李培倫 ，劉嘉成 ，魯萬橋 ，王繼隆

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱 150070；2.黑龍江省冷水性魚類種質資源及增養(yǎng)殖重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱 150070；3.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱 150070）

鹽度是魚類棲居水環(huán)境中重要的生境因子，能夠影響魚類的存活、生長發(fā)育及繁殖習性，尤其對海水養(yǎng)殖的魚類來講，適當?shù)柠}度改變能夠對其攝食行為、生長性能及組織器官的發(fā)育起到一定的促進作用，但鹽度改變幅度過大則會對其生長造成不利影響[1-2]。同時，水體中鹽度的改變會引起魚體發(fā)生各種應激反應，通常會產(chǎn)生過量的活性氧分子，為防止其對魚體造成損害，魚類物種在長期進化過程中逐漸形成了特定的抗氧化機制[3-4]。肝臟是魚體進行各類物質代謝的重要器官，亦是參與氧化還原反應較多的組織，內(nèi)含各種抗氧化酶和水解酶類，這些酶可通過機體的免疫防御體系抵御外界的各類脅迫和侵害[5-6]。ATP酶廣泛存在于生物機體內(nèi)，既能穩(wěn)定細胞內(nèi)、外的滲透壓平衡，又能為機體物質運輸、能量代謝等生化過程提供動力，其活力強度可用于評價機體的離子運載能力[7]。研究表明，鹽度改變能夠引起魚類鰓ATP酶、肝臟的抗氧化功能發(fā)生適應性變化，進而對其存活率、生長性能等造成影響，這些生理生化指標的變化能反映鹽度對魚體健康的影響程度[5-9]。

大麻哈魚（Oncorhynchus keta）主要分布于北緯35°～73°，東經(jīng) 120°～123°，是北太平洋沿岸國家重要的商業(yè)捕撈魚類之一[10]。大麻哈魚一生經(jīng)歷幼魚降海生長、成魚溯河繁殖兩個海水、淡水適應階段，是典型的江海洄游性魚類[11]。自20世紀70年代起，由于全球范圍內(nèi)氣候變遷、過度商業(yè)捕撈、興修各類水利工程等因素，導致大麻哈魚的自然資源儲量嚴重下降[12-13]。為恢復我國大麻哈魚的種群資源，政府部門及科研單位不斷開展增殖放流，積極探索其人工養(yǎng)殖技術，取得了一定的成效[13-16]。目前，有關大麻哈魚人工養(yǎng)殖方面的研究較少，涉及生長[14]、肌肉營養(yǎng)[17]、性腺發(fā)育[18]、血液生理及消化酶[19]等方面，而有關養(yǎng)殖大麻哈魚生長性能、鰓ATP酶及肝臟抗氧化功能方面的研究未見報道。本試驗研究了鹽度改變對大麻哈魚生長性能的影響，明確了鰓ATP酶活力及肝臟抗氧化功能面對鹽度脅迫時的響應情況，以期為人工環(huán)境下大麻哈魚養(yǎng)殖條件的摸索提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

在中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖車間，挑選24尾生長狀況良好的大麻哈魚（2齡）在控溫水族箱內(nèi)開展試驗，試驗魚的體質量為265.3～321.2 g、叉長為25.2～28.9 cm。試驗設置淡水（CK）、鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰ 4個處理，每個處理隨機放入6尾試驗魚。用地下井水和海水素調配試驗用水，并用哈希HQ4300鹽度計校對各處理的鹽度值。試驗開始前測量魚的初始體質量（initial body mass，Wi），試驗過程中水溫設置為15℃，充分曝氣使水體溶解氧含量≥9 mg/L。每天7：00—8：00、16：00—17：00 分別投喂鮭魚飼料 1 次。此外，試驗期間統(tǒng)計魚的存活率，每7 d換水1次，42 d（2齡）后結束試驗。

1.2 樣品制備

取樣前1 d停止喂食，麻醉后將試驗魚放置在冰盤上，先測量終末體質量（terminal body mass，Wt），后解剖取鰓和肝臟組織，經(jīng)4℃去離子水沖洗后放入-80℃冰箱。測定前分別對鰓和肝臟組織解凍，準確稱取其質量，按質量體積比加入9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿液，4℃下2 500 r/min離心10 min，取上清液待測。

