張翔宇 柴宇明 齊珂心 溫 泉

（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，合肥 230027）

動物在面對持續(xù)無法擺脫的厭惡刺激，或者多次嘗試趨近某種偏好刺激而失敗時，會放棄當(dāng)前的行為，表現(xiàn)為行為頻率減少和持續(xù)時間縮短。多數(shù)情況下放棄是一種精明的行為，它可以幫助動物調(diào)整行為方式，保存體力，保護(hù)動物短時間內(nèi)安全，讓其有更多精力做更有價值的事情。研究者目前主要從習(xí)得性無助的角度來研究動物的放棄行為，這可以追溯到1967 年［1］。研究者將狗囚禁在無法逃脫的籠子里，通過鈴聲響起給狗施加無法逃避的電擊，經(jīng)過訓(xùn)練，當(dāng)只有鈴聲時，狗的表現(xiàn)也如同受到了電擊，即使打開籠子，狗也不會逃跑。這種即使出現(xiàn)擺脫厭惡環(huán)境的機(jī)會，動物也仍然選擇放棄擺脫該環(huán)境的心理和行為被稱為習(xí)得性無助。其他關(guān)于習(xí)得性無助的研究還可以通過電擊［2-4］、穿梭箱實驗［5］、熱箱實驗［6-7］等方式在斑馬魚、小鼠、果蠅、蜜蜂等動物上展開。習(xí)得性無助的動物表現(xiàn)出逃避行為/攻擊性減少、焦慮和恐懼增加等現(xiàn)象［8］。但是習(xí)得性無助實驗中，引發(fā)動物行為的刺激往往是厭惡刺激或者中性刺激，動物面對可能獲得獎勵的積極刺激也會產(chǎn)生放棄［9］，但是相關(guān)研究較少。

斑馬魚作為常見模式動物，單次產(chǎn)卵能達(dá)到三四百顆，編碼蛋白質(zhì)的基因有69%和人類同源［10］，而且腦體積較小，便于進(jìn)行全腦水平的研究［11］。捕食行為開始于斑馬魚受精后的第5 天（5 days post fertilization，5 dpf），用于代替卵黃，為機(jī)體供能［12］。這一行為包含追蹤、吞食兩個階段，斑馬魚通過游動和轉(zhuǎn)向調(diào)整身體，快速靠近食物并將其吞食［13］。其中追蹤階段伴隨著雙眼匯聚角度的增大和以J-turn 為代表的小幅擺尾行為的發(fā)生。2011年Bianco等［14］通過投射在虛擬屏幕上的小光點，引起了斑馬魚的捕食行為，這種可控的食物刺激對斑馬魚捕食行為的研究提供了可靠的實驗范式，為后來者從事斑馬魚捕食行為相關(guān)研究提供了指導(dǎo)［15-17］。虛擬食物刺激對于斑馬魚是一個積極刺激，能夠引起斑馬魚的趨近行為，卻不能提供真實食物獎勵，通過虛擬刺激引起的捕食行為能否使斑馬魚產(chǎn)生放棄，目前尚未可知。本研究通過虛擬食物刺激引起斑馬魚捕食行為，比較了不同日齡斑馬魚在接受刺激不同時期的捕食行為表現(xiàn)，探究了獎勵缺失的虛擬食物刺激對斑馬魚捕食行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼養(yǎng)

本實驗使用的斑馬魚品系為Nacre 品系，為AB 品系斑馬魚（受贈于中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡兵教授實驗室）和Casper品系斑馬魚（購自國家斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center）），經(jīng)過雜交傳代，并依據(jù)眼球鞏膜和體表色素的有無等表觀特征篩選得到，在保證幼魚成活率的同時減少了體表黑色素對實驗的干擾。斑馬魚飼養(yǎng)用水pH 6.8~7.4，電導(dǎo)率500~550 μS/cm，飼養(yǎng)環(huán)境溫度常年控制在26~28℃，光周期為14 h光照/10 h 黑暗環(huán)境，幼年斑馬魚用E2 胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)，幼魚從5 dpf 開始投喂草履蟲飼養(yǎng)。實驗過程中廢棄的斑馬魚統(tǒng)一用冰浴法處理。本研究中動物的飼養(yǎng)和行為訓(xùn)練均經(jīng)中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)動物實驗 倫 理 委 員 會 批 準(zhǔn) （ 許 可 證 號 ：USTCACUC1103013）。

