許樺 鄧金鳳

目前，合成色素已廣泛應用于食品生產加工中，在蛋糕生產中也多有應用。合成色素即人工合成的色素，具有色澤鮮艷、著色力強、色調多樣等優(yōu)點，但也有一個大缺點，即具毒性（包括毒性、致瀉性和致癌性），因而會對人體造成不同程度的危害。基于此，本研究以蛋糕為研究對象，采用高效液相色譜法（HPLC）對蛋糕中的合成色素進行了檢測。

一、材料與設備

1.材料與試劑。甲醇（預層析純化、過濾脫氣），瑞典Upson Chemical Co.，Ltd.；醋酸銨（超純，0.02mol/L溶液配制，脫氣過濾器），百威化學有限公司；醋酸鋅（可用21.9%水溶液）、鐵氰化鉀（可用10.6%水溶液）、無水乙醇、氨水、檸檬酸（可用20.0%水溶液），均為分析純；聚酰胺粉末（100-200目），中國醫(yī)藥集團實業(yè)有限公司；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅、新紅，國家研究中心參考資料；Low Performance Polyamide （2g，12mL），Angelen Technology Ltd.；測試水-超純水（電阻率18.3mq/m2）；市售蛋糕。

2.試驗設備。主要儀器包括紫外檢測器、高速離心機、渦流發(fā)生器、低溫制冷機和24位標準固相萃取儀。

二、試驗與方法

1.試驗溶液制備。合成色素分析中的溶液主要有檸檬酸溶液、檸檬酸鈉溶液、醋酸銨溶液、無水乙醇、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、標準儲備液和混合標準溶液。先將檸檬酸溶液與21.01g檸檬酸和1L水混合，充分攪拌；再取29.41g檸檬酸鈉溶液與1L水混合均勻；配置無水乙醇溶液時，將70mL無水乙醇、20mL氨水和10mL水充分混勻；從標準儲備液中取上述色素0.1g，放入容量為100mL的瓶裝水中，至多100mL；配制混合標準溶液時，取上述溶液2mL，加水100mL配成染料。

2.高效液相色譜條件。色譜柱：C18柱，5hm，4.6mm*250mm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；注射次數：10次；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和赤蘚紅的檢測波長為254nm，亮藍色的檢測波長為595nm；0.02mol/L醋酸銨和甲醇為流動相，洗脫梯度如表1所示。

3.曲線標準。取1mg/mL的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、苔蘚紅、新紅標準品，精密吸取0.1mg/mL的混合標準液0.10mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.0mL，分別置于5個10mL容量瓶中，用現(xiàn)制的一級水定容至刻度搖勻，制劑新紅的濃度分別為1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、7.5μg/mL、10.0μg/mL。另精密吸取0.1mg/mL的混合標準液1.0mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL，分別置于5個10mL容量瓶中，用超純水定容后搖勻，制得標準濃度分別為10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL的混合標準溶液。根據色譜條件進行高效液相色譜分析，根據峰面積和對應濃度生成標準曲線。

4.試驗方法。（1）選擇一部分蛋糕進行均質化。（2）將5g蛋糕樣品放入30mL離心管中，再放入10mL無水乙醇、氨水和水的混合液中，超聲處理10min，離心10min，選擇澄清的沉淀液，然后繼續(xù)加入無水乙醇混合溶液，提取兩次。（3）選擇提取的清洗液，在-42℃條件下冷凍0.5h、1h、3h、5h、12h。冷凍后，將離心機放入冷凍離心機中離心5min，然后取出清洗液。（4）除去透明溶液并在高溫下濃縮，調節(jié)pH值至6-7以獲得濃縮溶液。（5）將濃縮液用固相聚酰胺萃取塔過濾，用檸檬酸鈉溶液精制，再用無水乙醇和氨水混合液精制，將初期流出液清除后，保存剩余流出液，在50℃條件下將氮氣增濃至0.8mL，再加入0.2mL醋酸銨溶液殘渣，配制液用水微孔濾器過濾，濾液用液相色譜法測定。（6）優(yōu)化層析條件。色譜柱的溫度保持在30℃，流動相A為0.02mol/L醋酸銨溶液、0.02mol/L醋酸鈉氨溶液，流動相B為甲醇。（7）制作基質匹配標準曲線，取5g空樣置于30mL離心管中，分別加入不同量的合成染料，直至完全均勻冷卻，重復提取操作。

三、研究與分析

1.優(yōu)化處理樣品。（1）樣品的預處理。蛋糕基質含有大量的脂肪和蛋白質，會阻礙后續(xù)實驗，必須提前去除。8種色素易溶于水，不溶于油，故本試驗采用油醚萃取脫脂，效果較好，色素回收率也未受到嚴重影響。由于蛋白質會吸附色素，本實驗使用21.9%的醋酸鋅和10.6%的鐵氰化鉀溶液進行蛋白質沉積，同時加入軟膏以提取色素。在強烈的超聲波振動下，包裹在蛋白質中的色素被釋放到樣品提取物中。

（2）優(yōu)化清洗條件。提取物通過持久性聚酰胺提取進行精制，并與聚酰胺粉末的吸附性進行比較。聚酰胺粉末吸附法需要較高的運行溫度，色素回收率非常低，而聚酰胺柱固相萃取工藝簡單，溶劑含量低，8種色素的回收率均得到顯著提高。