1.2.1 酶活力的測定

用試劑盒（南京建成）測定鰓三磷酸腺苷酶（ATP酶）活力，肝臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的活力，肝臟總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，具體步驟參照說明書執(zhí)行。

1.2.2 生長性能測定與計算

試驗開展42 d后，分析各處理試驗魚的生長性能，計算方法如下

體質量增長率/%＝［（Wt－Wi）/Wi］×100（1）

特定生長率/（%/d）＝［（ln Wt－ln Wi）/t］×100（2）

存活率/%＝（St/Si）×100（3）

上述公式中，Wi為試驗魚的初始體質量（g）；Wt為試驗魚的終末體質量（g）；Si為初始試驗魚尾數(shù)（條）；St為終末試驗魚尾數(shù)（條）；t為試驗開展的時間（d）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007、SPSS 19.0軟件統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)，采用單因素分析法對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚的生長性能

大麻哈魚在試驗期間未出現(xiàn)死亡情況，各處理的存活率均為100%（表1）。由表1可知，大麻哈魚的體質量增長率、特定生長率均隨鹽度的升高呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢，其中鹽度8‰處理大麻哈魚的生長狀況最好，其體質量增長率為29.41%、特定生長率為0.61%/d，而淡水（CK）處理大麻哈魚的體質量增長率和特定生長率均最低，分別為16.62%和0.36%/d。方差分析結果表明，鹽度8‰處理大麻哈魚的終末體質量、體質量增長率和特定生長率顯著高于淡水（CK）和鹽度 24‰處理（P＜0.05）；鹽度16‰處理大麻哈魚的終末體質量、體質量增長率和特定生長率與其他各處理間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚的存活率和生長情況Table 1 Effects of salinity on survival rate and growth performance of farmed chum salmon

2.2 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚鰓ATP酶的活力水平

由表2可知，養(yǎng)殖大麻哈魚鰓Na+/K+-ATP酶活力為1.07～1.89 U/mg，Ca2+/Mg2+-ATP酶活力為0.81～1.46 U/mg。大麻哈魚鰓Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力變化趨勢均隨鹽度的升高先上升后下降，其中，鹽度8‰處理兩種ATP酶活力最高，淡水（CK）處理兩種ATP酶活力最低。方差分析結果表明，鹽度8‰、鹽度16‰、鹽度24‰處理與淡水（CK）處理間的Na+/K+-ATP酶活力具有顯著差異（P＜0.05）；鹽度16‰處理和鹽度24‰處理間無顯著差異（P＞0.05）。鹽度8‰處理的Ca2+/Mg2+-ATP酶活力與其他各處理間均具有顯著差異（P＜0.05）；鹽度24‰處理與淡水（CK）、鹽度 16‰處理間無顯著差異（P＞0.05）；鹽度16‰處理與淡水（CK）處理間的Ca2+/Mg2+-ATP酶活力具有顯著差異（P＜0.05）。

表2 鹽度對養(yǎng)殖大麻哈魚鰓ATP酶活力的影響Table 2 Effect of salinity on gill ATPase activity of farmed chum salmon

2.3 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟的抗氧化功能

2.3.1 養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟抗氧化酶的活力水平

由表3可知，大麻哈魚肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活力均隨鹽度升高呈先上升后下降的趨勢，其中，鹽度16‰處理酶活力最高，淡水（CK）處理酶活力最低；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的變化趨勢隨鹽度升高呈先下降后上升的趨勢，其中，鹽度16‰處理酶活力最低，鹽度24‰處理酶活力最高。方差分析結果表明，淡水（CK）處理與鹽度8‰處理、鹽度24‰處理、鹽度16‰處理間的SOD活力具有顯著差異（P＜0.05）；鹽度8‰處理和鹽度24‰處理間的SOD活力無顯著差異（P＞0.05）。鹽度24‰處理GSH-PX活力顯著（P＜0.05）高于淡水（CK）、鹽度 8‰和鹽度 16‰處理；淡水（CK）、鹽度8‰和鹽度16‰處理間的GSH-PX活力無顯著差異（P＞0.05）；CAT活力在各鹽度處理間無顯著差異（P＞0.05）。

