張為粼 孫樂樂 暴芳芳 于功奇 王真真 王 川 楊 青 劉 紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟(jì)南,250022

鐮刀菌(Fusarium)主要是植物致病真菌,存在于土壤和植物中,也可致人類感染,屬于條件致病菌[1,2],分為局限性和播散性,局限性感染主要見于真菌性角膜炎[3];目前報道的可感染皮膚的鐮刀菌有茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等[4],輪枝鐮刀菌感染的病例相對少見,且未見由基因缺陷導(dǎo)致感染的報道。本文報道1例患者,并對國內(nèi)外已報道的12例局限性輪枝鐮刀菌感染病例[5-16]進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者,女,41 歲。面部皮膚斑塊 25 年,伴癢?；颊?5年前無明顯誘因于右側(cè)面頰部出現(xiàn)紅色斑塊逐漸擴(kuò)大至前額及左面頰,夏季減輕,冬季加重,伴瘙癢,于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院按真菌感染及結(jié)核感染治療無效。體格檢查: 系統(tǒng)檢查未見異常。皮膚科檢查: 皮損分布于左右面頸部,浸潤性紅色斑塊,右側(cè)面頰可見一萎縮性瘢痕(圖1)。血常規(guī)、肝腎功能未見明顯異常。非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)qPCR陰性。皮損組織病理示: (面部)表皮假上皮瘤樣增生,真皮中上層較多組織細(xì)胞、巨細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,少許中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞。過碘酸希夫(periodic acid-schiff staining,PAS)染色:見較多圓形孢子(圖2)?？顾崛旧?抗酸菌陰性。

圖1 1a、1b:左右面頸部浸潤性紅色斑塊;1c:右側(cè)面頰可見一萎縮性瘢痕

圖2 2a:表皮假上皮瘤樣增生,真皮中上層較多組織細(xì)胞、巨細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,少許中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞(HE,×40);2b:PAS染色見較多圓形孢子(×400)

根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理檢查考慮感染性肉芽腫,為進(jìn)一步診治,遂進(jìn)行菌種培養(yǎng)及測序,以及宿主的外顯子測序工作,以進(jìn)一步明確致病基因。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)和鑒定方法描述 將新鮮皮膚組織塊剪碎分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Agar ,SDA)27℃和血瓊脂平板(Blood Agar, BA)35℃ 進(jìn)行真菌及細(xì)菌培養(yǎng)15天。光鏡下觀察初步判斷為真菌感染后,分別轉(zhuǎn)種至大平皿SDA27℃培養(yǎng)25天和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar,PDA)27℃培養(yǎng)20天,小培養(yǎng)2天后進(jìn)行棉藍(lán)染色。提取菌落DNA,應(yīng)用使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer 1,ITS1)和ITS4引物進(jìn)行PCR和測序,將測序結(jié)果在NCBI Genebank及Westerdijk Fungal Biodiversity Institute(https://wi.knaw.nl/page/Pairwise_alignment)中進(jìn)行比對。

1.2.2 全外顯子測序及Sanger測序 基因組DNA經(jīng)Bioruptor Pico超聲破碎儀隨機(jī)打斷成長度為150～200 bp的片段進(jìn)行建庫,構(gòu)建濃度大于25 ng/μL的文庫。使用Illumina NovaSeq 6000平臺進(jìn)行測序。利用FastQC進(jìn)行質(zhì)控。使用BWA v0.7.17軟件將測序結(jié)果與人類基因組參考序列(hg19版本)進(jìn)行比對, GATK v4.0.12.0對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步過濾。然后使用ANNOVAR軟件對突變位點(diǎn)進(jìn)行注釋,篩選在已知真菌感染相關(guān)的基因[17]上是否有罕見有害突變。

利用Sanger測序?qū)θ怙@子測序結(jié)果進(jìn)行驗證。利用網(wǎng)頁工具primer-blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進(jìn)行引物設(shè)計,合成引物(華大基因科技有限公司,北京)。使用9700型PCR擴(kuò)增儀(美國 ABI 公司)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)對相應(yīng)基因相應(yīng)的外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測,并通過醋酸鈉乙醇沉淀法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。進(jìn)行測序PCR反應(yīng),并利用3500XL基因分析儀(美國ABI公司)對純化后的測序PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 檢查結(jié)果 光鏡下見透明分隔菌絲,未見孢子(圖3a)。SDA培養(yǎng)見白色棉絮狀菌落(圖3b)。轉(zhuǎn)種大平皿SDA及PDA培養(yǎng)均見白色棉絮狀菌落(圖3c、3d)。小培養(yǎng)2天棉藍(lán)染色見透明分隔、銳角分支菌絲,未見孢子(圖3e)。

圖3 3a:光鏡下見透明分隔菌絲,未見孢子(×40);3b:組織塊SDA培養(yǎng),見白色棉絮狀菌落;3c:組織塊菌落轉(zhuǎn)種大平皿SDA培養(yǎng),見白色棉絮狀菌落;3d:組織塊菌落轉(zhuǎn)種大平皿PDA培養(yǎng),見白色棉絮狀菌落;3e:小培養(yǎng)2天棉藍(lán)染色見透明分隔菌絲,未見孢子(×400)

培養(yǎng)分離真菌ITS區(qū)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)與輪枝鐮刀菌(Fusariumverticillioides)ITS區(qū)序列(AY188916.1)完全吻合(圖4a)。全外顯子測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者在CARD9基因上攜帶罕見純合致病移碼突變(c.820_821insG,p.D274Gfs*61),已有相關(guān)文獻(xiàn)報道,同時Sanger測序證實(shí)該位點(diǎn)真實(shí)存在(圖4b)。