1.2 實驗裝置

1.2.1 硬件裝置

斑馬魚自由行為平臺主要分為斑馬魚活動場、相機(jī)、光源、電腦4個部分（圖1a）。4個部分被統(tǒng)一安裝在小型暗室中（圖1b），暗室以鋁合金面包板為底座，以工業(yè)鋁型材為框架，四周和頂部覆蓋有黑色不透明亞克力板。

a. 斑馬魚活動場：在70 mm×50 mm×1.5 mm的碳纖維板中間挖出直徑20 mm 的圓形孔洞，上下方用蓋玻片封住形成空腔，填充斑馬魚胚胎培養(yǎng)液，形成活動場。

b. 工業(yè)相機(jī)（Basler acA2000-165 um NIR）位于活動場下方，搭配長焦鏡頭（尼康，50 mm，1∶1.8，2/3）。

c. 光源：在虛擬刺激實驗中，活動場上方覆蓋一個像素密度為428 像素每英寸（pixel per inch，ppi）的手機(jī)屏幕，以提供虛擬視覺刺激，并減少屏幕發(fā)熱對實驗的影響。在真實草履蟲刺激實驗中，使用峰值波長940 nm 的紅外LED 燈提供照明。

Fig. 1 Virtual reality and behavioral system

Fig. 2 Behavioral paradigm for virtual paramecium presentation

Fig. 3 Behavioral analysis of larval zebrafish

Fig. 4 Predatory behavior of zebrafish in the presence of virtual stimuli

Table 1 Predatory probability of zebrafish under eye convergence condition

Fig. 5 Changes in the number of convergence and average convergence duration with fish ages during training and test periods

Fig. 6 Changes in the number of hunting behaviors and the corresponding average convergence duration with zebrafish ages during training and test periods

Fig. 7 Zebrafish predatory-like behavior in an environment illuminated by white light

Fig. 8 Statistics of hunting-like behaviors in an environment without virtual paramecium

Fig. 9 Statistics of prey capture behaviors in response to virtual paramecium

Fig. 10 Statistics of zebrafish locomotion with ages during training and test periods

1.2.2 軟件裝置

斑馬魚虛擬刺激程序：自主編寫的C++程序。相機(jī)曝光時間1 500 μs，幀率為100幀/s（frame per second，fps），根據(jù)實驗范式給予視覺刺激的同時記錄圖像。程序可以在https://github.com/Wenlab/virtual-visual-stimulus獲得。

1.3 實驗過程

實驗動物統(tǒng)一經(jīng)過饑餓處理：在實驗前一天傍晚，挑出大約20 條身體發(fā)育正常，且運動活躍的斑馬魚，轉(zhuǎn)移到干凈的斑馬魚培養(yǎng)液中，不進(jìn)行任何投喂，放在28℃培養(yǎng)箱中待用。

