李龍龍，馬子晴，陳召霞，黃兆峰，黃紅娟，魏守輝

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/ 植物病蟲害綜合治理全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，100193 北京）

龍葵（Solanum nigrumL.）是茄科一年生草本植物，廣泛分布于歐洲、亞洲和美洲的溫帶和熱帶地區(qū)，主要以種子進(jìn)行繁殖和傳播[1]。龍葵對(duì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的影響在多種作物中都有報(bào)道，目前已成為我國棉田惡性雜草[2-4]。有效控制龍葵對(duì)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)至關(guān)重要，在現(xiàn)有的雜草控制措施中，機(jī)械和化學(xué)除草是田間最常用的方法，而這些控制方法成功的關(guān)鍵取決于雜草的消長動(dòng)態(tài)以及是否達(dá)到最大出苗數(shù)量[5]。因此，為提高雜草防除的有效性，明確龍葵的萌發(fā)出苗規(guī)律是對(duì)其進(jìn)行防控的重要前提。

種子萌發(fā)是由多種酶催化的生理生化代謝過程，而酶活性與溫度密切相關(guān)，因此溫度是影響種子萌發(fā)的重要因素之一。研究龍葵種子萌發(fā)與溫度的關(guān)系對(duì)預(yù)測其出苗時(shí)間非常關(guān)鍵。前人研究表明，不同龍葵種群的種子萌發(fā)對(duì)溫度的響應(yīng)不同，其適宜萌發(fā)的溫度范圍存在較大差異。其中：瑞典龍葵種群的萌發(fā)溫度范圍為13～34 ℃，適宜溫度范圍為26～30 ℃[6]；我國河北龍葵種群的萌發(fā)溫度范圍為15～30 ℃，最適溫度為25 ℃[7]；印度龍葵種群的適宜萌發(fā)溫度范圍為26～30 ℃[8]；而以色列龍葵種群萌發(fā)的溫度范圍為20～35 ℃，適宜溫度為25～30 ℃[9]。Ma 等[10]通過研究我國北方6 個(gè)龍葵種群種子萌發(fā)對(duì)溫度的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)各龍葵種群種子萌發(fā)的溫度范圍為15～35 ℃，其中新疆、吉林和黑龍江種群的最適萌發(fā)溫度為30 ℃，而內(nèi)蒙古、河南和遼寧種群的最適萌發(fā)溫度分別為25 ℃、20 ℃和15 ℃。上述研究均以萌發(fā)率為指標(biāo)來分析龍葵的萌發(fā)與溫度的關(guān)系，并沒有探討龍葵種子生理生化特征的變化。因此，本研究擬通過測定不同溫度條件下萌發(fā)龍葵種子的抗氧化酶活性、淀粉酶（amylase,AMS）活性及丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量等生理指標(biāo)，探究溫度對(duì)龍葵種子萌發(fā)的影響，以揭示其種子萌發(fā)對(duì)溫度的生理響應(yīng)機(jī)理，為龍葵的萌發(fā)出苗預(yù)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的6 個(gè)龍葵種群種子于2018 年、2019年采自新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧和河南（表1）。田間采集已完全成熟的黑色龍葵果實(shí)，于室內(nèi)將漿果攪碎，用去離子水徹底沖洗種子1～2 min，然后在通風(fēng)干燥條件下晾干，裝入牛皮紙袋中于室溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 龍葵種群種子的采集信息Table 1 Information on the seed collection of Solanum nigrum populations

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaClO 溶液對(duì)大小和顏色均勻、籽粒飽滿的6 個(gè)龍葵種群的種子進(jìn)行消毒，浸泡10 min 后用無菌水沖洗干凈。將消毒后的種子均勻排列于鋪有2 層濾紙、直徑為9 cm的一次性培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放40 粒種子，然后加入5 mL 無菌水，用封口膜密封后放入智能人工氣候培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）中培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。培養(yǎng)期間，根據(jù)培養(yǎng)皿失水情況適當(dāng)補(bǔ)充無菌水，使種子保持濕潤狀態(tài)。各處理分別設(shè)置培養(yǎng)箱恒溫為10、15、20、25、30、35、40 ℃，光照時(shí)間/ 黑暗時(shí)間為12 h/12 h，相對(duì)濕度為50%。培養(yǎng)48 h 后，每皿中選擇大小一致、未萌發(fā)的種子（胚根長度＜1 mm）作為樣品。

