張榮燦 ,覃仙玲 ,李煜銘 ,陸家昌 ,雷 富 ,莊軍蓮 ,賴俊翔,許銘本

（1.廣西科學院廣西海洋科學院/廣西近海海洋環(huán)境科學重點實驗室/廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.北部灣海洋產(chǎn)業(yè)研究院，廣西 防城港 538000）

海洋塑料污染是一個全球性問題。全球每年向海洋中排放大量塑料垃圾，這些塑料垃圾逐漸被分解為毫米、微米級的塑料顆粒。微塑料一般指直徑小于5 mm 的塑料顆粒[1]。海洋環(huán)境中的微塑料對海洋浮游植物產(chǎn)生不利影響，可吸附藻細胞或附著在藻細胞上、抑制光合作用[2-4]，使藻細胞生長、生產(chǎn)受抑制[5-7]；還有對藻細胞造成物理損傷[8]等負面作用。聚苯乙烯（Polystyrene，PS）塑料在水產(chǎn)養(yǎng)殖和外賣包裝盒中的應用廣泛，其內(nèi)部化學結構穩(wěn)定，不易降解，為海洋環(huán)境中最常見塑料污染之一[9]。聚苯乙烯微塑料會抑制東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）在穩(wěn)定期和衰退期的生長[10]。聚苯乙烯納米微塑料對杜氏藻（Dunaliella tertiolecta）的生長有長期毒性[11]。高濃度（250 mg·L-1）、小粒徑（0.05 μm）聚苯乙烯微塑料對鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）光合作用的抑制作用更強[5]。

微藻是海洋食物鏈底端的生產(chǎn)者，是全球氧氣的主要來源，對于維持海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有重要作用[12]。棕囊藻屬（Phaeocystis）廣泛分布于從熱帶到兩極的廣大海區(qū)，可因近海富營養(yǎng)化而引發(fā)大規(guī)模有害赤潮。近年來，球形棕囊藻（Phaeocystisglobosa）赤潮的暴發(fā)規(guī)模和持續(xù)時間明顯增加，對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重影響。本研究在聚苯乙烯微塑料存在條件下，分析球形棕囊藻單細胞數(shù)量、群體數(shù)量和形態(tài)等的生理響應，探討聚苯乙烯微塑料對其生長和生活史形態(tài)轉化的影響，為全面深入了解球形棕囊藻形成種群優(yōu)勢提供基礎資料，為海洋生態(tài)系統(tǒng)保護提供科學依據(jù)，也為微塑料的生態(tài)環(huán)境效應研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

球形棕囊藻采自廣西北部灣海域，經(jīng)實驗室分離、純化后保存于4 ℃冰箱。

小粒徑聚苯乙烯塑料微球（直徑0.1、1.0 μm）、大粒徑聚苯乙烯塑料微球（直徑10.0、100.0、1 000.0 μm），購自天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 球形棕囊藻的培養(yǎng) 以f/2培養(yǎng)基[13]為培養(yǎng)介質(zhì)。取棕囊藻藻液（單細胞樣品），過10 μm篩絹，加入培養(yǎng)基中，藻單細胞初始密度為2 000 mL-1。再加入直徑分別為0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μm 的聚苯乙烯塑料微球，起始質(zhì)量濃度均為1 mg·L-1。培養(yǎng)基、藻液及塑料微球的總體積為800 mL。對照組不加聚苯乙烯塑料微球，培養(yǎng)基及藻液的總體積為800 mL。各組均設置3 個平行組。置于培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)條件為溫度20°C，鹽度30，照度2 000 lx，光暗比為12 h∶12 h。每3 d取樣1次。

1.2.2 球形棕囊藻生長變化分析 取1 mL藻液置于24 孔培養(yǎng)板中，在倒置顯微鏡下進行球形棕囊藻游離單細胞、囊體細胞計數(shù)，統(tǒng)計游離單細胞、囊體數(shù)量，測量囊體直徑[14-15]。計算游離單細胞及囊體的抑制率（PI，%）或增長率（PG，%）。