每次實驗前，用巴氏吸管吸取一條運動活躍的斑馬魚，放在斑馬魚活動場中，加入新鮮的實驗用水，排出活動場中的空氣，確保相機(jī)可以記錄到完整的斑馬魚自由行為圖像。

1.3.1 虛擬視覺刺激的生成

隨機(jī)運動的虛擬草履蟲由一段MATLAB code生成的20 000 幀的視頻提供。初始化一張2 000 像素×2 000像素的白色圖像作為背景，并添加隨機(jī)運動的黑色圓點作為刺激。通過觀察真實草履蟲在水中的運動情況，擬定虛擬草履蟲的運動參數(shù)。虛擬運動由隨機(jī)布朗運動和隨機(jī)方向的運動相加得到。對于一個虛擬的草履蟲，首先隨機(jī)初始化它在圖像中所處的位置、運動方向和運動速度，并逐幀生成虛擬草履蟲的運動軌跡。在這條運動軌跡上添加一些隨機(jī)性，如速度的隨機(jī)變化和運動方向的隨機(jī)偏轉(zhuǎn)等，再疊加一個布朗運動，即為一個虛擬草履蟲的最終運動軌跡。實驗中，虛擬草履蟲數(shù)量為240條，通過對比真實草履蟲在相機(jī)中的尺寸，將虛擬草履蟲直徑設(shè)置為2 pixel。

1.3.2 虛擬刺激下斑馬魚捕食實驗

在活動場上方，放置手機(jī)屏幕，通過spacedesk 軟件，將電腦屏幕內(nèi)容復(fù)制到手機(jī)的高分辨率屏幕上，調(diào)節(jié)視覺刺激窗口位置，使之正好覆蓋住斑馬魚活動場，開始實驗。實驗分為空白期I （Blank I）、訓(xùn)練期（Training）、空白期II（Blank II）、測試期（Test）4個階段（圖2）。

a. 空白期I：提供無虛擬草履蟲的空白背景，讓斑馬魚熟悉環(huán)境并進(jìn)行自由探索，持續(xù)時間1 min。

b. 訓(xùn)練期（Training）：通過屏幕提供虛擬草履蟲圖像刺激，持續(xù)時間25 min。

c. 空白期II：同空白期I，讓斑馬魚能夠休息，為Test期做準(zhǔn)備，持續(xù)時間5 min。

d. 測試期（Test）：給予斑馬魚和Training期相同的視覺刺激，持續(xù)時間10 min。

1.3.3 對照實驗

對照組刺激條件和實驗組類似，只將Training時期的虛擬草履蟲刺激改為空白背景。

1.3.4 斑馬魚捕食真實草履蟲實驗

將虛擬刺激實驗的屏幕移除，使用紅外LED燈照明。首先將斑馬魚置于黑暗環(huán)境中20 min，同時添加真實草履蟲，檢驗在黑暗環(huán)境中斑馬魚對于草履蟲的捕食情況。然后使用白光將環(huán)境照亮，使得斑馬魚可以看見草履蟲，檢驗這種情況下斑馬魚對于草履蟲的捕食情況。

1.4 斑馬魚行為分析

1.4.1 頭部信息提取

為了分析斑馬魚雙眼匯聚角度和運動距離變化，首先需要提取斑馬魚頭部關(guān)鍵位置信息。頭部信息由自主編寫的C++程序提取。主要分為背景建模、幼魚檢測、頭部和眼部關(guān)鍵點識別3部分。

a. 背景建模：圖像中幼魚所占的面積較小，且幼魚可活動區(qū)域很大，背景變化不明顯，故采用平均背景建模。取視頻前3 000幀的平均圖像作為背景，并隨分析的進(jìn)行，每10 幀更新一次背景。如果幼魚長時間不動，則不更新背景，防止幼魚被背景減除減掉。

b. 幼魚檢測：將減背景之后的圖像二值化處理后，提取所有區(qū)域的輪廓，將所有輪廓中最長輪廓判定為幼魚。若最長輪廓長度與該日齡段幼魚的平均輪廓長度差距過大，則認(rèn)為該幀檢測失敗，采用上一幀的輪廓作為幼魚，輪廓的重心為幼魚在圖像中的位置。

