劉程 方以群 李志勇 張珊珊 王楠 許驥 郭美麗

減壓病(decompression sickness,DCS)是機(jī)體暴露在高壓環(huán)境下后,由于環(huán)境壓力突然降低造成溶解在組織內(nèi)的惰性氣體逸出形成氣泡導(dǎo)致的一系列病理反應(yīng)的疾病。DCS主要臨床表現(xiàn)為皮膚瘙癢、大理石斑紋、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、頭暈頭痛、胸悶氣短、呼吸困難,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生偏癱、截癱甚至昏迷[1]。DCS是潛水員常見(jiàn)的一種職業(yè)性疾病,也會(huì)發(fā)生在潛艇部隊(duì)人員和從事于航空航天、水下隧道施工、高壓艙等高壓暴露環(huán)境的工作人員中。近年來(lái),快速上浮脫險(xiǎn)技術(shù)由于脫險(xiǎn)深度大、操作簡(jiǎn)單、安全性高等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于世界各國(guó)潛艇脫險(xiǎn)逃生中,然而一旦發(fā)生操作或調(diào)壓不當(dāng),高壓暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng),則會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的DCS。目前,DCS的主要治療方式是再加壓吸氧治療[2],但對(duì)于DCS的預(yù)防措施并沒(méi)有明確的方案,預(yù)吸氧、運(yùn)動(dòng)、潛水習(xí)服等措施,都在一定程度上可以降低DCS的發(fā)病率[3]。然而,由于操作不便、環(huán)境條件要求高、預(yù)防效果不穩(wěn)定等原因,這些措施并不適宜用于在水下作業(yè)的潛艇部隊(duì)。使用藥物預(yù)防DCS操作簡(jiǎn)便,無(wú)需特殊設(shè)備,是潛艇部隊(duì)人員預(yù)防DCS的最優(yōu)選擇。因此,研究發(fā)現(xiàn)更多效果顯著的DCS預(yù)防藥物,已是當(dāng)務(wù)之急。中醫(yī)藥對(duì)于多系統(tǒng)、多因素?fù)p傷疾病有著天然的優(yōu)勢(shì)。菸花苷(Nicotiflorin,Nic)是我國(guó)傳統(tǒng)活血化瘀中藥紅花(Flos Carthami)中的黃酮類(lèi)化合物,是紅花的重要藥效活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn),菸花苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等多種藥理作用[4-7]。課題組自主研發(fā)的菸花苷注射液作為治療急性缺血性腦卒中的中藥Ⅰ類(lèi)新藥,目前已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段。本研究主要探討菸花苷對(duì)快速上浮脫險(xiǎn)致DCS的預(yù)防作用,以期為DCS預(yù)防用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 使用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重250～270 g)157只,購(gòu)買(mǎi)自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部,在清潔級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右,室溫22～25℃,濕度45%～60%,自由進(jìn)食水,人工照明自動(dòng)模擬晝夜。本研究所有內(nèi)容得到了倫理委員會(huì)的允許和支持。

1.2 儀器設(shè)備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物快速上浮脫險(xiǎn)模擬艙(煙臺(tái)宏遠(yuǎn)氧業(yè)有限公司);752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DHG9146-A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器);Water 1525型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);Bio-Gen PRO200型精密勻漿器(美國(guó) Pro Scientific公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo Fisher Scientific);熒光定量PCR儀(美國(guó) Thermo Fisher Scientific)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)酶聯(lián)免疫反應(yīng)(Elisa)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);UNIQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司);cDNA合成試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司);Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)。

1.4 藥品準(zhǔn)備 菸花苷使用注射液制劑(菸花苷含量為10 mg/ml),由江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)提供(產(chǎn)品批號(hào):20200409)。

1.5 方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)分組:將SD大鼠分為5組,分別為常壓對(duì)照組(n=10只)、DCS組(n=30只)、菸花苷高劑量組(n=40只),中劑量組(n=40只),低劑量組(n=37只)。菸花苷注射液規(guī)格為10 mg/ml(蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司),給藥組大鼠尾靜脈分別注射菸花苷注射液5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg,其中5 mg/kg和10 mg/kg給藥時(shí)使用0.9%氯化鈉溶液稀釋藥物,使各菸花苷給藥組給藥體積相等;DCS組大鼠按照2 ml/kg劑量尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液。