RPI=1-N/N0。其中，RPI為抑制率。N0為對照組棕囊藻單細胞密度或囊體數(shù)量；N為實驗組球形棕囊藻單細胞密度或囊體數(shù)量。

RPG=1-N/N0。其中，RPG為增長率，N0為對照組棕囊藻囊體直徑或囊體細胞密度；N為實驗組球形棕囊藻囊體直徑或囊體細胞密度。

1.3 統(tǒng)計分析

結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析法進行差異顯著性分析，P＜0.05 時數(shù)據(jù)間有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 微塑料對球形棕囊藻游離單細胞密度的影響

由圖1可見，隨著培養(yǎng)時間的增加，對照組單細胞數(shù)量逐漸增長。培養(yǎng)至3 d 時，游離單細胞密度為3.55×103mL-1。隨后游離單細胞密度不斷增加，在30 d 達到最高值（126.75×103mL-1）。微塑料存在下，各組游離單細胞密度最高值出現(xiàn)在24 d（1.0 μm組）、27 d（10.0 μm 組、100.0 μm 組）及30 d（0.1 μm組、1 000.0 μm 組），表明微塑料的存在，對游離單細胞的生長周期有一定擾動。

圖1 球形棕囊藻游離單細胞的生長曲線Fig.1 Growth curve of solitary cell of Phaeocystis globosa

另一方面，不同粒徑微塑料存在下，在整個培養(yǎng)周期，實驗組游離單細胞密度均顯著低于對照組（P＜0.05，圖1），表明微塑料的存在對球形棕囊藻游離單細胞的生長有明顯抑制作用。

從圖2可見，在微塑料存在的條件下，游離單細胞的生長受到不同程度的抑制。對于小粒徑微塑料，0.1 μm 組的抑制率最高為93.0%（12 d），最低為34.2%（6 d）；1.0 μm組的抑制率最高為86.0%（15 d），最低為-2.92%（9 d）。對于大粒徑微塑料，10.0 μm組的抑制率最低為49.35%（6 d），自12 d 時起，抑制率均在90%以上，最高為99.3%（18 d）；100.0 μm 組的抑制率最低為33.5%（24 d），最高為95.3%（12 d）；1 000.0 μm 組的抑制率最低為28.8%（6 d），最高為99.2%（21 d），且在12～27 d，其抑制率均大于90.0%。這表明大粒徑微塑料總體上對球形棕囊藻游離單細胞生長的抑制作用較強。

圖2 不同粒徑微塑料對球形棕囊藻游離單細胞生長的抑制率Fig.2 Inhibition rate of microplastics in different diameters on the growth of solitary cell of Phaeocystis globosa

2.2 微塑料對球形棕囊藻囊體數(shù)量的影響

從表1可見，培養(yǎng)6 d時對照組形成囊體，密度為92 mL-1，之后囊體數(shù)量逐漸增加，在15 d時囊體數(shù)量達最高值（密度為462 mL-1）。繼續(xù)培養(yǎng)，則囊體數(shù)量又開始逐漸減少，在30 d時密度降至99 mL-1。

表1 不同粒徑微塑料存在條件下球形棕囊藻囊體數(shù)量的變化Table 1 Changes in the number of colony of Phaeocystis globosa under condition of microplastics of different sizes mL-1

加入不同粒徑的微塑料后，球形棕囊藻囊體出現(xiàn)的時間及數(shù)量變化不一致：加入小粒徑（0.1、1.0 μm）微塑料后，囊體出現(xiàn)的時間與對照組相同（6 d）；但在10.0、100.0、1 000.0 μm 大粒徑微塑料存在下，囊體出現(xiàn)時間分別為9 d（1 mL-1）、9 d（3 mL-1）、15 d（1 mL-1），表明大粒徑微塑料對球形棕囊藻囊體的形成起延遲作用。