c.頭部關(guān)鍵點提?。菏褂没诰矸e神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵點檢測工具DeepLabCut［18-19］訓(xùn)練了一個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為關(guān)鍵點檢測器。由于整個圖像較大（896 pixel×896 pixel），檢測到幼魚重心位置后，以該點為中心，取140 pixel×140 pixel 大小的感興趣區(qū)域（ROI）作為網(wǎng)絡(luò)輸入，以降低處理所需時間。網(wǎng)絡(luò)輸出為頭部（head）和尾部（tail）的坐標(biāo)和對應(yīng)的置信度，如果置信度低于0.95，即認(rèn)為這一幀檢測失敗，使用上一幀檢測的結(jié)果（圖3a）。

d. 眼部關(guān)鍵點提?。阂灶^部坐標(biāo)為中心取50 pixel×50 pixel的ROI，為提高檢測精度，將圖像放 大 至 750 pixel×750 pixel， 作 為 第 2 個DeepLabCut神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。網(wǎng)絡(luò)輸出為4個眼部關(guān)鍵點，左眼最前方（left eye anterior，lea）、左眼最后方（left eye posterior，lep）、右眼最前方（right eye anterior，rea）、右眼最后方（right eye posterior，rep）（圖3a）。

上述檢測信息儲存在.yaml 文件中用于后續(xù)分析。斑馬魚頭部信息提取程序可以在https://github.com/Wenlab/virtual-visual-stimulus獲得。

1.4.2 雙眼匯聚界定

根據(jù)Bianco等［14］的研究成果，斑馬魚在進(jìn)行捕食時雙眼匯聚角度會從20°提高到57°，還會發(fā)生J-turn 或者類似的小幅擺尾，擺尾幅度在10°~20°之間，因此將捕食行為判定為：在雙眼匯聚的前提下，發(fā)生J-turn或者小幅擺尾行為。本研究將斑馬魚左、右眼睛前后端連線記為視線方向，分別為連接左眼最前端和最后端的左視線（left line，LL）和連接右眼最前端和最后端的右視線（right line，RL），兩線夾角為匯聚角（convergence angle，CA），匯聚角超過40°判定為匯聚，匯聚時長為匯聚角在40°及以上的時間（圖3b）。

1.4.3 疲勞性檢驗

通過比較斑馬魚Training 時期和Test 時期，單位時間內(nèi)的運動距離判斷斑馬魚疲勞與否。由于已經(jīng)通過頭部信息提取，得到斑馬魚頭部位置坐標(biāo)（hp），因此可以通過頭部位置坐標(biāo)的變化軌跡得到斑馬魚的運動距離。若Test時期，運動距離顯著變短，則認(rèn)為斑馬魚后期疲勞，否則認(rèn)為斑馬魚在整個實驗期間沒有疲勞。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

1.5.1 雙眼匯聚顯著性檢驗

在進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析時，首先使用MATLAB 軟件的rmoutliers 函數(shù)做異常值判斷，并將離群值定義為超過3倍經(jīng)過換算的中位數(shù)絕對偏差（median absolute deviation，MAD）的值，排除異常數(shù)據(jù)，然后通過秩和檢驗計算顯著性和標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.5.2 捕食行為顯著性檢驗

按照之前描述的對捕食行為界定的標(biāo)準(zhǔn)，從已經(jīng)檢測出雙眼匯聚的視頻中，篩選出發(fā)生捕食行為的游泳回合，統(tǒng)計捕食次數(shù)、所在游泳回合雙眼匯聚時長的顯著性差異，及其隨日齡的變化情況，通過秩和檢驗計算顯著性和標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié) 果