1.5.2 減壓造模方案:DCS模型選用快速上浮脫險(xiǎn)致DCS動(dòng)物模型。動(dòng)物放在使用鐵網(wǎng)封閉的鼠籠中,DCS模型組和菸花苷給藥組同時(shí)放入高壓艙內(nèi)(宏遠(yuǎn),煙臺(tái),中國(guó)),通過(guò)計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)進(jìn)行加壓-減壓過(guò)程。28 s內(nèi)加壓至1.5 MPa后保持242 s,然后以3 m/s的速度減壓至正常大氣壓,減壓時(shí)間共50 s?？瞻讓?duì)照組大鼠放入高壓艙內(nèi),停留320 s后取出,不做加壓、減壓處理。見(jiàn)圖1。

圖1 快速上浮脫險(xiǎn)模擬艙計(jì)算機(jī)自動(dòng)加減壓曲線

1.5.3 DCS行為學(xué)研究:大鼠出艙30 min內(nèi),觀察DCS的發(fā)病情況,包括以下癥狀:行動(dòng)障礙、前/后肢癱瘓、抽搐/痙厥、死亡。并根據(jù)進(jìn)行評(píng)分,對(duì)上述癥狀分別賦予1、2、3、4,出現(xiàn)多種癥狀時(shí),得分相加[8]。

1.5.4 組織學(xué)檢查:每組取10只大鼠,腹腔注射戊巴比妥麻醉后脫頸開(kāi)胸(死亡大鼠直接開(kāi)胸),取右肺中葉,0.9%氯化鈉溶液沖洗表面殘留血液,濾紙吸干,放置于10%多聚甲醛中固定24 h后,脫水,石蠟包埋,切片成4 μm,放在載玻片上,切片放入Harris蘇木素染3～8 min,自來(lái)水洗,1%的鹽酸酒精分化5 s,自來(lái)水沖洗,0.6%氨水返藍(lán),流水沖洗,放入伊紅染液中染色1～3 min。顯微鏡下檢查,進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)分析。每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)×200倍視野區(qū)域,每個(gè)區(qū)域根據(jù)間質(zhì)細(xì)胞增生、水腫、充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分[9]:0分,肺血管、間質(zhì)、肺泡及支氣管正常; 1分,間質(zhì)及肺泡出血水腫范圍<25%; 2分,間質(zhì)增寬,肺泡腔出血水腫范圍 25%～50%; 3分,間質(zhì)明顯增寬,肺泡腔出血水腫范圍 50%～75%; 4分,間質(zhì)明顯增寬,肺泡腔出血水腫范圍>75%。

1.5.5 肺組織濕干比測(cè)定:高壓暴露結(jié)束后,每組取7只大鼠,剪取大鼠右肺后葉,0.9%氯化鈉溶液沖洗表面血液,然后在濾紙上吸干組織表面水分,稱重后確定右肺后葉濕;放入真空干燥箱,80℃烘干48 h,取出再次稱重,確定干重。最后計(jì)算肺組織濕干重量比(wet/dry weight ratio,W/D)。

1.5.6 促炎細(xì)胞因子定量分析:常壓對(duì)照組、DCS模型組和菸花苷高劑量組每組取大鼠剩余肺組織,每個(gè)樣本剪取合適大小后剪碎,使用x1 PBS溶液沖洗表面殘留血液,吸干表面水分,按重量:體積=1∶9的比例加入RIPA,勻漿,4℃ 12 000/min離心15 min,取上清液。使用Elisa試劑盒(聯(lián)科,中國(guó)杭州),按照使用說(shuō)明書(shū),在預(yù)被板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及肺組織樣品,37℃ 孵育1.5 h;加入生物素抗體,37℃孵育1 h;洗板4次,加入HRP,37℃孵育0.5 h;洗板4次,加入TMB顯色液,37℃孵育20 min,加入終止液;酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定OD值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各樣本濃度。

1.5.7 RT-PCR檢測(cè)炎性因子mRNA水平表達(dá):使用Trizol試劑(UNIQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒,生工,中國(guó)上海)從大鼠肺組織中提取總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒(全式金,中國(guó)北京)將提取的肺組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用RT-PCR檢測(cè)肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平(相對(duì)表達(dá)量)。使用NCBI Primer Design(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)用于RT-PCR檢測(cè)的基因引物序列,由生生物工程(上海)股份有限公司合成。見(jiàn)表1。

