn)該蛋

白質(zhì)無信號肽，屬于非分泌型蛋白。利用軟件TMHMM 2.0對黃瓜ERF7蛋白的跨膜螺旋區(qū)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)跨膜螺旋區(qū)，表明該蛋白屬非跨膜蛋白。

2.7.4黃瓜ERF7磷酸化位點、亞細(xì)胞定位分析在黃瓜轉(zhuǎn)錄因子ERF7蛋白中，共有22個磷酸化位點，其中16個絲氨酸（S）磷酸化位點、4個酪氨酸（Y）磷酸化位點、2個蘇氨酸（T）磷酸化位點。黃瓜ERF7蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，黃瓜ERF7蛋白65.2%的概率分布在線粒體中，其次分布在細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中也有分布（表2）；推測黃瓜ERF7轉(zhuǎn)錄因子定位于線粒體中。

2.7.5黃瓜ERF7空間結(jié)構(gòu)與親疏水性分析黃瓜ERF7蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，此蛋白包括103個無規(guī)卷曲，占52.55%；71個α-螺旋，占3622%；15個延伸鏈，占7.65%；7個β-轉(zhuǎn)角，占357%（圖4-a、表3）。

采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，在11個相關(guān)蛋白模板的基礎(chǔ)上構(gòu)建出的三級結(jié)構(gòu)模型見圖4-b，其中螺旋部位代表α-螺旋，其余部位代表延伸鏈，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)高度一致。從圖4-b可以看出，此模型的全球性模型質(zhì)量估測結(jié)果（GMQE值）為0.18，序列相似性為53.03%，模型結(jié)果可信。

采用ProtScale分析蛋白質(zhì)親疏水性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsERF7蛋白質(zhì)的疏水性最大值1.556在84位點，最小值 -3.256 在158和159位點，平均親水性（GRAVY）為-0.788（圖5）。根據(jù)GRAVY數(shù)值為負(fù)可推測黃瓜ERF7蛋白為親水性蛋白，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

2.7.6CsERF7基因同源性對比分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將黃瓜CsERF7基因的編碼區(qū)（CDS）序列同源性相近的20個物種（表4）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果（圖6）顯示，CsERF7基因編碼區(qū)序列與黃瓜XP_011659507.1在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上最親密，其次是甜瓜KAA0062846.1和XP_008461170.1，在同一分支下的還有南瓜、西葫蘆、冬瓜，說明它們之間的親緣關(guān)系較近；其余的赤豆、木豆等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3討論與結(jié)論

本研究利用前期轉(zhuǎn)錄組試驗數(shù)據(jù)庫，通過克隆成功獲得了CsERF7基因的開放閱讀框（ORF）全長，序列分析結(jié)果表明，CsERF7含有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，ORF全長588 bp，編碼196個氨基酸，屬于AP2/ERF家族的AP2亞家族；黃瓜ERF7有1個絲氨酸（S）磷酸化位點，推測其在ERF7蛋白功能中發(fā)揮作用；該基因與黃瓜XP_011659507.1親緣關(guān)系最近，其次是甜瓜KAA0062846.1和 XP_008461170.1。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將CsERF7基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在外源硒對鎘脅迫下黃瓜幼苗生長狀態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，外源硒顯著緩解了黃瓜鎘脅迫現(xiàn)象；預(yù)測黃瓜CsERF7可能與解毒、耐鎘等生物學(xué)功能相關(guān)。

目前，有關(guān)ERFs在黃瓜上的研究有AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控黃瓜苦味基因Bi的表達(dá)［9］，也有ERFs參與調(diào)控黃瓜果實貯藏冷害機制［10］，調(diào)控黃瓜果實貯藏冷害及其與膜脂代謝關(guān)系的研究［14］；另外， 蒙林平通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， ERFs在油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)黃瓜幼苗疫病的抗性方面發(fā)揮作用［15］，隨后有報道稱ERFs在外源油菜素內(nèi)酯介導(dǎo)的黃瓜耐鹽性方面起調(diào)控作用［16］， ERFⅦ在調(diào)控黃瓜耐澇性的分子機制方面發(fā)揮重要作用［17］，但ERFs在調(diào)控黃瓜耐鎘性上鮮見報道。

本研究已完成了CsERF7基因序列和蛋白分析，CsERF7基因?qū)儆贏P2/ERF家族的AP2亞家族，ORF長度588 bp，編碼196個氨基酸，有1個AP2結(jié)構(gòu)域。該蛋白屬于非跨膜親水性蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測定位于線粒體中，存在22個氨基酸磷酸化位點。其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和延伸鏈構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果高度一致，同源基因進(jìn)化樹分析表明該基因與黃瓜XP_011659507.1親緣關(guān)系最近，其次是甜瓜XP_008461170.1，同時成功構(gòu)建了植物超表達(dá)載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP。本研究克隆得到了黃瓜CsERF7基因，成功構(gòu)建過表達(dá)載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP，利用農(nóng)桿菌花序法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)PCR檢測，獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，該研究結(jié)果為該基因功能的深入研究提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

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