宋佳莧 朱敏

摘要：為探究環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cyclic GMP-AMP synthetase，cGAS）翻譯后修飾參與DNA損傷應(yīng)答的潛在作用，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞，設(shè)置未處理組和Etoposide處理組?；赪estern blot和免疫熒光染色，確定HeLa細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率、Etoposide處理前后的DNA損傷效果、DNA損傷前后cGAS的細(xì)胞定位情況。采用免疫共沉淀和Western blot檢測(cè)HEK-293T細(xì)胞cGAS的表達(dá)及UFMylation修飾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)cGAS，Etoposide處理可造成明顯DNA損傷，未處理組cGAS富集于細(xì)胞質(zhì)，處理組cGAS富集于細(xì)胞核。HEK-293T細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，同時(shí)發(fā)現(xiàn)UFMylation修飾的cGAS。因此，cGAS參與DNA損傷應(yīng)答且可能通過UFMylation修飾調(diào)控，為翻譯后修飾視角研究DNA損傷應(yīng)答提供理論參考。

關(guān)鍵詞：DNA損傷應(yīng)答；環(huán)狀GMP-AMP合成酶；泛素折疊修飾因子1；UFMylation修飾

中圖分類號(hào)：Q527 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-1037（2023）02-0020-04

doi：10.3969/j.issn.1006-1037.2023.02.04

基金項(xiàng)目：

國家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：32201061）資助；山東省自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：ZR2021QC083）資助。

通信作者：

朱敏，女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)镈NA損傷修復(fù)。

先天免疫系統(tǒng)（快速感知和響應(yīng)感染）和DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）作為保持生物體完整性所必需的重要系統(tǒng)，其缺陷導(dǎo)致感染、自身免疫、癌癥和衰老等諸多疾病，兩者之間串?dāng)_所涉及分子因素及潛在機(jī)制仍不清楚。DDR能發(fā)現(xiàn)且控制細(xì)胞內(nèi)特定DNA損傷，通過修復(fù)、耐受、永久失活（不可修復(fù)或不可耐受的病變細(xì)胞）等方式保護(hù)細(xì)胞，最大程度降低DNA損傷影響［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，12％的轉(zhuǎn)移性癌癥患者具有腫瘤抑制基因病原種系突變，其中75％與DNA損傷修復(fù)有關(guān)［3］。癌癥發(fā)生是由多因素誘發(fā)、多基因參與且涉及基因突變和染色體變化的多階段復(fù)雜過程，其核心特征之一是基因組不穩(wěn)定性［4-6］。環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cyclic GMP-AMP synthetase，cGAS）是一種胞質(zhì)DNA感受器蛋白，通過識(shí)別、結(jié)合細(xì)胞質(zhì)內(nèi)雙鏈DNA（內(nèi)源性和/或外源性）被激活，合成第二信使cyclic GMP-AMP（cGAMP），由cGAMP激活定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING），進(jìn)而觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)激活天然免疫。雖然cGAS的激活可通過多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM）調(diào)節(jié)，包括磷酸化、谷氨?；?、泛素化、SUMO化和乙?；玞GAS的其他PTM因子仍然知之甚少。Ub樣蛋白（UBL）通過一系列酶促反應(yīng)共價(jià)偶聯(lián)其靶蛋白，如神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)和發(fā)育下調(diào)8（NEDD8）、干擾素刺激基因15（ISG15）和泛素折疊修飾因子1（UFM1）。UFM1作為新發(fā)現(xiàn)的UBL之一，與泛素化類似，通過三步酶促反應(yīng)與其靶蛋白偶聯(lián)，包含泛素樣修飾劑激活酶5（UBA5， E1），UFM1偶聯(lián)酶1（UFC1， E2），UFM1特異性連接酶1（UFL1， E3）。DNA損傷相關(guān)基因組不穩(wěn)定性導(dǎo)致微核形成，微核cGAS與DNA損傷標(biāo)志物如磷酸化的組蛋白H2AX（γH2AX）可共定位［7-8］。已有研究表明，DNA損傷以importin-α依賴方式誘導(dǎo)cGAS入核，通過多聚（ADP-核糖）與PARP1相互作用，抑制PARP1-Timeless復(fù)合物形成，從而抑制同源重組修復(fù)［9］。細(xì)胞核cGAS通過與染色質(zhì)結(jié)合促進(jìn)其致密化，阻礙RAD51介導(dǎo)的DNA鏈侵入，抑制同源重組修復(fù)［10］。綜上，本文基于微核cGAS的作用，過表達(dá)HeLa細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞的cGAS，研究cGAS的UFMylation修飾及DNA損傷前后cGAS的細(xì)胞定位，為DNA損傷修復(fù)研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HEK-293T細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞系源自ATCC細(xì)胞庫。DMEM/HIGH-GLUCOSE（山東思科捷生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（德國PAN-Biotech公司），HA Tag抗體（美國Bethyl公司），F(xiàn)LAG Tag抗體（美國Sigma公司），Protein A beads（美國GE Healthcare公司），γ-H2AX抗體（美國Millipore公司），F(xiàn)LAG-Vector、FLAG-cGAS、HA-UFM1、HA-UFM1（ΔC2）質(zhì)粒均由本課題組實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞、HEK-293T細(xì)胞均接種于DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、0.5%青霉素—鏈霉素混合液），置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（5% CO2）內(nèi)培養(yǎng)。處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞通過胰酶消化后，參照聚乙烯亞胺說明書轉(zhuǎn)染。