表3 鹽度對養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟抗氧化酶活力的影響Table 3 Effect of salinity on antioxidant enzyme activities in the liver of farmed chum salmon

2.3.2 養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活力水平

由表4可知，大麻哈魚酸性磷酸酶（ACP）活力為75.16～78.80 U/g，堿性磷酸酶（AKP）活力為37.02～42.54 U/g。各處理大麻哈魚ACP活力均隨鹽度的升高呈先上升后下降的變化趨勢，其中，鹽度16‰處理酶活力最高，淡水（CK）處理最低；AKP活力隨鹽度的升高逐漸下降。方差分析結果顯示，ACP活力在各處理間無顯著差異（P＞0.05）；AKP活力淡水（CK）處理顯著（P＜0.05）高于其他各處理，鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理間的AKP活力無顯著差異（P＞0.05）。

表4 鹽度對養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響Table 4 Effect of salinity on activities of ACP and AKP in the liver of farmed chum salmon

2.3.3 養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟總抗氧化能力和丙二醛含量

由表5可知，養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟總抗氧化能力（T-AOC）為120.52～126.88 mmol/mg，其中，鹽度8‰處理T-AOC最高，為126.88 mmol/mg；淡水（CK）處理最低，為 120.52 mmol/mg。丙二醛（MDA）含量為 2.27～2.75 mmol/mg，其中，淡水（CK）處理含量最高，為2.75 mmol/mg；鹽度8‰處理最低，為2.27 mmol/mg。方差分析結果顯示，淡水（CK）處理的MDA含量顯著（P＜0.05）高于其他各處理，鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理間的MDA含量無顯著差異（P＞0.05）；肝臟T-AOC在各處理間無顯著差異（P＞0.05）。

表5 鹽度對養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟總抗氧化能力和丙二醛含量的影響Table 5 Effect of salinity on total antioxidant function and malondialdehyde content in the liver of farmed chum salmon

3 討論與結論

3.1 鹽度對養(yǎng)殖大麻哈魚生長性能的影響

魚類生存的水環(huán)境發(fā)生較大變化時魚體會產(chǎn)生各種應激反應，通常最先顯現(xiàn)的是行為活力、能力方面的變化[20]。在本試驗開始后鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的大麻哈魚均表現(xiàn)出適應性的行為變化，如游泳速度增快、撞擊玻璃缸壁等現(xiàn)象，待其狀態(tài)穩(wěn)定后的1～5 d，試驗魚又出現(xiàn)了呼吸頻率增強、攝食能力下降及長時間停滯等狀況，且隨鹽度的升高，這些行為持續(xù)的時間也相應變長，與硬頭鱒（Oncorhynchus mykiss）[2]、點籃子魚（Siganus guttatus）[21]等魚類面對鹽度脅迫時表現(xiàn)出的狀態(tài)相似。李培倫等[22]對大麻哈魚幼魚在不同鹽度下的存活率進行了研究，指出24‰的鹽度條件下其存活率最低，僅為83.34%，而本試驗中2齡大麻哈魚在各處理的存活率均為100%，說明大麻哈魚與大多數(shù)魚類相似，隨著規(guī)格的增大，其對鹽度的適應能力不斷增強，存活率亦隨之提高。通常魚類在其等滲點附近的水體中生活時具有較高的生長速率，而廣鹽性魚類等滲點的鹽度區(qū)間為10‰～13‰[23-24]。目前，有關大麻哈魚在養(yǎng)殖水體中的等滲點鹽度未見報道，本試驗中鹽度8‰處理大麻哈魚的體質量增長率和特定生長率均最高，鹽度16‰處理次之，推斷該生長階段其等滲點的鹽度介于8‰～16‰。

