王雯慧王 位季 佳李 玙苗 睿張玉平李曉穎宋天揚(yáng)李素華何承忠

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650500）

黑頸鶴（Grus nigricollis）與灰鶴（Grus grus）均為鶴形目（Gruiformes），鶴科 （Gruide），鶴屬（Grus）的大型涉禽[1-2]。當(dāng)前，黑頸鶴在全球范圍內(nèi)僅有1 萬(wàn)余只，被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）列為近危物種，是我國(guó)國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[1]?；寅Q全球數(shù)量超70 萬(wàn)只，被IUCN 列為無(wú)危物種，是我國(guó)國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，也是我國(guó)鶴類(lèi)中種群數(shù)量最大的種類(lèi)[3]。

當(dāng)羽毛微觀結(jié)構(gòu)被作為鳥(niǎo)類(lèi)物種識(shí)別鑒定的參考標(biāo)準(zhǔn)后，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)于羽毛顯微結(jié)構(gòu)做了大量研究[4]。國(guó)內(nèi)對(duì)于鳥(niǎo)類(lèi)羽毛顯微結(jié)構(gòu)的研究自20 世紀(jì)90 年代后開(kāi)始，如通過(guò)羽毛微觀結(jié)構(gòu)對(duì)鶯亞科，雨燕科、佛法僧目等鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行了分類(lèi)鑒定[5-7]。近年來(lái)，鳥(niǎo)類(lèi)羽毛宏觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)的研究也見(jiàn)諸報(bào)道，如對(duì)猛禽覆羽形態(tài)特征量化的判別分析[8]。除了對(duì)鳥(niǎo)羽進(jìn)行分類(lèi)外，也有研究者認(rèn)為對(duì)羽毛結(jié)構(gòu)的量化分析可用于仿生學(xué)的研究[9]，但目前對(duì)鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)羽毛特征結(jié)構(gòu)的研究甚少[10-11] 。

近年來(lái)，野生鳥(niǎo)類(lèi)的盜獵案件時(shí)有發(fā)生，鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)也是盜獵者的捕殺對(duì)象。在野鳥(niǎo)的偷獵類(lèi)刑事案件中，現(xiàn)場(chǎng)難以尋到完整的鳥(niǎo)類(lèi)尸體，可供追查的線(xiàn)索中常見(jiàn)殘留的羽毛[12]。

本研究擬對(duì)鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)黑頸鶴和灰鶴的飛羽，次級(jí)飛羽，尾羽及絨羽的宏觀形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，對(duì)特征指標(biāo)進(jìn)行量化分析，尋求鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)羽毛結(jié)構(gòu)的差異，以期積累鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)生理學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；同時(shí)使用羽毛樣本的特征指標(biāo)的量化數(shù)據(jù)建立Fisher 判別式，為今后僅存羽毛的前提下鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)分類(lèi)鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取黑頸鶴與灰鶴成鳥(niǎo)標(biāo)本各3 只（其中黑頸鶴雌性1 只，雄性2 只；灰鶴雌性2 只，雄性1 只），皆由西南林業(yè)大學(xué)標(biāo)本館收集自云南省內(nèi)黑頸鶴自然保護(hù)區(qū)。取每具鶴類(lèi)標(biāo)本初級(jí)飛羽（第2～4 枚），次級(jí)飛羽（第1～3 枚），尾羽（自外側(cè)向內(nèi)側(cè)第2、4、6 枚），另隨機(jī)取胸、腹、尾、腰、背、翼部形態(tài)完整的絨羽各10 枚。

1.1.2 主要試劑和儀器

所用的乙醇（95%，AR）、無(wú)水乙醇（AR）均購(gòu)自四川西隴化工有限公司；數(shù)字病理切片掃描儀（KF-PRO 機(jī)型），購(gòu)自寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司；數(shù)碼相機(jī)（EOS700D），購(gòu)自佳能公司；體式顯微鏡（SZX10 型），購(gòu)自?shī)W林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 羽毛外觀形態(tài)觀察及幾何形態(tài)分析

取初級(jí)飛羽、次級(jí)飛羽和尾羽，將完整羽毛樣本用少許自來(lái)水浸泡清洗后，展平，自然陰干，置于純色背景卡紙，放置比例尺，使用佳能數(shù)碼相機(jī)垂直近距離拍攝，觀察羽毛的顏色、形態(tài)、色斑等宏觀外形特征，并使用ImageJ 軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理，設(shè)置好比例尺并在Result 中勾選好需要獲得的參數(shù)。使用Threshold，ROI Manger功能測(cè)算羽片面積，羽片羽軸長(zhǎng)，獲得每組羽毛每個(gè)指標(biāo)各9 個(gè)數(shù)值，另計(jì)算羽片中段的內(nèi)翈羽枝長(zhǎng)，內(nèi)翈羽枝與羽干的夾角，每組羽毛每個(gè)指標(biāo)各取30 個(gè)值[12]。