（3）優(yōu)化色譜條件。本試驗測試了8種合成色素的分離，流速分別為0.3mL/min、0.5mL/min和1.0mL/min。當流速為0.5mL/min時，8種色素分離良好，峰值尖銳，分析效果好，分析時間中等。結合達到峰值時間、色素分離效果、儀器柱壓力等因素，最終確定0.5mL/min為最佳流速。8種色素基本上可以在四個溫度下分離，但由于測量溫度高于室溫，環(huán)境對測量溫度影響不大，溫度波動小，因此選擇30℃作為測量溫度。

2.選擇固相萃取柱。固體萃取塔由固體吸附劑組成，將吸附試樣中的目標化合物與主要干擾物質分離，然后用去污劑清洗，達到分離和濃縮的目的。市場上大多數的固相吸附劑很相似，通常導致回收率低，純度不完整，分析材料重復性差。將市場上銷售的多個固相萃取塔進行比較，發(fā)現(xiàn)Strata X-AW固相萃取塔可以有效滿足實驗要求。Strata X吸附劑采用創(chuàng)新的聚合物技術，其中二胺基是帶電酸性化合物，能夠100%洗滌，切實提高檢測方法的靈敏度和可重復性。

3.曲線檢出限。曲線檢出限的測試結果如表2所示。從表2可知，采用該測試方法對8種線性范圍寬、線性好、檢出限低的合成色素進行分離分析，可以滿足裝飾蛋糕中合成色素的檢測要求。

為檢測樣品中8種合成色素的回收率和精密度，選取空白蛋糕加入8種不同牌號的合成色素，按試驗方法配制樣品溶液，測定6次的回收率和相對標準偏差。取出后，將精制后的溶液放入冰箱-4℃降溫，每隔1h、4h、8h、12h、24h、48h、168h取樣，室溫保存，待測。機器比較儲存時間與樣品溶液對目標物質的影響結果表明，樣品溶液在-4℃下冷卻一周，各色素的出峰時間無明顯變化，色譜峰重現(xiàn)良好，說明樣品溶液在-4℃下冷卻一周并不影響檢測結果，適用于批量樣品處理檢測。

4.樣品提取優(yōu)化。在蛋糕中加入少量色素，可以使蛋糕更加美觀。本實驗以5g陰性樣品中6種色素含量為4mg/kg作為研究對象，對環(huán)境條件的優(yōu)化進行研究，包括提取溶劑的選擇、提取時間、提取溫度的確定。由于色素易溶于水和微量液體，故選用水、0.4%氫氧化鈉水溶液和0.4%氫氧化鈉乙醇水溶液作為提取溶劑進行比較，其他操作與色譜研究完全相同，只是將樣品加入標準樣品中，提取時間為1次。實驗發(fā)現(xiàn)，樣品中的色素能被水溶解，提取物的顏色很淺，色素明顯牢固地吸附在固體上。結果表明，0.4%的氫氧化鈉水溶液可以提取部分色素，但對淺色素的提取十分不利。

5.聚酰胺粉用量。實驗研究了兩種聚酰胺粉末和不同用量對8種色素吸附和解吸的影響。使用市場上常用的兩種粉末，實驗中檢測到的聚酰胺粉體和色素的種類與數量在萃取液酸化后吸附良好，但30-100目聚酰胺粉體解吸不完全，有部分殘留色素。聚酰胺粉末的用量對分析結果影響很大，100-200目聚酰胺粉的回收率遠高于30-100目，使用0.5g聚酰胺粉末時回收量超過1.0g，回收率為90%-97%。可以看出，粉末含量低，顆粒大，顆粒中吸附的色素不能被解吸液完全分解吸收，導致還原率低；粉末含量高，細粉，解吸完全。因此，選擇0.5g的100-200目聚酰胺粉末作為試驗條件。

6.油脂去除分析。蛋糕制品含有大量脂肪，如果脂肪沒有完全去除，會影響和干擾實驗。實驗中，在陰性樣品中加入標準溶液（4mg/kg）作為實驗樣品進行實驗對比。在第一組實驗中，提取物中含有大量的油，酸化后變得渾濁，聚酰胺粉末沒有完全吸收色素，一些色素留在溶液中。同時，包封在油中的色素無法通過過濾釋放出來。雖然g2玻璃砂礫漏斗和70%乙醇水溶液在后續(xù)抽濾中可以去除部分油脂，但最終溶液中仍有雜質存在；基本漂移和劇烈波動會嚴重影響8種色素的結果分析和檢測靈敏度；回收率很低，結果僅為55%-65%。在第二組中，脫脂后的樣品根據上述實驗操作進行處理，結果顯著優(yōu)于非脫脂組。

在選擇萃取溶劑時，本實驗比較了混合溶劑乙醚和石油醚的分析效果。采用乙醚萃取時，誘惑紅的萃取率很低，只有50%，而其余五種色素的萃取率為80%-83%。采用石油醚（1+1）混合液萃取，可以顯著提高誘惑紅的回收率，效果達到90%以上，剩下的7個結果也很不錯。因此，選擇石油醚（1+1）混合溶液作為萃取溶劑。

作者簡介：許樺（1993-），男，漢族，廣西貴港人，助理工程師，大學本科，研究方向為食品檢測。

鄧金鳳（1993-），女，漢族，廣西貴港人，助理工程師，大學本科，研究方向為食品檢測。