此外，在6 d 時形成囊體后，除27 d 外，實驗組囊體數(shù)量均顯著少于對照組（P＜0.05，表1）。0.1μm 組 及1.0 μm 組囊體 數(shù)量最 高值分別為207 mL-1、209 mL-1，為對照 組最高 值的44.76%、45.20%。而直徑10.0 μm 及以上的塑料微球存在的情況下，幾乎可完全抑制囊體的形成（囊體數(shù)量最高值僅為8 mL-1）。表明微塑料對球形棕囊藻囊體的形成有明顯抑制作用。

從圖3 可見，不同粒徑微塑料對囊體數(shù)量均有抑制作用。0.1 μm 組及1.0 μm 組的抑制率，最高值分別為68.7%（9 d）和64.6%（12 d）。而在大粒徑的10.0 μm組、100.0 μm組及1000.0 μm組，對囊體形成的抑制率均在94.0%以上。表明大粒徑微塑料對囊體形成的抑制作用大于小粒徑微塑料。

圖3 不同粒徑微塑料對球形棕囊藻囊體生長的抑制率Fig.3 Inhibition rate of microplastics in different particle sizes on the growth of Phaeocystis globosa colony

2.3 微塑料對球形棕囊藻囊體直徑的影響

由圖4可見，正常培養(yǎng)條件下，對照組球形棕囊藻囊體在6 d時出現(xiàn)，平均直徑為90.72 μm。隨后囊體直徑隨著培養(yǎng)時間的增加而增大，到18 d 時達到最高值（349.45 μm），之后開始減小，在30 d 時達到最低值（73.26 μm）。微塑料存在下，形成囊體后，囊體直徑同樣隨著時間的增加而增大，但在12 d 時，0.1 μm 組、1.0 μm 組、100.0 μm 組囊體直徑已大于對照組；而從18 d 開始，所有實驗組囊體直徑均大于對照組，實驗組與對照組差異顯著（P＜0.05）。表明微塑料對球形棕囊藻囊體直徑的增大有較強的促進作用。

圖4 不同粒徑微塑料存在條件下球形棕囊藻囊體直徑的變化Fig.4 Changes of the diameter of Phaeocystis globosa colony under condition of microplastics of different sizes

由表2 可見，0.1 μm 組、1.0 μm 組在囊體形成初期（6～9 d）對囊體直徑有抑制作用，6 d 時增長率分別為-37.7%、-38.8%，9 d時增長率分別為-11.5%、-9.8%；而從12 d 開始則變?yōu)榇龠M囊體直徑的增大，0.1 μm組增長率最高為849.1%（30 d），1.0 μm組增長率最高為898.4%（27 d）。大粒徑微塑料（10.0、100.0、1 000.0 μm）組對囊體直徑的作用與小粒徑組類似，但在囊體形成后期，對囊體直徑增大的促進作用更加明顯，囊體直徑增長率最高分別達到2 633.4%（30 d）、2 515.1%（27 d）及1 868.2%（27 d）。表明大粒徑微塑料（10.0、100.0、1 000.0 μm）對囊體直徑的影響比小粒徑微塑料（0.1、1.0 μm）更加明顯。

表2 不同粒徑微塑料對球形棕囊藻囊體直徑增長率的影響Tab粒le 徑2 Effect of microplastics in different particle size on growth rate of Phaeocystis globosa colony diameter %

2.4 微塑料對球形棕囊藻囊體細胞密度的影響

在培養(yǎng)液內(nèi)自然生長的條件下，球形棕囊藻在6 d 時產(chǎn)生囊體，囊體細胞密度為9.91×103mL-1，小于同時期的游離單細胞密度（17.67×103mL-1）。隨著培養(yǎng)時間的增加，囊體細胞密度也逐漸增多，在15 d 時達到最高值（135.94×103mL-1）。隨后囊體細胞密度開始減少，在30 d 時達到最低值（1.39×103mL-1）（圖5）。