2.1 虛擬視覺刺激可以引起斑馬魚捕食行為

通過對比斑馬魚對真實草履蟲的捕食行為，發(fā)現(xiàn)斑馬魚面對虛擬刺激時可以表現(xiàn)出相同的雙眼變化和擺尾行為，虛擬刺激可以引起斑馬魚捕食行為。草履蟲和斑馬魚的相對位置的不同，捕食行為也有差異：當(dāng)草履蟲距離斑馬魚較近，位置更靠近鼻側(cè)，斑馬魚的擺尾幅度更小，反之則擺尾幅度更大。圖4展示了斑馬魚受到虛擬刺激時產(chǎn)生的捕食行為。通過統(tǒng)計不同日齡斑馬魚在發(fā)生雙眼匯聚時進(jìn)行捕食的概率，發(fā)現(xiàn)虛擬刺激誘發(fā)的斑馬魚捕食概率為22%~36%（表1）。

2.2 斑馬魚雙眼匯聚次數(shù)和時長隨時間下降

為了探究25 min 虛擬視覺刺激對于斑馬魚捕食行為的影響，對斑馬魚眼部關(guān)鍵點位置坐標(biāo)進(jìn)行提取，得到左右眼視線方向并計算雙眼匯聚角度，將雙眼匯聚角度超過40°判定為發(fā)生雙眼匯聚，統(tǒng)計了不同日齡斑馬魚在Training 時期和Test 時期平均10 min 的雙眼匯聚次數(shù)和平均匯聚時長（圖5）。

統(tǒng)計結(jié)果表明，從10 dpf 開始，斑馬魚在Test時期的匯聚次數(shù)相比Training時期顯著下降，而平均匯聚時長的顯著性下降早在8 dpf 就開始顯現(xiàn)，顯著性都不隨著斑馬魚日齡的增長而增長。

因此，在給予25 min 的移動光點虛擬視覺刺激之后，幼年斑馬魚確實可以表現(xiàn)出對于這種刺激的響應(yīng)減弱，匯聚次數(shù)的減少落后平均匯聚時長的縮短2 d。

2.3 斑馬魚捕食次數(shù)和平均匯聚時長隨時間下降

雙眼匯聚是進(jìn)行捕食的前提條件，但并不意味著捕食行為的發(fā)生。因此為了比較斑馬魚捕食行為的差異，需要將捕食行為從匯聚行為中篩選出來。本文進(jìn)行了兩種嘗試，首先參照已有的研究成果，對斑馬魚的游泳回合進(jìn)行分類，找到捕食相關(guān)的游泳回合［20］，然而該方法在本研究中并未達(dá)到文獻(xiàn)中描述的效果，因此決定將斑馬魚發(fā)生雙眼匯聚的時段從視頻中篩選出來，通過人工對比斑馬魚捕食真實和虛擬草履蟲行為相似性，篩選出發(fā)生捕食行為的游泳回合，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

圖6反映的是不同日齡斑馬魚在不同時期的捕食次數(shù)和平均匯聚時長的變化情況?？梢钥闯?，斑馬魚從8 dpf開始，相比Training時期，Test期的捕食次數(shù)和平均匯聚時長出現(xiàn)顯著性下降，捕食次數(shù)比匯聚次數(shù)提前兩天表現(xiàn)出顯著性下降。而正是從此時開始，斑馬魚捕食次數(shù)和平均雙眼匯聚時長變化時間一致。由此可知，隨著日齡的增長，斑馬魚在經(jīng)歷過25 min 虛擬視覺刺激之后，更少的可能會進(jìn)行捕食。

2.4 斑馬魚捕食行為減少由虛擬刺激引起

斑馬魚自由行為結(jié)果顯示，捕食行為不僅僅發(fā)生在面對虛擬刺激時。當(dāng)斑馬魚面前有雜質(zhì)、氣泡或者甚至在空白背景下，也會出現(xiàn)捕食行為。