1.2.2 羽小枝顯微結(jié)構(gòu)觀察及分析

取各羽毛中段羽片，置于95% 乙醇中清洗1 h 后，無(wú)水乙醇中脫水1～2 min，自然陰干。在體視顯微鏡下，用眼科剪剪取羽片的一根羽枝，置于防脫載玻片上展平，用刻刀分離羽枝中段兩側(cè)的羽小枝，封片固定。絨羽的處理方法為取完整的羽枝，展平于防脫載玻片上，封片固定[13]。通過(guò)數(shù)字病理切片掃描儀掃描羽小枝切片，隨機(jī)取10 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)有鉤羽小枝腹齒數(shù)，羽小鉤數(shù)，纖毛對(duì)數(shù)，無(wú)鉤羽小枝的腹齒數(shù)，每個(gè)指標(biāo)各取30 組數(shù)據(jù)，利用K-Viewer 軟件測(cè)算視野內(nèi)所有羽小節(jié)間距及節(jié)直徑[14-15]。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算各特征的平均值，特征分析數(shù)據(jù)以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，若只涉及同一指標(biāo)在2 個(gè)組別中的差異的比較選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，2 個(gè)組別以上的差異比較使用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

形態(tài)結(jié)構(gòu)具有顯著性差異的指標(biāo)通過(guò)Fisher 判別分析，建立判別函數(shù)。使用Python 的numpy工具包進(jìn)行有放回的隨機(jī)抽樣，每個(gè)指標(biāo)抽樣100 次，在SPSS 中建立Fisher 判別函數(shù)，統(tǒng)計(jì)各函數(shù)的方差貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率，通過(guò)Wilks 的Lambda 的檢驗(yàn)對(duì)判別函數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 表示判別能力顯著。利用回代估計(jì)法驗(yàn)證判別函數(shù)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽毛宏觀形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

如圖1 所示，2 種鶴類(lèi)的飛羽，次級(jí)飛羽，尾羽均無(wú)任何斑紋分布且以漸變純色為主?；寅Q（圖1a）與黑頸鶴（圖1d）初級(jí)飛羽的大部分面積均為純黑堅(jiān)實(shí)的長(zhǎng)羽片，靠近羽干基部有少量白色羽枝?；寅Q（圖1b）和黑頸鶴（圖1e）的次級(jí)飛羽顏色均呈現(xiàn)出從梢部至基部由深色漸變?yōu)闇\色的特征，其中灰鶴次級(jí)飛羽的梢部深色部分為灰色，黑頸鶴次級(jí)飛羽的深色部分為棕黑色，黑頸鶴（圖1f）的尾羽梢部顏色為黑色，松散部分呈灰色；灰鶴（圖1c）的尾羽羽片梢部呈灰褐色，靠近羽根的部分呈灰白色松散狀，灰鶴次級(jí)飛羽、尾羽比黑頸鶴次級(jí)飛羽、尾羽顏色更淺，且較黑頸鶴存在更多的松散羽枝。

圖 1 黑頸鶴和灰鶴的羽毛形態(tài)結(jié)構(gòu)特征Fig. 1 The morphological characteristic of feather from G. nigricollisand G. grus

2.2 羽毛宏觀形態(tài)特征分析

對(duì)灰鶴和黑頸鶴的羽毛宏觀形態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1 所示。黑頸鶴與灰鶴的內(nèi)翈羽枝長(zhǎng)均呈次級(jí)飛羽、尾羽、初級(jí)飛羽依次減小的特征（P＜0.05），而羽片面積以及羽片羽軸長(zhǎng)均呈飛羽大于尾羽的特征（P＜0.05），內(nèi)翈羽枝與羽干夾角皆為初級(jí)飛羽最小的特征（P＜0.05）。2 種鶴類(lèi)的飛羽內(nèi)翈羽枝長(zhǎng)，尾羽內(nèi)翈羽枝與羽干的夾角，初級(jí)飛羽羽片面積的數(shù)據(jù)存在明顯的差異（P＜0.05）。

表 1 黑頸鶴和灰鶴羽毛結(jié)構(gòu)的宏觀指標(biāo)分析Table 1 The statistics on macro index of the feathers fromG. nigricollisand G. grus