圖5 球形棕囊藻囊體細胞的生長曲線Fig.5 Growth curve of colonial cell of Phaeocystis globosa

加入不同粒徑的微塑料后，除27 d、30 d 外，實驗組囊體細胞密度與對照組均差異顯著（P＜0.05，圖5）。加入小粒徑微塑料（0.1 μm、1.0 μm）后，前期（3～15 d）棕囊藻生長周期與對照組類似，囊體細胞密度逐漸增加，但從15 d 時開始，囊體細胞密度均大于對照組，且此后呈增長趨勢，直至27 d 時達最高值（分別為766.63×103、826.92×103mL-1），其最高值分別為對照組最高值的564%、608%。加入大粒徑的微塑料（10.0、100.0、1 000.0 μm）后，其生長周期延遲，但囊體細胞密度也呈上升趨勢，在21 d 時已高于對照組，且均在24 d 時達到最高值（分別為251.84×103、281.01×103、162.18×103mL-1），最高值分別為對照組最高值的185%、207%、119%。

由表3 可見，所有實驗組在囊體形成初期對囊體細胞的生長均有抑制作用，0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μm組單細胞密度增長率分別為-79.2%（6 d）、-75.8%（6 d）、-99.8%（9 d）、-99.5%（9 d）、-97.7%（15 d）。隨著培養(yǎng)時間的增加，微塑料對囊體細胞生長的影響開始變?yōu)榇龠M單細胞密度的增加，小粒徑微塑料的影響尤為明顯，至30 d，單細胞密度增長率已變?yōu)?2 249.4%（0.1 μm 組）、47 666.3%（1.0 μm組）。而大粒徑微塑料對單細胞密度的影響相對較小，在30 d的增長率分別為：9 026.9%（10.0 μm 組）、6 706.6%（100 μm組）、869.0%（1 000.0 μm組）。表明小粒徑微塑料（0.1、1.0 μm）對囊體細胞生長的影響比大粒徑微塑料（10.0、100.0、1 000.0 μm）更加明顯。

表3 不同粒徑微塑料對球形棕囊藻囊體細胞密度增長率的影響Table 3 Effect of microplastics in different particle size on growth rate of colonial cell density of Phaeocystis globosa %

3 討論

3.1 微塑料對球形棕囊藻游離單細胞生長的影響

本研究中，在培養(yǎng)初期，微塑料抑制球形棕囊藻單細胞生長，主要原因可能是遮光效應。溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽和光照是影響球形棕囊藻生長的重要物理因素[16]，在溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽一定的條件下，藻細胞的生長主要受光照限制。本研究中使用的f/2培養(yǎng)基由天然海水配置，含有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl－、SO42－等多種離子[17]，聚苯乙烯微塑料可能會吸附這些離子而帶電[18]。藻細胞壁上分布有大量羧基、胺基、羥基等帶電官能團[19]，帶電的塑料微球通過與此類官能團相結合而吸附于細胞表面，阻礙葉綠體對光的吸收，從而產(chǎn)生遮光效應，抑制細胞生長。塑料微球的粒徑越大，遮光效應越強，因而對球形棕囊藻單細胞生長的抑制作用越明顯。

此外，有研究表明，當微塑料和藻細胞接觸時，可能會堵塞藻細胞氣孔，降低養(yǎng)分和氣體交換[20]，從而抑制藻的生長；小粒徑的微塑料還可能通過氣孔進入藻細胞內(nèi)部引起細胞機械損傷，引發(fā)部分細胞器的應激反應，導致細胞代謝紊亂，從而抑制藻細胞生長。微塑料粒徑越小，越易造成氣孔堵塞或更易進入細胞內(nèi)部，引起細胞機械損傷、降低養(yǎng)分和氣體交換，從而對藻生長的抑制作用越強[10]。但在本研究中，大粒徑的塑料微球?qū)η蛐巫啬以鍐渭毎纳L抑制作用反而更顯著，其原因可能是培養(yǎng)初期，遮光效應使得游離單細胞密度減少；隨著培養(yǎng)時間的增加，因塑料微球的存在，球形棕囊藻會啟動防御機制，形成較大直徑的囊體來自我保護，這一過程需要大量單細胞參與，從而導致游離單細胞密度更小。