表1 SD大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 菸花苷降低減壓病的嚴(yán)重程度和死亡率 大鼠出艙后均出現(xiàn)伏地、活動(dòng)減少和聚集蜷縮的狀態(tài),說(shuō)明大鼠發(fā)生了減壓病。當(dāng)強(qiáng)迫大鼠活動(dòng)時(shí),部分大鼠出現(xiàn)行動(dòng)障礙、前肢或后肢癱瘓、全身癱瘓或痙厥抽搐、原地翻滾等癥狀,根據(jù)行為學(xué)評(píng)分可發(fā)現(xiàn),菸花苷組大鼠評(píng)分明顯低于DCS模型組大鼠,可以顯著降低大鼠死亡率,且呈現(xiàn)量效關(guān)系(P<0.05)。見(jiàn)表2,圖2。

表2 5組大鼠死亡率和行為學(xué)比較

2.2 菸花苷緩解DCS致肺組織損傷 大鼠肺組織病理分析結(jié)果顯示,相對(duì)于空白組大鼠肺組織,DCS模型組肺組織水腫嚴(yán)重,肺間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)顯著水腫、增生,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、融合,肺泡腔可見(jiàn)紅細(xì)胞浸潤(rùn)。菸花苷給藥組肺組織間質(zhì)細(xì)胞水腫較輕,肺泡腔及肺間質(zhì)紅細(xì)胞浸潤(rùn)減少,肺組織結(jié)構(gòu)基本完整,且損傷程度呈現(xiàn)量效關(guān)系。肺組織病理學(xué)評(píng)分,說(shuō)明菸花苷降低了大鼠肺組織損傷程度。與常壓對(duì)照組比較,DCS模型組大鼠肺組織W/D、肺組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高,而菸花苷高、中劑量組肺組織W/D、肺組織病理學(xué)評(píng)分明顯低于DCS組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3,表3。

圖2 5組大鼠出艙后30 min生存情況

常壓對(duì)照組(HE×200) DCS組(HE×200) DCS組(HE×400)

菸花苷高劑量組(HE×200) 菸花苷中劑量組(HE×200) 菸花苷低劑量組(HE×400)

表3 5組大鼠肺濕干比和肺組織病理學(xué)評(píng)分

2.3 大鼠肺組織炎性因子水平和細(xì)胞黏附因子的含量變化 DCS組TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1水平高于常壓對(duì)照組和菸花苷組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。菸花苷組TNF-α、IL-6、ICAM-1水平低于常壓對(duì)照組,IL-1β高于常壓對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1含量 pg/ml,

2.4 大鼠肺組織炎性因子和細(xì)胞黏附因子的mRNA水平變化 與常壓對(duì)照組相比,DCS組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1在mRNA水平的表達(dá)顯著提高,菸花苷預(yù)防給藥后,DCS大鼠肺組織中TNF-α、ICAM-1和IL-6的mRNA水平顯著降低,IL-1的mRNA水平也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。見(jiàn)表5。