1.2.2 Western blot檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率 HeLa細(xì)胞（計(jì)數(shù)1.5×105個(gè)）接種至六孔板，于四孔分別轉(zhuǎn)染FLAG-Vector、FLAG-Vector、FLAG-cGAS、FLAG-cGAS質(zhì)粒各2 μg，轉(zhuǎn)染48 h后，取一組FLAG-Vector、FLAG-cGAS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用25 μmol/L Etoposide處理2 h。吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μL sample buffer（含細(xì)胞裂解成分）裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞全蛋白。采用10% SDS-PAGE膠分離蛋白，轉(zhuǎn)印PVDF膜，經(jīng)4%脫脂牛奶封閉后，加入FLAG Tag抗體4 ℃孵育過夜。次日，用抗鼠二抗室溫孵育PVDF膜1 h，通過化學(xué)發(fā)光儀器檢測(cè)信號(hào)，確定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 免疫熒光確定cGAS細(xì)胞定位 HeLa細(xì)胞（計(jì)數(shù)1.5×105個(gè)）接種至六孔板（預(yù)置潔凈玻片），于四孔分別轉(zhuǎn)染FLAG-Vector、FLAG-Vector、FLAG-cGAS、FLAG-cGAS質(zhì)粒各2 μg，記為a、b、c、d組。轉(zhuǎn)染48 h后，a、c組不作處理，b、d組用25 μmol/L Etoposide處理2 h；剩余兩孔記為m、n組，均不作轉(zhuǎn)染處理，n組與b、d組同時(shí)用25 μmol/L Etoposide處理2 h。各組樣本經(jīng)4％多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton X-100處理10 min通透細(xì)胞膜，10%山羊血清封閉1 h，分別滴加FLAG Tag一抗（a-d組）和γ-H2AX一抗（m-n組）4 ℃孵育過夜后，室溫避光孵育熒光二抗（與一抗種屬對(duì)應(yīng)）2 h。加1滴含DAPI的抗淬滅封片劑至載玻片，覆蓋細(xì)胞爬片，涂抹指甲油固定。通過熒光顯微鏡觀察γ-H2AX（DNA損傷Marker）和cGAS的細(xì)胞定位情況。

1.2.4 免疫共沉淀確定cGAS的UFMylation修飾 HEK-293T細(xì)胞（計(jì)數(shù)7×106個(gè)）接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，記為e、f、g組，分別轉(zhuǎn)染FLAG-VEC+HA-UFM1、FLAG-cGAS＋HA-UFM1、FLAG-cGAS＋HA-UFM1（ΔC2）質(zhì)粒（質(zhì)粒用量為：2.5 μg+2.5 μg）。轉(zhuǎn)染48 h后，室溫條件下用100 μL UF buffer（150 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0; 5% SDS; 30% Grycerol）裂解細(xì)胞30 min，100 ℃煮沸5 min，冷卻至室溫加入900 μL UF buffer A（50 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0; 150 mmol/L NaCl; 0.5% NP-40; 1×PIC）冰浴裂解30 min。14000 rpm，4 ℃離心10 min。取上清液，加入U(xiǎn)F buffer A（上清液體積稀釋一倍）， FLAG Tag抗體，過夜孵育后，加入Protein A beads結(jié)合2 h，提取FLAG Tag抗體特異性免疫沉淀蛋白，確定cGAS是否可以發(fā)生UFMylation修飾。

2 結(jié)果

2.1 DNA損傷后誘導(dǎo)cGAS從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核

為確定DNA損傷前后cGAS的細(xì)胞定位，HeLa細(xì)胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后作部分DNA損傷處理，通過免疫熒光染色觀察Etoposide處理前后cGAS的熒光信號(hào)。由圖1可知，Etoposide處理的HeLa細(xì)胞發(fā)現(xiàn)DNA損傷Marker γ-H2AX于細(xì)胞核富集，而未處理細(xì)胞無明顯γ-H2AX富集，即25 μmol/L Etoposide處理2 h可造成明顯的HeLa細(xì)胞DNA損傷。HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的免疫熒光染色結(jié)果顯示，未加藥處理組細(xì)胞的cGAS主要定位細(xì)胞質(zhì)中，這與其作為胞質(zhì)DNA感受器參與先天免疫的功能一致（圖1（c））。Etoposide誘導(dǎo)DNA損傷后，cGAS主要定位細(xì)胞核中，說明DNA損傷后cGAS發(fā)生了核轉(zhuǎn)位，細(xì)胞核定位的cGAS可能參與損傷后DNA修復(fù)過程。