3.2 微塑料對球形棕囊藻囊體數(shù)量和囊體直徑的影響

球形棕囊藻主要以囊體形態(tài)形成赤潮，由單細胞向囊體形態(tài)的轉變是赤潮暴發(fā)的關鍵。李杰等[21]研究表明，不同溫度、營養(yǎng)充氣攪動、攝食壓力、初始密度條件下囊體形成所需的游離單細胞密度不一致，但均達到104mL-1的數(shù)量級，推測球形棕囊藻囊體形成的前提是游離單細胞達到一定密度閾值，游離單細胞在高密度情況下更易形成囊體。本研究中，微塑料在培養(yǎng)初期抑制了球形棕囊藻游離單細胞的生長，使游離單細胞數(shù)量大幅減少，因而達到成囊所需單細胞密度的時間也有所延遲，導致形成囊體的時間滯后。大粒徑微塑料對單細胞的抑制作用大于小粒徑微塑料，因而囊體形成的時間更加滯后；同時，在大粒徑微塑料的脅迫下，形成的囊體直徑更大，需要的單細胞數(shù)量則更多，因而囊體數(shù)量更少。

本研究表明，微塑料對球形棕囊藻直徑的增大有較強的促進作用，在囊體形成后期，大粒徑微塑料對囊體直徑增大的促進作用比小粒徑微塑料更加明顯。促進作用的原因和機理有待進一步研究。

3.3 微塑料對球形棕囊藻囊體細胞密度的影響

囊體是球形棕囊藻赤潮暴發(fā)期間的優(yōu)勢形態(tài)，游離單細胞偶有發(fā)現(xiàn)甚至完全消失[22-23]。本研究中，在形成囊體后，實驗組中囊體細胞密度占比均遠高于游離單細胞密度，與自然海區(qū)中球形棕囊藻暴發(fā)時的情形一致。楊華釗等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在實驗室條件下，球形棕囊藻形成囊體后，僅不到15%的細胞以囊體細胞形態(tài)存在，在實驗初期和末期甚至低于5%，游離單細胞成為絕對優(yōu)勢形態(tài)，其原因在于室內(nèi)培養(yǎng)的該藻缺乏攝食壓力的脅迫[15]，可能將用于囊體構建的能量轉而投入單細胞的生長，因而非囊體成為優(yōu)勢形態(tài)。本研究中，微塑料通過遮光效應及細胞損傷效應抑制單細胞的生長，球形棕囊藻啟動防御機制，大量單細胞團聚形成囊體，抵御外界環(huán)境脅迫，因而囊體細胞密度遠高于游離單細胞密度，囊體成為優(yōu)勢形態(tài)，與自然海區(qū)的現(xiàn)象類似。

本研究中，所有實驗組微塑料在囊體形成初期對囊體細胞的生長均有抑制作用，這因為微塑料可抑制囊體形成，減少囊體數(shù)量，囊體內(nèi)細胞總數(shù)也隨之減少，使得囊體細胞密度降低（囊體細胞密度為單位體積培養(yǎng)液內(nèi)囊體細胞的數(shù)量）。隨著培養(yǎng)時間的增加，微塑料對囊體細胞生長的影響變?yōu)榇龠M囊體單細胞密度的增加。這可能源于球形棕囊藻的防御機制。形成囊體后，由于微塑料的脅迫作用，使得球形棕囊藻將能量用于囊體構建，囊體細胞快速生長，因而囊體細胞密度增加。

在囊體形成后期（自21 d 起），所有實驗組的囊體細胞密度均高于對照組，小粒徑微塑料組（0.1、1.0 μm）的囊體細胞密度遠高于大粒徑微塑料組（10.0、100.0、1 000.0 μm）。其原因在于，大粒徑微塑料對于球形棕囊藻囊體數(shù)量的抑制作用較強，形成的囊體數(shù)量少，使得囊體內(nèi)細胞總數(shù)少，因而囊體細胞密度小。而小粒徑微塑料組囊體數(shù)量遠高于大粒徑微塑料組，因而其囊體細胞密度也明顯更高。因此，小粒徑微塑料對囊體細胞生長的影響大于大粒徑微塑料。