1.3 測定方法

1.3.1抗氧化酶活性和MDA 含量。稱取約0.1 g龍葵種子，加入1 mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿；8 500 r·min－1、4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測。參照超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、MDA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書進(jìn)行操作和反應(yīng)。用紫外-可見分光光度計(jì)測定吸光值，并計(jì)算酶活性和MDA 含量。以上所有生理生化指標(biāo)的測定均為3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2淀粉酶活性。稱取約0.1 g 龍葵種子，液氮下研磨成粉末，加入pH 為2 的磷酸緩沖液9 mL混勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，5 200 r·min－1、4 ℃離心15 min，取上清液為待測樣品酶液。采用酶聯(lián)免疫法測定淀粉酶活性，設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在Microsoft Excel 2019 中整理數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Tukey 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較（0.05 水平），用Origin 2018 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)龍葵種子SOD 活性的影響

SOD 能清除種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的活性氧，同時(shí)生成過氧化氫（H2O2），控制膜脂過氧化[11]。由圖1 可以看出，6 個(gè)龍葵種群種子的SOD 活性隨著溫度的升高表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。10 ℃時(shí)，各種群龍葵種子的SOD 活性均較低。在10～35 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度上升，6 個(gè)種群龍葵種子的SOD 活性逐漸升高；35 ℃時(shí)，各種群龍葵種子的SOD 活性達(dá)到峰值，其中LN2209 種群SOD活 性 最 高，NMG1704、HLJ2134、JL1697、HN2160次之，XJ1600 的SOD 活性最低。但當(dāng)溫度上升至40 ℃時(shí)，各種群龍葵種子的SOD 活性驟降，其中XJ1600 的SOD 活性最高，而LN2209 的SOD 活性最低。

圖1 不同溫度處理龍葵種子SOD 活性的比較Fig.1 Comparison of the SOD activity in Solanum nigrum seeds treated by different temperatures

2.2 溫度對(duì)龍葵種子POD 活性的影響

POD 能催化H2O2分解，并與SOD 等組成過氧化防御系統(tǒng)，使種子萌發(fā)過程中活性氧維持在正常水平[12]。從圖2 可以看出，隨著溫度的增加，POD 活性先略有增加后大幅降低。10～25 ℃處理的各種群龍葵種子的POD 活性逐漸增加，但增加幅度較小。25～40 ℃時(shí)，各種群龍葵種子的POD 活性變化加劇。其中，HN2160 和LN2209 在30 ℃時(shí)POD 活性大幅升高并達(dá)到峰值，35 ℃時(shí)POD 活性大幅下降。XJ1600、HLJ2134、JL1697 和NMG1704 在35 ℃時(shí)的POD 活性大幅升高并達(dá)到峰值。溫度上升至40 ℃時(shí)，JL1697、NMG1704、HN2160 和LN2209 的POD 基本失活，而XJ1600 和HLJ2134 的POD 仍有一定活性。

2.3 溫度對(duì)龍葵種子CAT 活性的影響

CAT 是細(xì)胞內(nèi)H2O2的重要清除劑，H2O2的含量越高，CAT 對(duì)其分解就會(huì)越快，其活性可以反映種子萌發(fā)過程中抵抗逆境脅迫的能力[13]。在不同溫度下，各種群龍葵種子的CAT 活性不同，隨著溫度的增加，CAT 活性先增加后降低（圖3）。XJ1600、NMG1704、HLJ2134 和HN2160 的CAT 活 性 在35 ℃時(shí)最高，JL1697 和LN2209 的CAT 活性在30 ℃時(shí)最高。40 ℃時(shí)，各種群龍葵種子的CAT 活性較35 ℃時(shí)明顯降低，且種群間差異不顯著。

圖3 不同溫度處理龍葵種子CAT 活性的比較Fig.3 Comparison of the CAT activity in Solanum nigrum seeds treated by different temperatures

2.4 溫度對(duì)龍葵種子中MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量的變化能夠反映種子萌發(fā)時(shí)細(xì)胞膜受損傷程度[14]。由圖4所示，隨著溫度的升高，龍葵種子中MDA 含量發(fā)生明顯變化，總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，不同種群龍葵種子的MDA 含量出現(xiàn)峰值的溫度不 同。XJ1600、JL1697、NMG1704 和HLJ2134的MDA 含量在40 ℃時(shí)達(dá)到最高值，而HN2160和LN2209 的MDA 含量在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值。高溫脅迫可明顯提高各種群龍葵種子的MDA 含量，說明各龍葵種群種子的膜脂過氧化水平均隨溫度脅迫程度增加而增加。與其他種群相比，HN2160 的MDA 含量波動(dòng)幅度較大，說明該種群對(duì)溫度較敏感。

圖4 不同溫度處理龍葵種子MDA 含量的比較Fig.4 Comparison of the MDA contents in Solanum nigrum seeds treated by different temperatures