2.2 cGAS能被UFMylation修飾

cGAS的酶活性受多種PTM調(diào)節(jié)，為驗(yàn)證cGAS能否發(fā)生UFMylation修飾，免疫共沉淀純化FLAG-cGAS蛋白并通過Western blot檢測(cè)修飾情況。由圖2可知，HEK-293T細(xì)胞中FLAG-cGAS可穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)UFMylation修飾的cGAS（泳道2、3），其中UFM1（ΔC2）為暴露C末端甘氨酸殘基的活性狀態(tài)（泳道3）。這證實(shí)外源轉(zhuǎn)入cGAS和UFM1后，與活性狀態(tài)的UFM1（ΔC2）一致，cGAS可發(fā)生UFMylation修飾。

3 討論

遺傳信息傳遞過程中各種內(nèi)源性和/或外源性因素會(huì)誘發(fā)DNA組成、結(jié)構(gòu)異常改變從而影響基因組穩(wěn)定性。內(nèi)源性因素主要包括DNA錯(cuò)誤復(fù)制，DNA不穩(wěn)定性引發(fā)的自身堿基轉(zhuǎn)化、堿基丟失、堿基修飾，以及由細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生且使DNA堿基氧化、DNA鏈斷裂的自由基［11-13］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，細(xì)胞每天最多可發(fā)生105次內(nèi)源性DNA損傷［14］。電離輻射、紫外線、化學(xué)誘變劑等物理化學(xué)因素引發(fā)的DNA損傷，會(huì)破壞堿基結(jié)構(gòu)，形成嘧啶二聚體，產(chǎn)生DNA鏈斷裂（SSB、DSB）和DNA交聯(lián)（鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)、ICL）［15-17］。

正常細(xì)胞的胞質(zhì)DNA積累受限于不同亞細(xì)胞位點(diǎn)的DNA酶作用，DNA酶存在于細(xì)胞外（DNase I和DNase IL3）、吞噬溶酶體內(nèi)（DNase II）或胞漿內(nèi)（DNase III），共同預(yù)防自身DNA異常累積［18］。研究表明，MutLα亞基缺失MLH1（其缺陷引發(fā)約50%的dMMR癌癥）會(huì)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，形成異常DNA修復(fù)中間產(chǎn)物，最終產(chǎn)生染色體異常，釋放核DNA，激活cGAS-STING途徑［19］。經(jīng)典cGAS-STING信號(hào)通路中，cGAS的酶活性受翻譯后修飾調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響先天免疫反應(yīng)。單純皰疹病毒-1感染細(xì)胞時(shí)，RNF185（E3泛素化連接酶）通過介導(dǎo)cGAS（K173和K384位點(diǎn)）K27連接的泛素鏈形成，會(huì)增強(qiáng)cGAS的酶活性，促進(jìn)下游干擾素應(yīng)答效應(yīng)［20］。UFMylation修飾參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復(fù)等多種生物過程。DNA雙鏈斷裂招募磷酸化的UFL1，通過UFMylation修飾單鏈組蛋白H4，增強(qiáng)募集SUV39H1和Tip60，從而促進(jìn)DNA損傷時(shí)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ATM）激酶的激活［21］。此外，MRE11 K282位點(diǎn)的UFMylation修飾通過募集MRN復(fù)合物，激活A(yù)TM，從而促進(jìn)同源重組介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)，維護(hù)基因組穩(wěn)定性［22］。本研究結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)cGAS存在UFMylation修飾，25 μmol/L Etoposide處理后細(xì)胞質(zhì)定位的cGAS富集于細(xì)胞核，即DNA損傷后cGAS發(fā)生核轉(zhuǎn)位，聯(lián)結(jié)先天免疫和DNA損傷，為闡明兩者之間串?dāng)_的分子機(jī)制，提供理論參考。

4 結(jié)論

cGAS-STING信號(hào)通路主要響應(yīng)源自微生物、DNA病毒的外源DNA，以及由于基因組不穩(wěn)定或線粒體釋放的內(nèi)源DNA，觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，釋放I型干擾素。研究結(jié)果表明，cGAS細(xì)胞質(zhì)定位與先天免疫中功能一致。而Etoposide處理造成DNA損傷后，cGAS移位至細(xì)胞核，提示cGAS參與DNA損傷后修復(fù)過程。細(xì)胞內(nèi)cGAS的UFMylation修飾，為探究cGAS參與DNA損傷修復(fù)的翻譯后修飾調(diào)控提供新靶點(diǎn)。

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