張靜　劉倩　范雪梅　韓福國(guó)　張貴民　關(guān)永霞　程國(guó)良　李冰　王義明　羅國(guó)安　劉清飛

摘要 目的：研究蒼耳子炮制前后對(duì)小鼠的急性毒性及主要毒性成分、藥效成分的含量差異。方法：急性毒性實(shí)驗(yàn)采用小鼠灌胃給藥測(cè)定其半數(shù)致死量（LD50）和最大耐受量（MTD），并通過(guò)組織病理切片觀察其對(duì)小鼠肝、腎等臟器的損傷；采用高效液相色譜法比較蒼耳子炮制前后2種水溶性苷類毒性成分和4種酚酸類有效成分的含量差異。結(jié)果：蒼耳子的水煎劑和水煎劑醇沉沉淀，以及炒蒼耳子的水煎劑和水煎劑醇沉沉淀的MTD分別為291.73 g生藥/kg、405.75 g生藥/kg、318.64 g生藥/kg和480.77 g生藥/kg。炮制前后蒼耳子水煎劑醇沉上清的LD50分別為468.18 g生藥/kg和573.48 g生藥/kg。組織病理結(jié)果顯示死亡小鼠多數(shù)臟器出現(xiàn)不同程度的充血，以肝、肺、胃和小腸最為明顯。蒼耳子炮制后，水煎劑和水煎劑醇沉上清液中的羧基蒼術(shù)苷含量均顯著降低（均P<0.01）；炒蒼耳子中咖啡酸和異綠原酸C的含量顯著升高（均P<0.01）。結(jié)論：蒼耳子炮制后毒性可顯著降低，有效成分溶出增加。水煎劑醇沉上清液取自蒼耳子的主要毒性部位。

關(guān)鍵詞 蒼耳子；炮制；水煎劑；醇沉；急性毒性；酚酸類成分；水溶性苷類成分；高效液相色譜法

Comparative Analysis of Acute Toxicity and Content of Toxic and Active Components in Crude and Processed Xanthii Fructus

ZHANG Jing1，2，LIU Qian1，2，F(xiàn)AN Xuemei2，HAN Fuguo2，ZHANG Guimin3，GUAN Yongxia3，CHENG Guoliang3，LI Bing3，WANG Yiming4，LUO Guoan4，LIU Qingfei2

（1 School of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 2 School of Pharmaceutical Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084，China; 3 State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine，Lunan Pharmaceutical Group Corporation，Linyi 276006，China; 4 Department of Chemistry，Tsinghua University，Beijing 100084，China）

Abstract Objective：To study the difference in acute toxicity in mice and the content of toxic and active components of Xanthii Fructus before and after stir-frying.Methods：In the acute toxicity experiment，mice were administered by gavage，and the median lethal dose（LD50） and the maximum tolerated dose（MTD） in mice were determined.The damage to the liver，kidney，and other organs of mice was observed by histopathological sections.The content of two water-soluble glycosides and four phenolic acids of crude and processed Xanthii Fructus was quantitatively determined by high-performance liquid chromatography（HPLC）.Results：MTDs of water decoction and precipitate after alcohol precipitation of crude Xanthii Fructus and water decoction and precipitate after alcohol precipitation of processed Xanthii Fructus were 291.73，405.75，318.64，and 480.77 g/kg（calculated based on the crude drug），respectively.The LD50 values of supernatant after alcohol precipitation of crude and processed Xanthii Fructus were 468.18 and 573.48 g/kg（calculated based on the crude drug），respectively.Hyperemia of different degrees was observed in the pathological sections of the main organs of the dead mice，especially in the liver，lung，stomach，and small intestine.The content of carboxyatractyloside in the water decoction and supernatant after alcohol precipitation decreased after stir-frying（both P<0.01），and the content of caffeic acid and isochlorogenic acid C increased（both P<0.01）.Conclusion：After stir-frying，the toxicity of Xanthii Fructus was significantly reduced and the dissolution of active components increased.The supernatant after alcohol precipitation of water decoction was the main toxic part of Xanthii Fructus.

