王 琛,趙小建,孟 哲,李海禹,桑海強(qiáng)

心血管疾病中的急性心肌梗死是全球死亡的首要原因,目前的主要治療策略為保證罪犯動脈血運(yùn)的及時重建以保護(hù)冠狀動脈血流[1]。然而,除了直接的缺血性損傷,血流的復(fù)灌也會對心肌組織造成損傷,稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MI/RI)[2]。MI/RI是急性心肌梗死病人預(yù)后的關(guān)鍵影響因素,并與心力衰竭的發(fā)生及12個月內(nèi)的全因死亡率密切相關(guān)[3]。因此,預(yù)防及干預(yù)MI/RI期間的心肌細(xì)胞死亡至關(guān)重要。MI/RI期間心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)受損的確切機(jī)制尚未明確,涉及鈣超載、炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬和氧化應(yīng)激等多種機(jī)制的相互作用[4]。氧化/還原失衡介導(dǎo)的相關(guān)信號通路激活引起的氧化應(yīng)激是早期MI/RI的重要病理過程[5]。此外,當(dāng)梗死區(qū)域獲得血運(yùn)重建后,免疫細(xì)胞會識別梗死區(qū)域的壞死組織,進(jìn)而激活免疫細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號通路,引發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積[6]。研究表明,在MI/RI期間,核因子-κB(NF-κB)信號通路被激活,啟動心肌損傷相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,尤其是炎癥和凋亡蛋白,引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)從而加重MI/RI[7]。小檗堿可通過抑制高遷移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB通路的激活從而減輕MI/RI[8]。中藥在心血管疾病的臨床應(yīng)用中具有很大優(yōu)勢[9-11]。姜黃素(curcumin,Cu)是一種從植物中提取出的酚類化合物,為姜黃等的根莖,屬于姜科,具有抗炎、抗氧化、防治糖尿病等功效[12-14]。本研究通過建立大鼠MI/RI模型,探討姜黃素在MI/RI中的調(diào)節(jié)功能及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 姜黃素(貨號:HY-N0005)購自美國MCE生物科技公司。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索來寶科技有限公司。H9c2細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6,貨號:ERC003)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β,貨號:900-K91)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,貨號:ERC102a)試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司。肌酸激酶(creatine kinase,CK,貨號:BC1145)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH,貨號:BC0685)活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物公司。四唑鹽(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物公司。HMGB1抗體(貨號:6893)、核因子抑制蛋白(inhibitor kappa B alphaI,IκBα)抗體(貨號:4814)、p-IκBα抗體(貨號:2859)、NF-κB p65抗體(貨號:8242)、p-NF-κB p65抗體(貨號:3033)試劑盒均購自Cell Signaling Technology公司。多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司,1410101),化學(xué)發(fā)光呈像儀(上海天能公司,Tanon 5200),蛋白電泳轉(zhuǎn)膜儀(上海天能公司, Tanon EPS600),全自動快速研磨儀(上海凈信科技,Tissuelyser-96)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 健康8周齡Sprague-Dawley大鼠100只,體質(zhì)量250～300 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司上海分公司,動物許可證號:SCXK(滬)2022-0007,飼養(yǎng)于(23±2)℃的空調(diào)房中,12 h光照/黑暗循環(huán)。所有大鼠自由飲水飲食。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.2 心電圖檢測 采用BL-420S生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),在標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)上獲得造模7 d后大鼠MI/RI心電圖,計(jì)算各組大鼠ST段電壓。

1.3.3 心肌梗死面積的測定 處死大鼠并取出心臟,37 ℃下用1%的2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)溶液在黑暗中染色10～15 min,翻面后繼續(xù)染色10～15 min。TTC與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)變紅,而缺血組織中的脫氫酶活性降低而不能反應(yīng)呈蒼白色。拍照后利用Image Pro Plus軟件計(jì)算梗死面積。

1.3.4 心臟病理變化的觀察 用生理鹽水清洗心臟組織,用4%的多聚甲醛固定24h后常規(guī)脫水包埋,按4 μm進(jìn)行連續(xù)切片,固定于載玻片上,HE染色后光鏡下觀察。