2.5 溫度對(duì)龍葵種子AMS 活性的影響

AMS 是種子萌發(fā)初期重要的水解酶，能促進(jìn)小分子糖類物質(zhì)的產(chǎn)生，從而為種子萌發(fā)和幼苗生長提供營養(yǎng)及能量[15]。除HLJ2134 外，其他種群龍葵種子的AMS 活性隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢 （圖5）。XJ1600 和JL1697的AMS 活性在35 ℃時(shí)達(dá)到峰值。HN2160 的AMS 活性在10～20℃時(shí)較其他種群的高。與35℃時(shí)相比，40 ℃時(shí)，NMG1704 和HLJ2134 的AMS活 性 無 明 顯 變 化，XJ1600、JL1697、HN216 0 和LN2209 的AMS 活性下降，但仍保持一定的活性。

圖5 不同溫度處理龍葵淀粉酶（AMS）活性的比較Fig.5 Comparison of the amylase activity in Solanum nigrum seeds treated by different temperatures

3 討論

3.1 溫度對(duì)龍葵種子抗氧化酶活性的影響

溫度的高低會(huì)影響種子內(nèi)部酶的活性，進(jìn)而影響種子萌發(fā)進(jìn)程。當(dāng)種子遭受環(huán)境脅迫時(shí)，萌發(fā)代謝受阻可導(dǎo)致活性氧大量積累，引起細(xì)胞膜脂過氧化，內(nèi)部的活性氧清除系統(tǒng)包括酶促保護(hù)系統(tǒng)和非酶促保護(hù)系統(tǒng)會(huì)發(fā)揮作用，其中SOD、CAT、POD 等酶在自由基清除和過氧化物分解等方面起重要作用[16-19]。各龍葵種群抗氧化酶在某一溫度達(dá)到峰值，說明此溫度條件下其種子的酶促保護(hù)系統(tǒng)能發(fā)揮最大作用。前人研究表明，在高溫脅迫下，植物耐熱性越強(qiáng)，其抗氧化酶活性越高[20-23]。在高溫（40 ℃）脅迫下，XJ1600 種群SOD 活性最高，JL1697 的SOD 活性最低；POD活性也以XJ1600 種群的最高，而JL1697、NMG1704、HN2160 和LN2209 的較低。由此可見，XJ1600 比其他種群耐熱性更強(qiáng)。MDA 是膜脂過氧化產(chǎn)物，常被作為植物耐熱性的重要生理指標(biāo)。6 個(gè)龍葵種群種子MDA 含量隨溫度變化趨勢表明，溫度脅迫可顯著增加龍葵種子中MDA 含量。與其他種群相比，HN2160 中MDA 含量在30～40 ℃波動(dòng)幅度較大，說明該種群對(duì)高溫較敏感。

3.2 溫度對(duì)龍葵種子淀粉酶活性的影響

在種子萌發(fā)過程中，淀粉酶主要催化種子中淀粉的水解，其活性與種子萌發(fā)水平呈顯著正相關(guān)[24]。本研究表明，溫度顯著影響龍葵種子淀粉酶活性。根據(jù)6 個(gè)龍葵種群種子的淀粉酶活性隨溫度變化趨勢可知，XJ1600 萌發(fā)溫度需求較高，而HN2160 萌發(fā)溫度需求最低。Ma 等[10]發(fā)現(xiàn)，不同?。▍^(qū)）龍葵種子萌發(fā)溫度差異與緯度有關(guān)，緯度高的地區(qū)萌發(fā)溫度較高，這可能是龍葵對(duì)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。龍葵在高溫（40 ℃）脅迫下，淀粉酶活性未出現(xiàn)明顯下降，其原因可能是不同植物淀粉酶對(duì)高溫的響應(yīng)不同，如穇子淀粉酶的最高活性溫度為45～50 ℃[25]，大豆為40 ℃[26]，白玉豆為30 ℃[27]。此外，還可能與高溫的持續(xù)時(shí)間有關(guān)，在高溫脅迫初期，淀粉水解產(chǎn)物（如可溶性糖）提高了植物細(xì)胞的滲透勢，從而減輕高溫脅迫造成的影響[28]；隨著脅迫持續(xù)進(jìn)行，貯藏物質(zhì)過快消耗，胚因得不到充足的營養(yǎng)而導(dǎo)致發(fā)育停止[27]。

4 結(jié)論

不同?。▍^(qū)）的6 個(gè)龍葵種群中，新疆種群（XJ1600）種子萌發(fā)溫度需求高、耐熱性強(qiáng)，而河南種群（HN2160）種子的萌發(fā)溫度要求低，對(duì)熱脅迫敏感。不同溫度條件下龍葵種子內(nèi)的生理指標(biāo)變化，可以在一定程度上反映種子的萌發(fā)狀況，進(jìn)而明確不同種群種子的適宜萌發(fā)條件。這些研究結(jié)果為龍葵的萌發(fā)預(yù)測和監(jiān)測提供一定依據(jù)，對(duì)棉田惡性雜草的精準(zhǔn)防控具有重要意義。