Keywords Xanthii Fructus; Stir-frying; Water decoction; Alcohol precipitation; Acute toxicity; Phenolic acids; Water-soluble glycosides; HPLC

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.009

蒼耳子是菊科蒼耳（Xanthium sibiricum Patrin.ex Widder）的干燥成熟帶總苞的果實(shí)，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載為中品，味甘、溫，歸肺經(jīng)，具有散風(fēng)濕、通鼻竅的功效，主要用于風(fēng)寒頭痛、鼻淵流涕、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢等癥的治療。蒼耳子為歷代治療鼻淵頭痛的要藥，在治療鼻淵的方劑中常作為君藥使用［1］。近年來(lái)其復(fù)方制劑不斷研發(fā)，例如鼻淵通竅顆粒由《嚴(yán)氏濟(jì)生方》中的經(jīng)典名方蒼耳子散加減而成，以蒼耳子和辛夷作為君藥，對(duì)急慢性鼻炎、鼻竇炎等外邪犯肺證具有顯著療效［2］。

蒼耳子主要含有酚酸類、倍半萜內(nèi)酯類、噻嗪雙酮雜環(huán)類等活性化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用［3］。蒼耳子生品有毒性，一般炒制后入藥，過(guò)量使用或者炮制不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致中毒甚至死亡［4］。羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷是蒼耳子的主要毒性成分［5］，炒制時(shí)會(huì)被高溫破壞，且隨溫度升高，其含量下降［6］。目前已有學(xué)者開展了蒼耳子炮制前后毒性和化學(xué)成分的相關(guān)研究，但研究比較分散，結(jié)果也存在差異。鄢良春等［7］研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳子和炒蒼耳子對(duì)小鼠毒性的差異不明顯，但二者水提物的毒性明顯高于醇提物。吳慧等［8］研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳子的毒性主要是水提醇沉后的醇提物，炮制后醇提物的毒性明顯降低。有研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子炒制后綠原酸、1，5-二咖啡酰奎寧酸的含量降低［9］，總酚酸的含量也降低［10］。但杜蓉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，炒蒼耳子水煎劑中的綠原酸、1，5-二咖啡?？鼘幩峒翱偡铀岷糠炊?。

本文參考蒼耳子在臨床使用的常用劑型，對(duì)蒼耳子炮制前后不同提取部位的急性毒性以及主要水溶性苷類與酚酸類成分的含量變化進(jìn)行比較研究，明確蒼耳子主要的毒性提取部位及炮制對(duì)蒼耳子急性毒性、不同提取部位中毒性成分和藥效成分含量的影響，并探討急性毒性機(jī)制，為蒼耳子炮制后“減毒增效”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取無(wú)特定病原體（Specific Pathogen-Free，SPF）級(jí)ICR小鼠180只，6周齡，雌雄各半，體質(zhì)量22～28 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22～23 ℃，濕度60%～70%，每天光照與黑夜交替各12 h。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：21-LQF1）。

1.1.2 藥物 蒼耳子（北京萬(wàn)泰利克藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20201103S）和炒蒼耳子（北京萬(wàn)泰利克藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20201103P），其中炒蒼耳子為同批蒼耳子生品按照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》［12］清炒法（通則0213）炮制而成。經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所路娟副研究員鑒定為菊科蒼耳子屬植物蒼耳Xanthium sibiricum Patrin.ex Widder的干燥果實(shí)。

1.1.3 試劑與儀器 甲醇（默克公司，德國(guó)，批號(hào)：WXBB6448V），乙腈（霍尼韋爾國(guó)際公司，批號(hào)：UC2A1H），甲酸（北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20111010），乙酸銨（北京邁瑞達(dá)科技有限公司，批號(hào)：02005009），咖啡酸（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17122804），綠原酸（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17101904），異綠原酸A（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17061201），異綠原酸C（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：160724），羧基蒼術(shù)苷三鉀鹽（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z17O8X44646）和蒼術(shù)苷二鉀鹽（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z17O8X44547）；高效液相色譜系統(tǒng)（島津公司，日本，型號(hào)：LC-20AT），分析天平（梅特勒-托利多，瑞士，型號(hào)：X2015DU），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琦公司，瑞士，型號(hào)：R-3HB），真空干燥箱（上海恒科儀器有限公司，型號(hào)：DZF-6050），倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本，型號(hào)：IX73P1F），低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司，型號(hào)：LD5-2B）。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性研究