為了排除斑馬魚自發(fā)行為對實驗的影響，做了黑暗環(huán)境下捕食真實草履蟲實驗。在實驗前期，活動場中只通過紅外光進(jìn)行照明，斑馬魚不具有紅外視覺，相當(dāng)于處在黑暗環(huán)境中，無法觀察到草履蟲，而斑馬魚和草履蟲可以同時被相機(jī)記錄下來，捕食行為可以被實驗人員直接觀察到。實驗后期，通過在活動場中提供額外的白光照明，草履蟲對于斑馬魚清晰可見，斑馬魚可以進(jìn)行正常捕食行為。結(jié)果顯示，無白光照明的黑暗環(huán)境中，斑馬魚沒有出現(xiàn)捕食行為，在有白光照明的環(huán)境中，斑馬魚發(fā)生捕食草履蟲的行為（圖7），由此證明虛擬刺激實驗中，空白背景下斑馬魚的捕食行為不是自發(fā)行為，而是斑馬魚對未被相機(jī)記錄的雜質(zhì)產(chǎn)生了捕食行為。

為了分析空白背景下斑馬魚捕食行為對結(jié)果的影響，設(shè)置對照實驗。將Training時期提供的虛擬草履蟲改為空白背景進(jìn)行訓(xùn)練，再比較測試期斑馬魚對虛擬刺激的響應(yīng)情況。結(jié)果如圖8 所示，25 min空白背景沒有使斑馬魚表現(xiàn)出捕食行為的下降，部分日齡的斑馬魚表現(xiàn)出捕食行為的顯著上升。

在排除了這些背景因素下發(fā)生的捕食行為之后，虛擬刺激引起的斑馬魚捕食行為結(jié)果如圖9所示?？梢钥闯?，虛擬刺激引起的斑馬魚的捕食次數(shù)和平均捕食時長都從8 dpf 開始出現(xiàn)顯著性下降。因此，斑馬魚捕食行為減少是虛擬刺激引起的。

2.5 斑馬魚捕食次數(shù)下降不是受疲勞的影響

為了排除疲勞對于實驗結(jié)果的影響，統(tǒng)計了不同時期斑馬魚的頭部運動距離，比較了相同時間內(nèi)斑馬魚運動距離差異。結(jié)果如圖10 所示，實驗組和對照組（區(qū)別在于Training時期提供虛擬草履蟲還是空白背景），Training時期和Test時期斑馬魚運動距離沒有顯著性差異，因此斑馬魚捕食行為減少與疲勞無關(guān)。

3 討 論

隨著虛擬視覺刺激在斑馬魚行為及其神經(jīng)機(jī)制研究中的應(yīng)用，該方法已經(jīng)逐漸成為研究斑馬魚視覺相關(guān)行為的重要方式。本研究通過虛擬食物刺激，引起斑馬魚的捕食行為。對于一個持續(xù)時間25 min，且沒有獎勵反饋的虛擬食物，斑馬魚會減少對其捕食，這種現(xiàn)象最早在斑馬魚8 dpf 的時候開始顯現(xiàn)，且捕食行為的減少和疲勞因素?zé)o關(guān)，是一種獎勵缺失引起的放棄。

3.1 虛擬食物刺激可以引起斑馬魚捕食行為的減少

在本實驗中，提供虛擬刺激的是一塊428 ppi的手機(jī)屏幕。由于屏幕緊貼著斑馬魚活動場，不得不考慮發(fā)熱問題。相比于其他屏幕，這種手機(jī)屏幕的發(fā)熱之小是其他商業(yè)屏幕無法比擬的。相比于投影儀，這塊屏幕提供的虛擬草履蟲分辨率更高，草履蟲圖像更加清晰，形態(tài)大小和真實草履蟲更加接近。結(jié)合Bianco等［14］在虛擬食物刺激實驗中的判定標(biāo)準(zhǔn)，同時參考斑馬魚對真實草履蟲的捕食行為，實驗中對于斑馬魚捕食行為的判定更加準(zhǔn)確。本實驗排除了斑馬魚在空白背景和面對雜質(zhì)、氣泡等產(chǎn)生的捕食行為，確保了所有被統(tǒng)計的捕食行為都是虛擬刺激引起的。同時，本實驗也探討了斑馬魚的捕食行為是否是自發(fā)行為，以及非虛擬刺激下的捕食行為對于本實驗結(jié)論可能造成的影響。結(jié)果驗證了一開始的猜想，即在空白背景下斑馬魚發(fā)生的捕食行為，是由于斑馬魚看到了一些相機(jī)無法記錄下來的物質(zhì)。而這種空白背景因素并不影響準(zhǔn)確結(jié)果的得出，虛擬視覺刺激引起的捕食行為使斑馬魚產(chǎn)生放棄。