1.3.5 細(xì)胞模型的構(gòu)建 取對數(shù)生長期生長的H9c2細(xì)胞,分為對照組、缺氧/復(fù)氧組、姜黃素組,每組至少3個復(fù)孔。其中,對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)于37 ℃,飽和有5%CO2、95%O2的培養(yǎng)箱中;缺氧/復(fù)氧組、姜黃素組細(xì)胞棄原培養(yǎng)液,用飽和有95%N2和5%CO2的缺氧液代替,于三相培養(yǎng)箱中連續(xù)曝氣6 h模擬缺氧,用飽和有95%N2和5%CO2的混合氣體復(fù)氧。其中,姜黃素組于缺氧模型構(gòu)建前30 min于無血清培養(yǎng)基中加入濃度為20 μmol/L的姜黃素構(gòu)建模型。

1.3.6 MTT法測定細(xì)胞活力 將H9c2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞生長良好并融合至80%左右時,每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL),連續(xù)培養(yǎng)4 h后,輕輕棄去上層液體,每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min后,采用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度A值(檢測波長570 nm)。

1.3.7 CK、LDH、IL-6、IL-1β和TNF-α的測定 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒說明書檢測各組小鼠血清和細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平;采用酶活性檢測試劑盒檢測各組小鼠血清CK和LDH水平。

1.3.8 HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白檢測 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)從裂解的心臟組織液和H9c2細(xì)胞中提取總蛋白進(jìn)行HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白定量檢測。將蛋白樣品置于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中,將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜后,將含有蛋白樣品的試紙條置于5%的脫脂牛奶中,室溫下封閉2 h后,一抗中4 ℃孵育過夜。第2天,Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST液)洗滌4次,每次10 min。將PVDF膜置于二抗溶液中,在搖床上室溫孵育2 h后,用TBST洗滌4次,每次10 min。采用凝膠成像系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行均勻曝光和掃描并分析灰度值。

2 結(jié) 果

圖1 各組大鼠心肌梗死面積比較(比例尺1∶50)

圖2 各組大鼠心肌組織病理變化比較(×100)

表1 各組大鼠MI/RI引起的ST段變化水平比較(±s) 單位:mV

2.3 姜黃素對H9c2細(xì)胞活力的影響 與對照組比較,模型組、姜黃素組H9c2細(xì)胞活力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與缺氧/復(fù)氧組比較,姜黃素組H9c2細(xì)胞活力明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

與對照組比較, ＊ P<0.01;與缺氧/復(fù)氧組比較,# P<0.01。圖3 各組H9c2細(xì)胞活力比較

與對照組比較,＊ P<0.01,與模型組比較,# P<0.01。圖4 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較(A為各組IL-1β比較;B為各組IL-6比較;C為各組TNF-α比較)

與對照組比較,＊ P<0.01;與缺氧/復(fù)氧組比較,# P<0.01。圖5 各組H9c2細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較(A為各組IL-1β比較;B為各組IL-6比較;C為各組TNF-α比較)

與假手術(shù)組比較,＊ P<0.01;與模型組比較,# P<0.01。圖6 各組大鼠血清CK、LDH水平比較(A為各組LDH比較;B為各組CK比較)

與對照組比較,＊ P<0.01;與缺氧/復(fù)氧組比較,# P<0.01。圖7 各組H9C2細(xì)胞上清液中CK、LDH水平比較(A為各組LDH比較;B為各組CK比較)

圖8 各組大鼠心肌組織中HMGB1/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

與假手術(shù)組比較,＊ P<0.01;與模型組比較,# P<0.01。圖9 各組大鼠心肌組織中HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB p65水平比較(A為各組HMGB1比較;B為各組p-NF-κB p65比較;C為各組p-IκBα比較)

圖10 各組H9c2細(xì)胞中HMGB1/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

與對照組比較,＊ P<0.01;與缺氧/復(fù)氧組比較,# P<0.01。圖11 各組大鼠H9C2細(xì)胞中HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB水平比較(A為各組HMGB1比較;B為p-NF-κB p65比較;C為p-IκBα比較)