1.2.1.1 受試藥物的制備 稱取蒼耳子和炒蒼耳子，分別加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2 h/次，煎煮2次后合并煎液，濾過(guò)。將每種濾液按體積分成2等份，一份濃縮、干燥，得蒼耳子水煎劑干膏（Decoction of Xanthii Fructus，DX）和炒蒼耳子水煎劑干膏（Decoction of Fried Xanthii Fructus，DFX），得率分別為8.29%和7.59%；另一份濃縮至密度約為1.15 g/mL，加入乙醇至濃度80%，放置12 h后，2 130×g離心10 min，分離上清液和沉淀，分別進(jìn)行干燥，即得蒼耳子水煎劑醇沉上清干膏（Alcohol Supernatant of Xanthii Fructus，SX）、炒蒼耳子水煎劑醇沉上清干膏（Alcohol Supernatant of Fried Xanthii Fructus，SFX）、蒼耳子水煎劑醇沉沉淀干膏（Alcohol Precipitation of Xanthii Fructus，PX）和炒蒼耳子水煎劑醇沉沉淀干膏（Alcohol Precipitation of Fried Xanthii Fructus，PFX）。SX和PX得率分別為3.69%和4.55%，SFX和PFX得率分別為3.28%和4.04%。干膏于干燥條件下4 ℃密閉保存，臨用以純水現(xiàn)配。

1.2.1.2 最大耐受量（Maximum Tolerated Dose，MTD）測(cè)定 預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，受最大給藥容積的影響，DX、DFX、PX和PFX對(duì)小鼠最大劑量給藥，給藥后小鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，無(wú)法測(cè)定藥物對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（50％ Lethal Dose，LD50），故采用1 d內(nèi)多次給藥測(cè)定其MTD。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和4種提取物給藥組，每組10只，雌雄各半。禁食不禁水12 h后，灌胃給藥3次，間隔4 h，單次給藥體積為40 mL/kg，DX、DFX、PX和PFX總給藥劑量分別為291.73 g生藥/kg、318.64 g生藥/kg、405.75 g生藥/kg、456.97 g生藥/kg。正常對(duì)照組小鼠灌胃等量體積溶劑。給藥后每天觀察小鼠的毛色、進(jìn)食與活動(dòng)狀態(tài)，記錄體質(zhì)量、出現(xiàn)的毒性反應(yīng)和死亡情況，持續(xù)觀察14 d。

1.2.1.3 LD50LD50測(cè)定 采用小鼠急性系統(tǒng)毒性試驗(yàn)方法［13］，將小鼠隨機(jī)分為13組，每組10只，雌雄各半，包括空白對(duì)照組、SX和SFX各6個(gè)劑量組。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)獲得的SX和SFX小鼠灌胃給藥的絕對(duì)致死量（Absolute Lethal Dose，LD100），設(shè)為最高劑量組給藥劑量，組間劑量比為1∶0.80～1∶0.95。SX和SFX組1～6對(duì)應(yīng)的給藥劑量分別為294.91 g生藥/kg（SX組1）、368.64 g生藥/kg（SX組2）、419.90 g生藥/kg（SX組3）、460.80 g生藥/kg（SX組4）、518.04 g生藥/kg（SX組5）、576.00 g生藥/kg（SX組6）和375.84 g生藥/kg（SFX組1）、442.17 g生藥/kg（SFX組2）、520.20 g生藥/kg（SFX組3）、612.00 g生藥/kg（SFX組4）、720.00 g生藥/kg（SFX組5）、847.00 g生藥/kg（SFX組6）。試驗(yàn)前禁食不禁水36 h，給藥體積為40 mL/kg，灌胃給藥1次；正常對(duì)照組小鼠灌胃等量體積的溶劑。給藥后2 h內(nèi)密切觀察，當(dāng)天每4小時(shí)觀察1次，之后每天觀察并稱重，連續(xù)觀察7 d，詳細(xì)記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)和死亡情況。對(duì)SX和SFX的最高劑量組死亡的小鼠取主要臟器心、肝、脾、肺、腎、胃和腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.2 水溶性苷類成分含量測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Positisil ODS-P（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.01 mol/L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～12 min：11%～15% B；12～30 min：15%～18% B；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取羧基蒼術(shù)苷三鉀鹽和蒼術(shù)苷二鉀鹽對(duì)照品適量，精密稱定，分別加純水制成1 mL含羧基蒼術(shù)苷三鉀鹽0.75 mg、蒼術(shù)苷二鉀鹽1.46 mg的溶液，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液（折算成羧基蒼術(shù)苷、蒼術(shù)苷濃度分別為0.65 mg/mL和1.32 mg/mL）。