3.2 鹽度對養(yǎng)殖大麻哈魚鰓ATP酶的影響

研究表明，當魚類棲息水體的鹽度發(fā)生改變時，魚體長期維持的內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境將會被打破，為保持魚體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，需要借助鰓組織中泌氯細胞的ATP酶活性進行調節(jié)，但鰓ATP酶活力的變化趨勢在不同物種之間存在差異[25-26]。尹飛等[3]對銀鯧（Pampus argenteus）幼魚在低鹽脅迫后鰓中ATP酶（Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶）的活力進行了測定，發(fā)現(xiàn)其活力隨鹽度降低總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；羅海忠等[27]研究指出，四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）在經(jīng)受30 d的鹽度脅迫后鰓中Na+/K+-ATP酶的活力隨鹽度升高而不斷上升；曾霖等[28]研究指出，大菱鲆（Scophthalmus maximus）經(jīng)60 d的鹽度脅迫后其鰓Na+/K+-ATP酶活力亦隨鹽度的升高而不斷增強。由此可見，在鹽度脅迫下不同魚類的鰓ATP酶活力會呈現(xiàn)不同的適應機制。本試驗中，養(yǎng)殖大麻哈魚鰓中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力均隨鹽度的升高表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，且鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的酶活力均高于淡水（CK）處理，說明養(yǎng)殖水體中適量的鹽度能夠刺激大麻哈魚鰓ATP酶活力的提升，但超出一定范圍后其活力會出現(xiàn)不同程度下降。

3.3 鹽度對養(yǎng)殖大麻哈魚肝臟抗氧化功能的影響

SOD、CAT和GSH-PX是機體重要的抗氧化酶類，且在機體抗氧化功能發(fā)揮上具有一定協(xié)同作用，其中SOD可將機體內(nèi)活性氧分子轉化為過氧化氫和氧氣，而GSH-PX和CAT能夠將過氧化氫分解為水，從而降低其對機體的損傷程度[29-30]。本試驗中，養(yǎng)殖水體鹽度的改變激發(fā)了大麻哈魚肝臟內(nèi)SOD、CAT活力的提升，但是GSH-PX與CAT的活力變化趨勢相反，推斷這兩種酶在執(zhí)行功能時產(chǎn)生了拮抗作用，該現(xiàn)象也在銀鯧[3]、刀鱭（Coilia nasus）[26]、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[31]、點帶石斑魚（Epinephelus coioides）[32]等水產(chǎn)動物中出現(xiàn)。ACP和AKP是機體重要的水解酶類，在免疫防御體系中可催動磷酸酯類物質水解成磷酸，促進ATP酶的生成，為機體抵抗環(huán)境脅迫供能[26]。本試驗中，大麻哈魚肝臟ACP酶活力在各處理間無顯著差異（P＞0.05），而AKP酶活力隨著鹽度的升高逐漸下降，且鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理AKP活力顯著低于淡水（CK）處理（P＜0.05），推斷該階段生活在淡水中的大麻哈魚需要維持較高的酶活力來滿足魚體對ATP的需求，而咸水環(huán)境下肝臟對ATP酶的需求降低，故AKP酶活力受到抑制。

T-AOC是機體各類抗氧化分子及酶促反應體系抗氧化能力的總和，通常T-AOC升高時，魚體清除活性氧分子的能力會增強，而脂質過氧化產(chǎn)物則相應減少[4]。MDA是機體脂質類物質過氧化后形成的代謝產(chǎn)物，可與核酸、蛋白質等發(fā)生反應進而損傷機體，通常情況下機體MDA的含量較低[5，33]。本試驗結果表明，同淡水（CK）處理相比，鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的大麻哈魚肝臟T-AOC有所增加，說明水體中的鹽度能夠促進大麻哈魚肝臟抗氧化功能的增強；隨著鹽度升高MDA含量呈現(xiàn)先下降后略微上升的趨勢，其中鹽度8‰處理含量最低，且鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的MDA含量顯著低于淡水（CK）處理，這一結果與其總抗氧化能力（T-AOC）相適應，說明魚體T-AOC增加時清除體內(nèi)過量的氧化自由基和脂質過氧化產(chǎn)物的能力增強，從而使MDA含量下降。

大麻哈魚人工養(yǎng)殖過程中，鹽度改變會對其生長性能產(chǎn)生一定影響，同時鰓ATP酶、肝臟抗氧化功能等均會發(fā)生適應性變化，以便更好地適應水體的鹽度環(huán)境。盡管大麻哈魚在0～24‰的鹽度范圍內(nèi)均具有較高成活率，但其生長速度卻存在一定差異。整體來講，處于2齡生長階段的大麻哈魚在8‰～16‰的鹽度范圍內(nèi)具有較快的生長速率及生理適應能力，建議2齡生長階段養(yǎng)殖水體的鹽度保持在8‰～16‰。