3 討 論

缺血性心臟病,尤其是急性心肌梗死,是全球死亡的主要原因[15]。因此,針對缺血性心臟病及相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示,姜黃素干預(yù)可降低MI/RI大鼠的心肌酶和炎性因子水平,恢復(fù)MI/RI大鼠的ST段改變,并減輕心肌組織損傷,姜黃素對MI/RI的保護(hù)作用與抑制HMGB1/NF-κB信號通路的激活相關(guān),提示姜黃素具有抗大鼠MI/RI作用。

早期MI/RI發(fā)生的病理過程主要是由氧化/還原失衡導(dǎo)致相關(guān)信號通路的激活,而引發(fā)的氧化應(yīng)激所介導(dǎo)的[16]。研究表明,姜黃素可通過調(diào)節(jié)線粒體自噬來減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷[17];也可通過上調(diào)核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)的RNA水平從而上調(diào)超氧化物歧化酶的表達(dá)來減輕氧化應(yīng)激損傷[18]。也有研究表明,姜黃素可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,減輕細(xì)胞凋亡從而改善MI/RI[19]。此外,姜黃素可通過抑制炎癥反應(yīng)、減少凋亡、改善氧化應(yīng)激損傷來發(fā)揮抗MI/RI作用[20]。本研究結(jié)果顯示,姜黃素可改善MI/RI模型大鼠心電圖ST段改變,減少心肌梗死面積,降低心肌酶水平,緩解心肌組織病理損傷,并抑制MI/RI中相關(guān)炎癥通路的激活。

NF-κB信號通路作為最經(jīng)典的炎癥信號通路參與調(diào)控機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)。在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡過程中,卡維地洛可通過抑制NF-κB通路來降低Bcl-2相關(guān)的凋亡蛋白的表達(dá),從而抑制心肌細(xì)胞凋亡[6]。研究顯示,在離體內(nèi)皮細(xì)胞中,姜黃素可降低促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性從而抑制炎癥信號通路的激活[21]。與上述研究類似,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),姜黃素可抑制NF-κB信號通路的激活,并下調(diào)其下游炎性因子的表達(dá)從而減輕MI/RI。HMGB1為存在于細(xì)胞核中的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,用于維持核小體結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,后經(jīng)證實(shí)其也是一種細(xì)胞因子,于細(xì)胞損傷時釋放[22]。已研究表明,小檗堿可通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路的激活從而減輕MI/RI,提示HMGB1在MI/RI中的重要作用[8]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),姜黃素可阻斷HMGB1/NF-κB通路的激活,并可下調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性細(xì)胞因子水平。

在動脈粥樣硬化的載脂蛋白E敲除小鼠模型中,姜黃素可通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子來減少巨噬細(xì)胞浸潤從而減輕血管炎癥最終改善動脈粥樣硬化[23]。姜黃素還通過降低全身炎性細(xì)胞因子(如IL-6、TNF-α和C-反應(yīng)蛋白等)的水平減輕動脈粥樣硬化[24]。此外,姜黃素還可降低人血管平滑肌細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白1的表達(dá)減輕動脈粥樣硬化[25]。在本研究中,MI/RI大鼠血清和缺氧/復(fù)氧的H9c2細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,姜黃素干預(yù)可顯著降低上述炎性細(xì)胞因子的水平。

本研究證實(shí)了姜黃素在MI/RI中的保護(hù)作用,也初步探索了姜黃素發(fā)揮抗MI/RI作用的可能機(jī)制。但本研究只進(jìn)行了初步的探索,姜黃素發(fā)揮抗MI/RI作用是否還通過其他作用機(jī)制,如抑制線粒體應(yīng)激或抑制其他信號通路激活來抑制炎癥反應(yīng)仍需要進(jìn)一步深入研究。此外,本研究未檢測丙二醛、超氧化物歧化酶等的水平,未能證實(shí)姜黃素是否也可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮抗MI/RI作用。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,姜黃素可通過降低ST段抬高幅度,減少心肌缺血面積,降低心肌酶和炎性因子水平來減輕MI/RI,這種心肌保護(hù)作用可能是通過HMGB1/NF-κB通路介導(dǎo)的。