1.2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.2.2”項(xiàng)下的各對(duì)照品儲(chǔ)備液，用純水稀釋配制為梯度濃度的混合溶液，按1.2.2.1項(xiàng)下高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（g/mL）為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.2.4 供試品溶液的制備與測(cè)定 精密稱取“1.2.1.1”項(xiàng)下制備的DX、DFX、SX和SFX各0.10 g，置離心管中，精密加入30 mL純水，超聲（500 W，40 kHz）10 min，搖勻后2 130×g離心10 min取上清液，用0.45 m的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得DX、DFX、SX和SFX的供試品溶液。按1.2.2.1項(xiàng)下HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各供試品中的羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷的含量。

1.2.3 酚酸類成分的含量測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：0.5%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）。梯度洗脫：0～35 min10%～17% B；35～45 min，17%～35% B；45～55 min35% B；55～65 min35%～60% B；65～85 min60%～95% B。流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取咖啡酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含咖啡酸0.45 mg、綠原酸0.82 mg、異綠原酸A 0.11 mg、異綠原酸C 0.33 mg的溶液，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.3.2”項(xiàng)下的各對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制為梯度濃度的混合溶液，按“1.2.3.1”項(xiàng)下HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（g/mL）為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.3.4 供試品溶液的制備及與測(cè)定 取蒼耳子和炒蒼耳子藥材，粉碎過(guò)三號(hào)篩，各精密稱定1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30 mL甲醇，稱定重量，浸泡30 min后，超聲（500 W，40 kHz）提取60 min，放至室溫后以甲醇補(bǔ)足重量。搖勻后2 130×g離心10 min取上清液，用0.45 m的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得蒼耳子和炒蒼耳子的供試品溶液。按“1.2.3.1”項(xiàng)下HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各供試品中的咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C和綠原酸的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Bliss法計(jì)算LD50和95%CI；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性研究結(jié)果

2.1.1 MTD測(cè)定結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，各給藥組小鼠給藥后均出現(xiàn)活動(dòng)減少，部分動(dòng)物尾部輕微發(fā)紺，對(duì)外界刺激有反應(yīng)。PX和PFX組在給藥后10～30 min恢復(fù)活動(dòng)，開始進(jìn)食；而DX組和DFX組的小鼠在給藥后20 min～1 h恢復(fù)活動(dòng)；各組小鼠在給藥后第2天均恢復(fù)正常。觀察14 d，動(dòng)物行為活動(dòng)、攝食、飲水均未見異常，各給藥組小鼠未出現(xiàn)死亡。PX的小鼠灌胃給藥MTD明顯高于PFX的，且二者的小鼠灌胃給藥MTD均明顯高于DX組和DFX組；觀察期間各組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說(shuō)明蒼耳子的水煎劑醇沉沉淀毒性低于水煎劑，二者不良反應(yīng)均不明顯。見表1。

2.1.2 LD50測(cè)定結(jié)果

2.1.2.1 毒性反應(yīng)及LD50值 SX和SFX給藥5 min后，各組小鼠均出現(xiàn)靜臥不動(dòng)，呼吸變深變慢。給藥15 min后，毒性嚴(yán)重的小鼠開始焦慮走動(dòng)，進(jìn)而出現(xiàn)劇烈震顫、抽搐、跳躍，呼吸加深停止后，心臟停止跳動(dòng)，小鼠死亡。各組存活小鼠表現(xiàn)為心跳加快、呼吸變慢、靜臥休息，未出現(xiàn)痛苦掙扎行為，在給藥后30～240 min內(nèi)逐漸恢復(fù)行動(dòng)，并開始進(jìn)食，第2天均恢復(fù)正常，給藥劑量越高，小鼠恢復(fù)越慢。SX給藥最高劑量組（SX組6，576.00 g生藥/kg）和SFX給藥最高劑量組（SFX組6，847.00 g生藥/kg）小鼠死亡多發(fā)生在給藥后10～40 min內(nèi)，其余劑量組死亡小鼠的死亡時(shí)間主要分布于給藥后30～120 min間。對(duì)死亡小鼠立即解剖，可見小鼠胃腸均有大量尚未吸收的藥液，腸道大部分充滿透明的黃色液體；個(gè)別小鼠胃底部有充血，SX組5（518.04 g生藥/kg）和SFX組5（720.00 g生藥/kg）的個(gè)別小鼠肝臟大葉及小葉的邊緣色澤較淡，為淺粉紅色，其余臟器未見明顯異常。