3.2 斑馬魚的捕食行為減少是獎勵缺失引起的

之前關(guān)于放棄的研究主要聚焦于厭惡刺激或者中性刺激引起的動物行為，如電擊使狗希望擺脫被電擊的環(huán)境，適應(yīng)視動反應(yīng)（optomotor responses，OMR）環(huán)境的斑馬魚由于無法通過尾部擺動引起環(huán)境變化而放棄。但是放棄行為不僅包括上述現(xiàn)象，多次嘗試獲得獎勵而失敗，同樣可以引起斑馬魚的放棄。相比于前兩種刺激，這種刺激之所以能夠引起斑馬魚的行為，是斑馬魚因為饑餓而主動靠近食物的結(jié)果。本實驗中，虛擬的食物既不能根據(jù)斑馬魚的行為提供運動反饋，又不能真正讓斑馬魚獲得食物獎勵。因此，這是一種無法提供真實獎勵的獎勵刺激，即獎勵缺失引起的刺激。

本實驗將相同日齡的斑馬魚作為一個整體進(jìn)行分析，并沒有分析單個斑馬魚在Training 時期和Test 時期的變化情況，在這里就會產(chǎn)生一個問題：單個斑馬魚是否隨著受到刺激次數(shù)的增加，而表現(xiàn)出更少的捕食行為？行為學(xué)數(shù)據(jù)表明，斑馬魚對于虛擬刺激的捕食情況，具有明顯的個體差異。斑馬魚可能在整個實驗中都不會發(fā)生捕食行為，也可能在10 min 內(nèi)發(fā)生多達(dá)10 次捕食行為。就發(fā)生捕食行為的時間序列看，斑馬魚的捕食行為既可能在整個實驗周期均勻分布，又可能集中在5 min 之內(nèi)，其他時間基本不發(fā)生。由于實驗中提供的240個虛擬食物是隨機(jī)分布在活動場中的，平均每2 mm2即有一個虛擬食物，而斑馬魚可以注意到自身視野3 mm 范圍以內(nèi)的物體，因此理論上斑馬魚一直受到食物刺激。為了量化斑馬魚受刺激情況，比較了不同時期每10 min斑馬魚雙眼3 mm半徑內(nèi)沒有虛擬食物的時間，都在40~60 s之間且沒有顯著差異，因此認(rèn)為不同時期斑馬魚受刺激情況相同，而是否發(fā)生捕食行為則取決于斑馬魚的個體差異。Bianco等［14］的實驗結(jié)果也表明，虛擬視覺刺激引起的斑馬魚捕食行為概率為22%，因此將單個斑馬魚受到虛擬食物刺激的次數(shù)，作為評判斑馬魚是否產(chǎn)生放棄的標(biāo)準(zhǔn)，似乎并不完美。所以本實驗將相同日齡的斑馬魚作為整體進(jìn)行統(tǒng)計分析，而不區(qū)分每條斑馬魚受到刺激的次數(shù)對于其放棄的影響。