3.4 微塑料與赤潮藻

海洋微塑料污染是全球性問題，我國南海近岸海域已普遍受到微塑料污染。吳磊石等[25]研究發(fā)現(xiàn)，北部灣海域表層水體中微塑料的空間分布呈現(xiàn)近岸高、遠岸低的特征，平均豐度為（0.56 ± 1.02）m-3，與其他海灣相比處于中等水平；粒徑1～2 mm的微塑料數(shù)量最多，占全部微塑料數(shù)量的30.4%；微塑料主要成分為聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯，占比分別為59.8%、20.9%和17.6%。

球形棕囊藻是近年來我國南部沿海常見的赤潮藻，在微塑料污染普遍存在的北部灣海域，可能與微塑料發(fā)生大概率的相互作用。廣泛分布的微塑料可能會影響藻類的生長，繼而影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。因此，探究球形棕囊藻對微塑料的生理響應以及微塑料對球形棕囊藻在游離單細胞與囊體之間的生活史轉換的影響，可為研究微塑料的海洋生態(tài)環(huán)境效應提供新的信息。關于微塑料與赤潮藻相互作用的研究不多。孫炎等[10]發(fā)現(xiàn)，10 mg·L-1粒徑0.1 μm 的聚苯乙烯微塑料對我國東海海域常見的有害赤潮藻——東海原甲藻前期生長的影響為先抑制、后促進；聚苯乙烯微塑料會抑制處于穩(wěn)定期和衰退期東海原甲藻的生長；微塑料粒徑越小、濃度越高，抑制作用越強；濃度的抑制效應強于粒徑的抑制效應。Zhao 等[26]的研究表明，納米級微塑料對米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）的生長、氧化應激和細胞微觀結構有嚴重的負面影響。李宇佳[27]研究了聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）等5 種微塑料對鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catanella）生長的抑制，發(fā)現(xiàn)微塑料對赤潮藻的毒性影響較為明顯，生長抑制率為5%～40%；隨著微塑料濃度的增加，對微藻生長的抑制作用均呈增長趨勢。本研究中，微塑料對球形棕囊藻游離單細胞生長、囊體形成亦有抑制作用，與文獻[26-27]結果一致；但本研究中大粒徑微塑料對球形棕囊藻游離單細胞生長的抑制作用明顯大于小粒徑微塑料，而微塑料粒徑對東海原甲藻生長的影響則是微塑料粒徑越小，抑制作用越強。與其他赤潮藻顯著不同，球形棕囊藻存在游離單細胞和囊體兩種截然不同的生活形態(tài)，并可在兩種形態(tài)間自由交替；其游離單細胞直徑一般為3～9 μm，而囊體的直徑可達毫米級別[23]。球形棕囊藻的這一特性可能是其對微塑料的響應有別于其他赤潮藻的原因，這還有待進一步研究。

4 結論

本研究探討微塑料污染對具有異形生活史的赤潮生物——球形棕囊藻生長的影響，結果表明，聚苯乙烯塑料微球的存在，可抑制球形棕囊藻游離單細胞的生長，延遲球形棕囊藻形成囊體的時間，大幅減少囊體數(shù)量，顯著增加囊體直徑，增加囊體細胞密度。大粒徑（10.0、100.0、1 000.0 μm）微塑料對游離單細胞的生長、囊體數(shù)量、囊體直徑影響較大，而小粒徑（0.1、1.0 μm）微塑料則對囊體細胞的生長起更加明顯的促進作用。本研究有助于評估微塑料對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響，為微塑料的生態(tài)環(huán)境效應研究提供新視角，也為微塑料和致災赤潮藻復合污染的生態(tài)效應以及海洋生態(tài)系統(tǒng)保護研究提供科學依據(jù)。