統(tǒng)計(jì)各劑量組小鼠死亡率，SFX組3（520.20 g生藥/kg）與SX組5（518.04 g生藥/kg）給藥劑量相近，但SFX組3的小鼠死亡率（40%）明顯低于SX組5的（90%）。通過(guò)Bliss法計(jì)算得SX和SFX的LD50及其95%CI，SX為468.18（426.26～514.22）g生藥/kg，SFX為573.48（531.18～618.79）g生藥/kg。由結(jié)果可知，SFX的LD50明顯高于SX，說(shuō)明炮制后蒼耳子水煎劑上清液的急性毒性明顯降低。見圖1。

2.1.2.2 存活小鼠體質(zhì)量變化 灌胃給藥后，存活小鼠飼養(yǎng)7 d后的體質(zhì)量變化除了SX高劑量組僅存活的1只體質(zhì)量增長(zhǎng)低于正常對(duì)照組外，其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），體質(zhì)量隨周齡增長(zhǎng)。SFX的各劑量組存活動(dòng)物的體質(zhì)量變化與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），均隨周齡增長(zhǎng)。見表2。

2.1.2.3 毒性靶器官鑒定 SX和SFX最高劑量組死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸組織病理學(xué)檢查結(jié)果。見圖2。蒼耳子對(duì)小鼠的臟器急性毒性主要表現(xiàn)為臟器充血，肝臟、肺臟、胃黏膜、小腸出現(xiàn)嚴(yán)重充血，心臟、腎臟、脾臟也出現(xiàn)了輕微充血現(xiàn)象。相較SFX而言，SX給藥最高劑量組（SX組6，576.00 g生藥/kg）小鼠臟器充血現(xiàn)象更為嚴(yán)重。此外，二組小鼠均可觀察到肺泡壁細(xì)胞層次增厚現(xiàn)象與肝臟吞噬細(xì)胞捕獲毒性物質(zhì)現(xiàn)象，其中后者以SX組更為明顯。僅SX給藥最高劑量組（SX組6，576.00 g生藥/kg）小鼠的脾臟出現(xiàn)了早期急性免疫現(xiàn)象，可觀察到組織細(xì)胞吞噬、增生以及紅髓和白髓的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞現(xiàn)象。綜上分析，與炒蒼耳子相比，蒼耳子水煎劑醇沉上清液對(duì)小鼠主要臟器的急性毒性損傷相對(duì)更為嚴(yán)重，說(shuō)明炮制可以減輕蒼耳子對(duì)小鼠臟器造成的急性損傷。

2.2 水溶性苷類毒性成分差異

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 建立了羧基蒼術(shù)苷與蒼術(shù)苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程和線性范圍結(jié)果表明2種水溶性苷類成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表3。

2.2.2 供試品中水溶性苷類毒性成分含量測(cè)定 通過(guò)HPLC測(cè)定各供試品中的羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷的含量。因二者均為貝殼杉烷型二萜糖苷類成分，具末端吸收，所以色譜圖基線均出現(xiàn)一定漂移。見圖3。DFX與DX相比，羧基蒼術(shù)苷的含量顯著降低（P<0.01），但蒼術(shù)苷的含量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SFX與SX相比，羧基蒼術(shù)苷的含量顯著降低（P<0.01），但蒼術(shù)苷的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。此外，比較SX與DX以及SFX與DFX，可發(fā)現(xiàn)羧基蒼術(shù)苷與蒼術(shù)苷的含量在蒼耳子水煎劑醇沉上清液中出現(xiàn)了明顯富集。上述結(jié)果表明，炮制可降低蒼耳子中水溶性苷類毒性成分羧基蒼術(shù)苷的含量，從而實(shí)現(xiàn)減毒作用；對(duì)于蒼耳子與炒蒼耳子，水煎劑醇沉上清液均取自其主要毒性部位。

2.3 酚酸類有效成分含量差異

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 建立了咖啡酸、綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程和線性范圍結(jié)果表明4種酚酸類成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表5。

2.3.2 供試品中4種酚酸類成分含量測(cè)定 通過(guò)HPLC法測(cè)定蒼耳子和炒蒼耳子中咖啡酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的含量。見圖4。與蒼耳子比較，炒蒼耳子中咖啡酸和異綠原酸C的含量顯著增加（P<0.01），而綠原酸和異綠原酸A的含量在炮制前后無(wú)明顯改變（P>0.05）。見表6。