圖4 4a:BLAST比對,培養(yǎng)分離真菌ITS區(qū)與輪枝鐮刀菌(Fusarium verticillioides)ITS區(qū)序列(AY188916.1)序列完全吻合;4b:全外顯子測序發(fā)現(xiàn)患者攜帶CARD9基因純合移碼突變(c.820_821insG,p.D274Gfs*61)

2.2 診斷 皮膚輪枝鐮刀菌感染。

2.3 治療及隨訪 伊曲康唑0.2 g/d口服,每日2次,連續(xù)治療3個月后,皮疹大部分消退。

3 討論

輪枝鐮刀菌屬于子囊菌門下的鐮刀菌屬,有一被廣泛使用的異名串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)[18],現(xiàn)已被建議廢棄[19]。鐮刀菌屬在培養(yǎng)過程中容易發(fā)生變異,是真菌中最難分類鑒定的屬之一,大多數(shù)對于鐮刀菌屬的感染的鑒定沒有精確到種的水平[4]。通常所說的串珠鐮刀菌是重要的植物致病菌,主要感染玉米等農(nóng)作物,1977年在美國首次報道從一名健康男性手上的膿皰中分離出來[20]。通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)多樣,目前的研究表明,在這個類群中至少存在50個以上的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種,因此,采用真菌培養(yǎng)的方法通常不能明確區(qū)分出所謂的“串珠鐮刀菌”[19]。分子生物學(xué)技術(shù)對于菌種鑒定的準(zhǔn)確性較高,本例患者通過對培養(yǎng)分離真菌進(jìn)行ITS區(qū)PCR產(chǎn)物測序,最終確定致病菌為輪枝鐮刀菌。

既往報道為串珠鐮刀菌局限性皮膚感染的包括本例在內(nèi)共有13例患者[5-16],皮損可呈現(xiàn)紅斑、潰瘍、結(jié)節(jié)等多種表現(xiàn)。根據(jù)年齡、皮損部位、流行病學(xué)、免疫狀態(tài)、皮損形態(tài),可大致分為兩類人群(表1):一類為老年人,病程可長達(dá)10年以上,皮損發(fā)生于四肢尤其是遠(yuǎn)端暴露部位如足部、手部,下肢較上肢多見,多從事體力勞動,發(fā)病前多可追溯到外傷史及土壤和農(nóng)作物接觸史,多無明顯免疫功能缺陷;一類為兒童青少年,病程通常不足1年,皮損發(fā)生于面部,流行病學(xué)及外傷史常不明確,存在結(jié)核分枝桿菌、念珠菌感染,提示可能存在免疫缺陷。本例患者16歲發(fā)病,病程長達(dá)25年,應(yīng)考慮到免疫缺陷的可能。

表1 局限性皮膚串珠鐮刀菌感染13例分析匯總

在近年來的研究中, 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)等炎癥因子基因的突變、抗原識別受體基因的缺失、T細(xì)胞功能缺陷等,這些基因缺陷會導(dǎo)致機(jī)體的免疫反應(yīng)降低,從而增加宿主感染深部真菌的風(fēng)險。白介素17(interleukin ,IL-17)在深部真菌感染中起著重要的作用,其通過刺激粒細(xì)胞增生和黏附,幫助機(jī)體抵御病原體侵襲[21]。本例患者通過全外顯子測序發(fā)現(xiàn)了CARD9基因純合移碼突變(c.820_821insG,p.D274Gfs*61)。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein9, CARD9) 是來自CARD蛋白家族的細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白, 主要由髓系細(xì)胞表達(dá)[22],CARD9的缺陷會導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)免疫缺陷,進(jìn)而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞對真菌的殺傷缺陷[23]。

不同的CARD9突變存在明顯的地理分布和表型差異,一項對60例具有24種不同CARD9突變和不同真菌感染的患者的研究表明,p.D274Gfs*61(c.820_821insG)突變較為常見,占所有患者的8.1%,占亞洲病例的17.2%[24],相較于其他突變,p.D274Gfs*61(c.820_821insG)突變更容易引起局限性皮膚真菌感染[23]。目前所有病例均來自國內(nèi)[25],主要引起暗色真菌導(dǎo)致的暗色絲孢霉病和著色芽生菌病[26-28],其他感染包括阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)[23,25]、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)[29]、孢子絲菌復(fù)合體(Sporothrixschenckiicomplex)[30]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[31],本文為首例局限性輪枝鐮刀菌皮膚感染伴有CARD9基因缺陷的病例。綜上,病程較長的慢性真菌感染,要考慮宿主遺傳缺陷的問題。

本病治療呈慢性過程,既往報道的治療時長7～135天不等,基本可獲得痊愈。研究表明鐮刀菌對不同藥物的敏感性存在種間差異[32],體外藥敏試驗結(jié)果與臨床轉(zhuǎn)歸不完全一致,局限性鐮刀菌感染常用唑類藥物[33]。盡管伊曲康唑的MIC相對較高,但是口服伊曲康唑配合外用藥物是針對本病臨床上最常見且效果較好的治療方案[34]。本例患者采取伊曲康唑口服治療,取得好轉(zhuǎn)。

綜上,我們首次報道了鐮刀菌屬真菌感染伴CARD9缺陷的病例, 豐富了CARD9缺陷疾病的表型譜。對局限性皮膚輪枝鐮刀菌感染的包括外傷史和免疫狀態(tài)在內(nèi)的發(fā)病特點(diǎn)和易感人群進(jìn)行了總結(jié),也體現(xiàn)了真菌ITS區(qū)測序?qū)τ谛螒B(tài)學(xué)檢查不典型的病例的確診及及時治療所具有的重要價值。