表5 3組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1 mRNA水平變化

3 討論

DCS的發(fā)病原因是當(dāng)氣壓快速降低時(shí),溶解在機(jī)體內(nèi)的惰性氣體逸出形成氣泡,存在于血液、脂肪和各組織器官中,尤其是在靜脈系統(tǒng)中會(huì)產(chǎn)生大量氣泡。氣泡作為外源性物質(zhì),其介導(dǎo)的血小板激活凝集、白細(xì)胞活化、TNF-α等炎性因子釋放、補(bǔ)體和黏附因子激活、細(xì)胞凋亡信號(hào)上調(diào)等,導(dǎo)致機(jī)體一系列免疫、炎性和凝血反應(yīng)[10],對(duì)呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等造成損傷[11]。與常規(guī)潛水致DCS模型相比,快速上浮脫險(xiǎn)致DCS模型由于機(jī)體在高壓環(huán)境下暴露時(shí)間較短,氣泡主要集中在靜脈血液中,可隨血液流動(dòng),并可通過(guò)吸收不斷溢出的惰性氣體或氣泡間相互融合而擴(kuò)大,隨循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)下腔靜脈到達(dá)右心房、右心室、肺動(dòng)脈進(jìn)入肺組織,最后經(jīng)肺泡氣體交換排出體外。因此,快速上浮脫險(xiǎn)致DCS模型神經(jīng)系統(tǒng)損傷較小[12],機(jī)體損傷主要涉及循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)。在排出氣泡的過(guò)程中,大量的氣泡對(duì)肺泡、肺動(dòng)脈造成直接機(jī)械刺激,肺是快速上浮脫險(xiǎn)致DCS的主要靶器官[9]。當(dāng)減壓病發(fā)生時(shí),不安全減壓在體內(nèi)產(chǎn)生的大量氣泡,對(duì)肺泡、血管內(nèi)皮細(xì)胞等組織可以造成直接的機(jī)械系損傷,增加血管通透性,并激活炎性反應(yīng)系統(tǒng),促進(jìn)大量前炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)釋放[13]。正常情況下,ICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞表明表達(dá)量較低,由于TNF-α的刺激,激活肺內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞的NF-κB通路,上調(diào)ICAM-1的表達(dá)[14],血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1水平可出現(xiàn)明顯增高。ICAM-1與白細(xì)胞表面的LFA-1受體相結(jié)合,介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用,釋放炎性介質(zhì),引起組織水腫,加重肺組織損傷[15]。由此可推斷,氣泡導(dǎo)致的嚴(yán)重炎性反應(yīng)在重癥DCS發(fā)病過(guò)程中,尤其是對(duì)加重肺損傷起到了重要作用[16]。因此,急性肺損傷導(dǎo)致大鼠呼吸異常、缺氧、窒息可能是快速上浮脫險(xiǎn)致DCS大鼠死亡的主要原因。

紅花是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,具有活血化瘀、活絡(luò)通經(jīng)等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明,紅花具有優(yōu)秀的抗炎作用,對(duì)肺部炎性反應(yīng)可以產(chǎn)生抑制作用[17]。以往研究發(fā)現(xiàn),紅花和以紅花為主要成分的中藥、中成藥對(duì)減壓病有著一定的防治作用,可以改善脊髓型DCS嚴(yán)重程度[18],減輕DCS肺損傷[19]。菸花苷是紅花中的重要單體活性成分之一,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化損傷、保護(hù)神經(jīng)、抗缺血性腦卒中等作用[20,21],可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活性,上調(diào)eNOS的mRNA和蛋白表達(dá),改善缺血缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[22]。

在本項(xiàng)結(jié)果表明菸花苷在減輕大鼠肺組織炎性反應(yīng)的同時(shí)具有改善了肺組織內(nèi)皮細(xì)胞損傷,這也說(shuō)明損傷在短時(shí)間內(nèi)(<30 min)已經(jīng)引起了肺組織細(xì)胞mRNA水平的變化。因此,DCS大鼠早期肺損傷可能并非單純因?yàn)闅馀輰?duì)于肺組織的機(jī)械作用損傷,炎性因子的大量釋放和內(nèi)皮細(xì)胞功能的下降,也是肺組織損傷的重要因素。結(jié)合前期研究結(jié)果[2],可以推斷,出艙后的短期內(nèi)大鼠行動(dòng)障礙、抽搐痙厥等癥狀,不是單純的神經(jīng)系統(tǒng)損傷所造成,更可能是肺組織損傷引起的急性缺氧所導(dǎo)致。菸花苷對(duì)減壓病的預(yù)防作用,主要是菸花苷對(duì)于通過(guò)抑制炎性反應(yīng),減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)肺組織起到保護(hù)作用。但是,菸花苷對(duì)于肺組織內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用,是通過(guò)減輕炎性反應(yīng)或是增加內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的活性和表達(dá)等其他途徑實(shí)現(xiàn),尚不明確。

綜上所述,菸花苷可以對(duì)快速上浮脫險(xiǎn)致DCS的大鼠具有預(yù)防作用,可以降低大鼠肺組織炎性因子水平,減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷,對(duì)DCS大鼠肺組織起到保護(hù)作用,可以作為一種具有應(yīng)用前景的DCS預(yù)防藥物做進(jìn)一步研究。