4 展 望

目前關(guān)于動物放棄行為的研究，主要從習(xí)得性無助入手，通過實驗探究并構(gòu)建相關(guān)理論，揭示背后的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制。預(yù)先物理損毀杏仁核的中縫背核（dorsal raphe nucleus，DRN）腦區(qū)的動物，在經(jīng)歷過電擊后無法出現(xiàn)逃避缺陷（逃避次數(shù)減少或反應(yīng)時間增加）［21-23］。習(xí)得性無助的動物，DRN腦區(qū)五羥色胺能神經(jīng)元基因表達(dá)水平比正常動物更高［24-26］，其無法通過激活腹內(nèi)側(cè)前額葉到DRN 腦區(qū)的谷氨酸能神經(jīng)元調(diào)節(jié)逃避行為［27］。因此最新理論認(rèn)為，學(xué)習(xí)行為激活腹內(nèi)側(cè)前額葉中的谷氨酸能神經(jīng)元，下行投射到杏仁核的DRN 腦區(qū)，抑制該區(qū)域五羥色胺能神經(jīng)元的活動，使動物在習(xí)得性無助實驗中表現(xiàn)出正常的逃避行為［28］。

以往主要通過厭惡刺激誘發(fā)的習(xí)得性無助研究動物放棄行為，集中在對于五羥色胺能神經(jīng)元的研究［23］，而多巴胺能神經(jīng)元對于厭惡刺激敏感度較低［29］，因此對于多巴胺能神經(jīng)元在獎勵刺激相關(guān)放棄行為中作用的研究較少。獎賞預(yù)測錯誤（reward prediction error）理論認(rèn)為，多巴胺能神經(jīng)元編碼動物對于獎勵的預(yù)期［30-32］。如果獎勵高于預(yù)期，則多巴胺能神經(jīng)元活動增強(qiáng)，反之，則多巴胺能神經(jīng)元活動被抑制。面對需要被動應(yīng)對的厭惡刺激和需要主動應(yīng)對的偏好刺激，伏隔核的多巴胺釋放也存在差異［33］。相信隨著虛擬食物刺激引起的捕食行為下降在斑馬魚中被發(fā)現(xiàn)，多巴胺系統(tǒng)在動物面對獎勵缺失引起放棄行為中的功能也將被更加全面地揭示，這將對全面理解動物放棄行為提供借鑒。

關(guān)于習(xí)得性無助的研究也發(fā)現(xiàn)，通過視動反應(yīng)引起的斑馬魚習(xí)得性無助行為，涉及內(nèi)側(cè)縱向束到后腦運動神經(jīng)元中的去甲腎上腺素能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用［34］。最新的自由行為斑馬魚全腦成像平臺，可以實現(xiàn)對斑馬魚實時行為追蹤和全腦鈣活動成像［35］。通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建特定神經(jīng)元表達(dá)品系，借助該平臺研究斑馬魚在經(jīng)歷25 min虛擬食物刺激前后的全腦神經(jīng)活動，可以揭示獎勵缺失引起的斑馬魚放棄行為中，不同類型神經(jīng)元的作用，從而構(gòu)建起對于不同類型神經(jīng)元在動物放棄行為中功能的全面理解。

5 結(jié) 論

本研究通過搭建自由行為斑馬魚虛擬食物刺激平臺，對斑馬魚響應(yīng)虛擬刺激的行為進(jìn)行了分析。首先驗證了本平臺可以引起斑馬魚的捕食行為。接著通過比較刺激前后斑馬魚對于虛擬食物的捕食行為變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過刺激處理的斑馬魚會表現(xiàn)出對虛擬食物匯聚次數(shù)減少、匯聚時長縮短以及捕食次數(shù)減少、捕食時長縮短的行為。接著通過黑暗環(huán)境下對真實草履蟲的捕食行為成像和空白背景對照實驗，驗證了斑馬魚的捕食行為不是自發(fā)行為，而且空白背景對斑馬魚的捕食行為的下降并不產(chǎn)生影響，從而證明了斑馬魚捕食行為的下降確實是虛擬食物刺激導(dǎo)致的。本研究構(gòu)建了獎勵缺失下斑馬魚放棄行為的研究范式，對獎勵缺失條件下斑馬魚放棄行為的深入研究提供了一種研究方式和思路。