3 討論

蒼耳子是古代記載有效但亦有毒的中藥，在使用前均必須炒制焦黃，并去刺，才可入藥。研究表明，蒼耳子毒性成分為主要是蒼術(shù)苷和羧基蒼術(shù)苷［5］，后者的毒性是前者的10倍［14］，其毒性機(jī)制主要為抑制細(xì)胞的氧化磷酸化［15］。在臨床上，蒼耳子過(guò)量使用或炮制不當(dāng)使用導(dǎo)致中毒、甚至死亡的病例時(shí)有報(bào)道，值得引起重視。因此，為了保證蒼耳子臨床使用的安全性，對(duì)其炮制前后毒性差異和毒性機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)、深入探索具有重要意義。

本研究采用蒼耳子傳統(tǒng)用藥方式水煎劑，比較其不同提取部位對(duì)小鼠的急性毒性差異。MTD測(cè)定結(jié)果表明，蒼耳子和炒蒼耳子的水煎劑和水煎劑醇沉沉淀在最大耐受給藥劑量下，皆不會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，不良反應(yīng)不明顯。鄢良春等［7］研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子水提物對(duì)昆明種小鼠（體質(zhì)量18～22 g）灌胃給藥的LD100為210 g生藥/kg，但未對(duì)毒性成分含量進(jìn)行檢測(cè)。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)ICR小鼠（體質(zhì)量22～28 g）灌胃給藥蒼耳子水煎劑最大劑量291.73 g生藥/kg時(shí)仍未出現(xiàn)小鼠死亡，故未能測(cè)得其LD100與LD50。推測(cè)可能與蒼耳子藥材質(zhì)量、提取工藝、動(dòng)物品系及體質(zhì)量等因素不同有關(guān)。

蒼耳子炮制前后水煎劑醇沉上清液LD50測(cè)定結(jié)果顯示，SFX的LD50明顯高于SX，同時(shí)，從小鼠臟器病理組織切片可以看出，SX對(duì)小鼠的臟器損傷較SFX嚴(yán)重。結(jié)合HPLC測(cè)定的水溶性苷類成分結(jié)果，SFX的羧基蒼術(shù)苷含量明顯低于SX，說(shuō)明蒼耳子炮制后毒性降低與毒性成分含量降低有關(guān)。炒蒼耳子的LD50相當(dāng)于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版推薦成人臨床口服劑量3～10 g/d的445～1 483倍［12］，表明蒼耳子在藥典用量下安全性較高。

毒理學(xué)研究表明蒼耳子毒性作用是多臟器、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的，主要以肝臟損傷為主，肝毒性機(jī)制主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化損傷［16］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看蒼耳子主要急性毒性機(jī)制是胃、小腸、肺臟、肝臟嚴(yán)重充血，肝功能急劇損害，從而引起小鼠全身中毒而死亡，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道基本一致。

蒼耳子中的酚酸類化合物為其主要有效成分［17］，具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛等作用［18］，其中綠原酸、1，5-二咖啡?？鼘幩岷涂偡铀崽崛∥飳?duì)過(guò)敏性鼻炎和鼻竇炎模型動(dòng)物具有較好的治療作用［19］。本文對(duì)蒼耳子炮制前后的4種酚酸類藥效代表性成分的含量也進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示炒蒼耳子所含的咖啡酸和異綠原酸C含量明顯增加，說(shuō)明炮制會(huì)對(duì)蒼耳子有效成分含量產(chǎn)生影響，部分酚酸類化合物的含量在炮制后會(huì)顯著升高。其原因可能是蒼耳子炒制后質(zhì)地變酥脆，利于有效成分的溶出。有研究認(rèn)為，蒼耳子中毒性成分蒼耳子苷含于脂肪蛋白中，炮制可使脂肪蛋白中所含蛋白遇高熱變性，苷類成分凝固在細(xì)胞中不易溶出，從而降低毒性［20］。由此可推測(cè)，蒼耳子中毒性成分苷類化合物的存在部位可能與有效成分酚酸類化合物的不同。

綜上所述，蒼耳子經(jīng)炒制后可“減毒增效”，為其在臨床安全使用增加了保障，也為以蒼耳子為君藥的鼻淵通竅顆粒等中成藥制劑臨床使用的安全性提供了科學(xué)依據(jù)和有效保障。

利益沖突聲明：無(wú)。

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（2021-10-18收稿 本文編輯：吳珊）

基金項(xiàng)目：重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2018ZX09201010）——中藥口服制劑先進(jìn)制造關(guān)鍵技術(shù)與示范研究作者簡(jiǎn)介：張靜（1994.11—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中藥炮制學(xué)，E-mail：751740044@qq.com通信作者：劉清飛（1971.08—），男，博士，副教授，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，E-mail：liuqf@Tsinghua.edu.cn