2.3 羽小枝的微觀結(jié)構(gòu)特征

黑頸鶴和灰鶴初級(jí)飛羽、次級(jí)飛羽和尾羽微觀結(jié)構(gòu)如圖2、圖3 所示，2 種鶴類(lèi)正羽主要由有鉤羽小枝和無(wú)鉤羽小枝構(gòu)成，且兩種羽小枝的微觀結(jié)構(gòu)在種間具有相似性。黑頸鶴和灰鶴的有鉤羽小枝基部結(jié)構(gòu)為基柄，著生有腹齒，梢部結(jié)構(gòu)為羽脈，著生纖毛和羽小鉤；二者次級(jí)飛羽的有鉤羽小枝可見(jiàn)背纖毛結(jié)構(gòu)短粗，腹纖毛細(xì)長(zhǎng)，羽脈梢部纖毛結(jié)構(gòu)逐漸退化（見(jiàn)圖2b、e）；尾羽有鉤羽小枝較飛羽的有鉤羽小枝更纖長(zhǎng)（見(jiàn)圖2c、f）。無(wú)鉤羽小枝的羽脈無(wú)纖毛和羽小鉤，基柄皆有平行排列的深色色素條紋，基柄末端為鋸齒狀腹齒（見(jiàn)圖3）。

2 種鶴類(lèi)的絨羽微觀結(jié)構(gòu)如圖4 所示，由節(jié)狀羽小枝構(gòu)成，羽小枝竹節(jié)狀，節(jié)間著生纖毛結(jié)構(gòu)。節(jié)狀羽小枝梢部部纖毛退化，節(jié)直徑變小，節(jié)逐漸不明顯，節(jié)尖不露出（見(jiàn)圖4c、f）；著生纖毛多見(jiàn)不對(duì)稱(chēng)纖毛結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖4a、d），也可見(jiàn)單側(cè)纖毛（見(jiàn)圖4b、e）。

圖 2 黑頸鶴和灰鶴有鉤羽小枝顯微結(jié)構(gòu)特征Fig. 2 The microstructure characteristic of distal barbules from G. nigricollisand G. grus

圖 3 黑頸鶴和灰鶴無(wú)鉤羽小枝顯微結(jié)構(gòu)特征Fig. 3 The microstructure characteristic of proximal barbules from G. nigricollisandG. grus

圖 4 黑頸鶴和灰鶴節(jié)狀羽小枝顯微結(jié)構(gòu)特征Fig. 4 The microstructure characteristic of nodular barbules from G. nigricollisand G. grus

2.4 羽小枝微觀結(jié)構(gòu)特征分析

黑頸鶴和灰鶴類(lèi)的羽毛微觀結(jié)構(gòu)特征分析結(jié)果見(jiàn)表2。黑頸鶴有鉤羽小枝腹齒數(shù)為2～4 枚、纖毛對(duì)數(shù)4～8 對(duì)、羽小鉤數(shù)為5～8 枚，無(wú)鉤羽小枝腹齒數(shù)4～7 枚。灰鶴有鉤羽小枝的腹齒數(shù)為2～4 枚、纖毛對(duì)數(shù)4～8 對(duì)、羽小鉤數(shù)5～9 枚，無(wú)鉤羽小枝腹齒數(shù)4～6 枚。且2 種鶴的有鉤羽小枝纖毛對(duì)數(shù)均呈現(xiàn)呈初級(jí)飛羽、次級(jí)飛羽、尾羽依次增大的規(guī)律（P＜0.05）。

表 2 黑頸鶴和灰鶴羽毛顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)分析Table 2 The statistics on the indexes of microstructure of feathers from G. nigricollisand G. grus

2 種鶴類(lèi)次級(jí)飛羽的有鉤羽小枝的腹齒數(shù)、纖毛對(duì)數(shù)、羽小鉤數(shù)，無(wú)鉤羽小枝腹齒數(shù)均存在顯著差異（P＜0.05）；初級(jí)飛羽的無(wú)鉤羽小枝腹齒數(shù)、尾羽的有鉤羽小枝羽小鉤數(shù)也均存在明顯差異（P＜0.05）。

黑頸鶴絨羽節(jié)狀羽小枝羽小節(jié)間距小于灰鶴，羽小節(jié)直徑大于灰鶴（P＜0.05）。

2.5 羽毛的特征指標(biāo)的Fisher 判別分析

以2 種鶴羽毛的形態(tài)特征指標(biāo)為變量，對(duì)2 種鶴的歸屬進(jìn)行判別分析，一共獲得Y1、Y2、Y3、Y4、Y55 個(gè)典型判別函數(shù)，見(jiàn)表3。在Fisher 判別分析中，判別方程的準(zhǔn)確率可用其方差所占的比例來(lái)判別。由表4 可知，其Y1、Y2累積方差貢獻(xiàn)率為97.7%，可以解釋絕大部分樣本信息。由此得出以下典型判別函數(shù)：

式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分別代表了有鉤羽小枝羽小鉤數(shù)、有鉤羽小枝成對(duì)纖毛數(shù)、有鉤羽小枝腹齒數(shù)、無(wú)鉤羽小枝腹齒數(shù)、內(nèi)翈羽枝與羽干夾角、內(nèi)翈羽枝長(zhǎng)、羽片面積和羽片羽軸長(zhǎng)這8 個(gè)特征指標(biāo)。

在Wilks 的Lambda 檢驗(yàn)中得出2 個(gè)函數(shù)的顯著性水平均小于0.05，即函數(shù)Y1、Y2在以羽毛的特征指標(biāo)為變量，對(duì)灰鶴與黑頸鶴的種屬判別能力顯著（P＜0.05）。利用回代估計(jì)法對(duì)構(gòu)建判別函數(shù)的數(shù)據(jù)逐一進(jìn)行檢驗(yàn)，所得的判別方程的正確率為80.2%。

表 3 典型判別函數(shù)系數(shù)項(xiàng)和常數(shù)項(xiàng)Table 3 Coefficient term and constant term of typical discriminant function

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)灰鶴與黑頸鶴的初級(jí)飛羽、次級(jí)飛羽、尾羽和絨羽的羽片外觀形態(tài)結(jié)構(gòu)與羽小枝的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，對(duì)羽片和羽小枝的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)算和統(tǒng)計(jì)分析，積累了鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)羽毛微觀結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)資料；同時(shí)以形態(tài)特征指標(biāo)為變量構(gòu)建了2 個(gè)典型的Fisher 函數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)有鉤羽小枝羽小鉤數(shù)、成對(duì)纖毛數(shù)、腹齒數(shù)，無(wú)鉤羽小枝腹齒數(shù)，內(nèi)翈羽枝與羽干夾角，內(nèi)翈羽枝長(zhǎng)，羽片面積和羽片羽軸長(zhǎng)這8 個(gè)特征指標(biāo)均可作為二者鑒別的依據(jù)。

野生的鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)在形態(tài)上很容易識(shí)別，本研究中建立的應(yīng)用羽毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行黑頸鶴與灰鶴的物種鑒定方法，主要應(yīng)用于僅可獲取羽毛樣本的條件下開(kāi)展2 種鶴的物種鑒定。在涉及野生鳥(niǎo)類(lèi)盜獵事件中，羽毛是物種鑒定進(jìn)行案件偵破的重要線(xiàn)索，目前可見(jiàn)研究者集中于隼形目、鸮形目等鳥(niǎo)類(lèi)正羽及絨羽的羽小枝的微觀結(jié)構(gòu)研究[12,14,16-21]，本研究中所建立的基于羽毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的物種鑒定方法，將來(lái)可應(yīng)用于海關(guān)、森林公安查獲案件后送檢羽毛樣本的物種鑒定。

與已報(bào)道量化指標(biāo)相比[11]，本研究中黑頸鶴初級(jí)飛羽的有鉤羽小枝呈現(xiàn)出羽小鉤數(shù)量更多，成對(duì)纖毛數(shù)更少的特征，這種差異的原因可能為有鉤羽小枝的羽小鉤數(shù)和纖毛數(shù)在種內(nèi)具有可變性，纖毛可發(fā)育成為羽小鉤。費(fèi)榮梅等[22]提出，羽小鉤數(shù)目和纖毛數(shù)目之和可能是一個(gè)恒定值，提示在羽毛微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)有鉤羽小枝的羽小鉤數(shù)目和纖毛數(shù)目之和，探討其是否可作為鳥(niǎo)類(lèi)分類(lèi)的依據(jù)。

本研究建立的基于羽毛形態(tài)特征的物種鑒別方式，在具有完善的數(shù)據(jù)庫(kù)的前提下，具有鑒別耗時(shí)短、對(duì)設(shè)備要求不高的優(yōu)勢(shì)，但不足之處在于本研究選用的樣本數(shù)量和樣本種類(lèi)較少，僅取樣了成年個(gè)體的羽毛樣本，幼鳥(niǎo)的羽毛發(fā)育不完整，形態(tài)結(jié)構(gòu)特征也不穩(wěn)定，因此結(jié)合分子、化學(xué)方式開(kāi)展幼鳥(niǎo)羽毛的鑒別具有重要意義[23]。鶴類(lèi)為遷徙動(dòng)物，云南為黑頸鶴與灰鶴的越冬地[24-25]，本研究中只針對(duì)在越冬地的個(gè)體，可能會(huì)對(duì)區(qū)分黑頸鶴與灰鶴的羽毛特征產(chǎn)生一定影響。進(jìn)一步探索年齡、性別、季節(jié)、環(huán)境對(duì)鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)的羽毛宏觀、微觀結(jié)構(gòu)所造成的影響，可為鶴屬鳥(niǎo)類(lèi)的保護(hù)與鑒定提供更翔實(shí)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。